Физиология растений, 2019, T. 66, № 5, стр. 367-374

ВВЕДЕНИЕ

Известно, что дефицит минерального питания приводит к относительной активации роста корней, что способствует оптимизации поглощения элементов минерального питания и воды [1, 2]. Вместе с тем справедливо утверждение об ингибирующем влиянии удобрений на рост корней. Поскольку увеличение доступности питательных веществ вызывает относительное подавление развития корневой системы (по сравнению с ростом надземной части растений) [3], это может быть ограничивающим фактором при их адаптации к засухе. Гетерогенное распределение питательных веществ в почве уменьшает чувствительность растений к засухе за счет более высокой скорости удлинения корней вне зоны локального внесения удобрений и их проникновения в глубину почвы [4]. Этот ростовой ответ корней приводит к увеличению способности растений извлекать воду, когда в отсутствие осадков верхние слои почвы пересыхают [5]. Показано, что разделение корневой системы одного и того же растения по отсекам с разной концентрацией питательных веществ (split-root culture) имитирует функциональную дифференциацию корневой системы, наблюдаемую при локальном размещении удобрений (часть корней, снабженная более высокой концентрацией питательных веществ, короче и сильнее ветвится) [6]. Повышенное ветвление корней в зонах с высокой концентрацией элементов минерального питания объясняется более высоким содержанием ИУК [6]. Однако в упомянутых экспериментах не изучались механизмы действия локального распределения питательных веществ на рост корня в длину. В настоящей работе основное внимание было уделено цитокининам. Роль этих гормонов в реакции на уровень минерального питания хорошо известна [7]. Однако большинство исследователей изучали роль цитокининов в передаче в побег сигналов о доступности элементов минерального питания. Соответственно содержание цитокининов чаще определяли в листьях и ксилемном соке, но не в корнях, а роль этих гормонов в регуляции роста корней изучена слабо. Кроме того, в немногочисленных работах [7], в которых определяли содержание цитокининов в корнях при изменении уровня минерального питания, не оценивался их уровень в кончиках корней.

Цель настоящего исследования – выявление особенностей связи между содержанием гормонов и ростом корней растений Triticum durum Desf. под влиянием изменения уровня и распределения элементов минерального питания в среде. Исследовали как изменения общего содержания цитокининов, так и их уровень в кончиках корней (в последнем случае использовали иммуногистохимический метод). Содержание цитокининов в кончиках корней при изменении уровня минерального питания оценивалось впервые. Такой подход важен, поскольку рост корней происходит именно в их кончиках, а оценки суммарного содержания цитокининов в корнях может быть недостаточно для выявления их роли в регуляции роста корней. Содержание ИУК и АБК в корнях также измеряли для проверки возможного влияния этих гормонов на длину корня при изменении концентрации и распределения основных элементов питания в среде.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Выращивание растений. Семена пшеницы сорта Безенчукская 139 (Triticum durum) проращивали на водопроводной воде в течение 4 суток. Для закладки опыта использовали блоки из двух сосудов с питательной средой Хогланда-Арнона I (Х-А) различной концентрации с добавлением одного и того же количества микроэлементов. Для имитации гетерогенного питания (Гет-растения) проростки с пятью развитыми зародышевыми корнями размещали на границе сосудов так, чтобы два зародышевых корня находились в питательном растворе, где концентрация макроэлементов была в 3 раза выше, чем в стандартном растворе Х-А (ВК, 300% Х-А: 15 мM KNO₃, 15 мM Ca(NO₃)₂, 3 мM KH₂PO₄, 3 мM MgSO₄, 15 мM CaSO₄), а три других корня – в растворе низкой концентрации ЭМП (НК, 1% Х-А: 0.05 мM KNO₃, 0.05 мM Ca(N0₃)₂, 0.01 мM KH₂PO₄, 0.01 мM MgSO₄, 0.05 мM CaSO₄). На гомогенной среде (Гом-растения) оба сосуда содержали питательную смесь усредненной концентрации (150% Х-А: 7.5 мM KNO₃, 7.5 мM Ca(N0₃)₂, 1.5 мM KH₂PO₄, 1.5 мM MgSO₄, 7.5 мM CaSO₄). Осмотический потенциал 300% Х-А составлял –0.186 МПа, 150% Х-А: –0.102 МПа, 1% Х-А: –0.022 МПа. Объем сосуда 1.2 л. Проростки закрепляли на стыке сосудов с помощью силиконовых трубочек с прорезями, как показано на схеме (рис. 1). Растения выращивали при освещенности 400 мкмоль/(м² с) ФАР с 14-часовым фотопериодом. Температуру воздуха днем и ночью поддерживали на уровне 26/20°C.

Рис. 1.

Схема опыта. Х-А – питательная среда Хогланда-Арнона I, Гом – растения (и корни) на гомогенном питании (150% Х-А), Гет – растения на гетерогенном питании, НК – корни на питательном растворе низкой концентрации (1% Х-А), ВК – корни на питательном растворе высокой концентрации (300% Х-А).

Для оценки возможного осмотического эффекта повышенной концентрации питательного раствора на рост корней сравнивали длину корней у растений, которые в течение 4 дней росли на 300% Х-А и 10% среде Х-А с добавлением ПЭГ-6000 до концентрации 8%, что по осмотическому потенциалу соответствует 300% Х-А (–0.19 МПа).

Также была проведена оценка влияния на длину корней добавления в питательный раствор проростков пшеницы экзогенного зеатина в концентрации 4 × 10^–7 М с параллельным измерением содержания цитокининов в корнях растений.

Осмотический потенциал питательного раствора и корней измеряли с помощью осмометра (Osmomat 030, “Gonotec”, Германия) [8].

Среднюю длину зародышевых корней измеряли через 3, 4, 5 и 6 дней, количество боковых корней – через 4 и 6 дней после разделения корневой системы; отбор проб на содержание гормонов – через 4 дня после разделения корневой системы. Для выявления примордиев боковых корней использовали окраску ацетокармином [6].

Оценка содержания фитогормонов. Содержание гормонов определяли на четвертые сутки после перенесения растений в сосуды с разделенной корневой системой. Фитогормоны экстрагировали из побегов и корней растений с помощью 80% этилового спирта. Очистку и концентрирование ИУК и АБК из аликвоты водного остатка после упаривания спиртового экстракта проводили с помощью эфирной экстракции по модифицированной схеме [9]. Из подкисленной до рН 2–3 аликвоты водного остатка ИУК и АБК дважды экстрагировали диэтиловым эфиром в соотношении 1 : 3, затем возвращали их в водную фазу (1% раствор гидрокарбоната натрия, соотношение водной и органической фазы – 1 : 2), снова подкисляли до рН 2–3 и после 2-кратной реэкстракции диэтиловым эфиром метилировали диазометаном. Образцы высушивали и перед проведением иммуноанализа растворяли в небольшом количестве 80% этанола.

Цитокинины из аликвоты водного остатка концентрировали на картридже С18 (“Waters”, США), спиртовый элюат упаривали и наносили на тонкослойную пластину для хроматографического разделения [10, 11]. Зеатин, его рибозид и нуклеотид, положение которых определяли по поглощению ультрафиолета метчиками, элюировали фосфатным буфером (pH 7.2–7.4). Количественное определение ИУК, АБК и цитокининов проводили с помощью иммуноферментного анализа с использованием специфических антител к гормонам. Антитела к зеатинрибозиду обладают перекрестной реактивностью к зеатину, а также к его нуклеотиду и по этой причине были использованы для определения и этих разновидностей цитокининов [10]. Для подтверждения надежности результатов иммуноанализа ранее проводили сравнение данных иммуноанализа с результатами физико-химических методов хромато-масс-спектрометрии [10, 11].

Для исследования брали ткани апекса основного корня длиной 5 мм от его кончика. Содержащиеся в клетках свободные основания цитокининов фиксировали смесью 4% параформальдегида и 0.1% глутарового альдегида (на фосфатном буфере рН 7.2–7.4) в течение ночи (первые 30 мин под вакуумом), отмывали от фиксатора в фосфатном буфере (рН 7.3), обезвоживали в серии возрастающей концентрации этанола и заключали в метакрилатную смолу JB-4 (“Electron Microscopy Sciences”, США). Поверхность срезов обрабатывали антителами к рибозиду зеатина, которые имели сродство и к зеатину (фиксация смесью альдегидов обеспечивала конъюгацию свободных оснований цитокининов [12]). Связавшиеся с клеточными структурами антитела выявляли с помощью вторичных антител, меченных коллоидным золотом (“Aurion”, США), и препарата “серебряного усилителя” (silver enhancer) (“Aurion”, США). За развитием окраски наблюдали в световой микроскоп (“Carl Zeiss Jena”, Германия). Специфичность связывания антител подтверждена в данных экспериментах с помощью сравнения окрашивания срезов при использовании специфической и неиммунной сыворотки, а также ранее – в экспериментах, где было зарегистрировано повышение интенсивности окрашивания при поглощении экзогенных гормонов [11, 13] и индукции экспрессии ipt-гена, контролирующего синтез цитокининов [14] (положительный контроль). О специфичности метода также свидетельствуют эксперименты, в которых ингибирование окрашивания наблюдали в результате предварительной инкубации специфических антител с раствором синтетического фитогормона [10].

Опыты повторяли многократно (с определением гормонов – 3 раза). Статистические показатели рассчитывали стандартными методами с использованием программы MS Excel. Количество повторностей при определении разных показателей было неодинаковым, поэтому их число указано в подрисуночных подписях или в тексте. На рисунках и в таблицах приведены средние значения и их стандартные ошибки.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Сравнение массы побегов растений, которые росли на фоне равномерного (Гом-растения) и гетерогенного (Гет-растения) распределения макроэлементов, не выявило существенных различий (рис. 2а). На шестой день после разделения корней их масса была достоверно больше у Гет-растений, чем у Гом-растений (рис. 2б). ВК-корни, находившиеся в 300% питательном растворе, росли медленнее, чем НК-корни, что было заметно, начиная с четвертого дня после разделения корневых прядей (рис. 3а). На шестой день в отсеке с низкой концентрацией ионов корни были значительно длиннее, чем при равномерном распределении макроэлементов (Гом-растения) (рис. 3б). Средняя длина корней Гом-растений не отличалась от длины ВК-корней (рис. 3б). Средняя длина корней у растений пшеницы, которые росли на фоне 300% Х-А, была на треть меньше по сравнению с корнями растений, росших на фоне раствора ПЭГ-6000, имеющего такой же осмотический потенциал, что и 300 Х-А (–0.19 МПа) (табл. 1). При этом содержание цитокининов на фоне ПЭГ было меньше, чем на растворе с высокой концентрацией макроэлементов.

Рис. 2.

Сырая масса побега (а) и зародышевого корня (б) растений пшеницы при гомогенном (1) и гетерогенном (2) распределении макроэлементов (n = 30). * – значения различаются при Р ≤ 0.05.

Рис. 3.

Средний суточный прирост корней (а) и длина зародышевых корней (б) растений пшеницы при гомогенном (1) и гетерогенном (2 – низкая концентрация, 3 – высокая концентрация питательного раствора) распределении макроэлементов (n = 30). * – значения различаются при Р ≤ 0.05; для значений, отмеченных разными буквами, различия достоверны при Р ≤ 0.05.

В экспериментах с разделенной корневой системой осмотический потенциал корней был как минимум в 3.7 раза (в случае ВК-корней) ниже, чем потенциал питательного раствора, что должно было обеспечить приток воды из питательного раствора (табл. 2). На четвертый день после разделения корней осмотический потенциал корней на фоне 300% Х-А был на 0.15 МПа ниже по сравнению с корнями на 1% Х-А. Таким образом, понижение осмотического потенциала 300% Х-А было скомпенсировано понижением осмотического потенциала ВК-корней по сравнению с НК-корнями.

На четвертый день, когда проводили отбор на анализ фитогормонов, различий по количеству боковых корней на зародышевый корень еще не было зарегистрировано, и сумма примордиев и боковых корней на зародышевых корнях растений разных вариантов была около 8. Количественное определение цитокининов в корнях показало более высокое содержание зеатина, его рибозида и нуклеотида в ВК-корнях по сравнению с НК-корнями (рис. 4а). По суммарному содержанию цитокининов в корнях растения, росшие на фоне равномерного распределения того же количества макроэлементов, занимали промежуточное положение между НК- и ВК-корнями. При подсчете содержания цитокининов на один боковой корень/примордий мы получили ту же тенденцию, что и при расчете на г массы корней: 0.13; 0.06 и 0.32 нг для Гом-растений (промежуточная величина), НК- (минимальное значение) и ВК-корней (максимальное значение) Гет-растений, соответственно. В побегах содержание цитокининов существенно не различалось у Гет-растений и Гом-растений как при расчете на г сырой массы (рис. 4б), так и на побег в целом (0.35 ± 0.04 и 0.33 ± 0.04 нг у Гет- и Гом-растений, соответственно). Суммарное содержание цитокининов в растениях в целом получили почти в 3 раза выше в Гет-растениях по сравнению с Гом-растениями (3.41 ± 0.48 и 1.36 ± 0.22 нг на растение, соответственно).

Рис. 4.

Содержание цитокининов (З – зеатин, ЗР – зеатинрибозид, ЗН – зеатиннуклеотид) в корнях (а) и побегах (б) растений пшеницы при гомогенном (1, 4) и гетерогенном (2 – корни на низкой, 3 – на высокой концентрации питательного раствора, 5 – побеги) распределении макроэлементов (n = 6). В рамках представлены значения содержания цитокининов (нг на 1 зародышевый корень). Для значений, отмеченных разными буквами, различия достоверны при Р ≤ 0.05.

Оценка влияния экспозиции растений пшеницы на растворе экзогенного зеатина показала повышение содержания цитокининов (суммы зеатина, его рибозида и нуклеотида) в корнях примерно в 2 раза (от 3.8 ± 0.4 до 7.1 ± 0.6 нг/г сырой массы), что сопровождалось снижением длины корней на 17%.

Концентрация как ауксинов, так и АБК была выше в ВК-корнях по сравнению с НК-корнями, в то время как на фоне гомогенного распределения ионов содержание этих гормонов было на уровне НК корней (рис. 5). В побегах не было выявлено существенных различий по содержанию АБК между Гет-растениями и Гом-растениями, в то время как содержание ауксинов было ниже у Гет-растений по сравнению с Гом-растениями (рис. 6).

Рис. 5.

Содержание ИУК (а) и АБК (б) в корнях растений пшеницы при гомогенном (1) и гетерогенном (2 – низкая концентрация, 3 – высокая концентрация питательного раствора) распределении макроэлементов (n = 6). Для значений, отмеченных разными буквами, различия достоверны при Р ≤ 0.01 по ИУК и при Р ≤ 0.05 по АБК.

Рис. 6.

Содержание ИУК (а) и АБК (б) в побегах растений пшеницы при гомогенном (1) и гетерогенном (2) распределении макроэлементов (n = 6). * – различия достоверны при Р ≤ 0.01.

Иммунолокализация цитокининов в кончиках корней, фиксированных через 5 дней после начала эксперимента, когда наблюдался быстрый прирост НК корней (рис. 3а), показала более интенсивное окрашивание на зеатин клеток в зоне деления корней, контактирующих с повышенной концентрацией макроэлементов, по сравнению с НК-корнями (рис. 7).

Рис. 7.

Иммунолокализация цитокининов в кончиках корней, фиксированных через 5 дней после разделения корневой системы растений пшеницы при гетерогенном распределении макроэлементов (1 – низкая концентрация (половинка продольного среза – слева), 2 – высокая концентрация питательного раствора (половинка продольного среза – справа), масштабная линейка 200 мкм).

ОБСУЖДЕНИЕ

Снижение осмотического потенциала 300% питательного раствора Х-А могло способствовать торможению роста корней за счет снижения доступности воды для растений. Однако корни проявляли способность к накоплению осмотически активных веществ, и даже в случае 300% раствора Х-А осмотический потенциал корней был почти в 4 раза ниже, чем у питательного раствора, что обеспечивало поглощение воды ВК-корнями [15]. Кроме того, на фоне 300% Х-А корни были короче, чем на содержащем ПЭГ-6000 растворе с тем же осмотическим потенциалом. И наконец, корни Гом-растений были относительно короткими, несмотря на то, что осмотический потенциал их питательного раствора был близок к стандартному Х-А. Таким образом, торможение роста корней в длину, зарегистрированное на 300% Х-А, нельзя объяснить только осмотическими эффектами, что позволяет предполагать участие в этом процессе регуляторных факторов, например, гормонов.

Важно было понять, какие изменения в содержании гормонов в ответ на изменение концентрации и распределения элементов минерального питания могли способствовать подавлению роста корней в длину при повышении уровня ЭМП. Ранее высказывалось предположение, что торможение роста ВК-корней связано с накоплением в них АБК [4], что соответствует данным, полученным в настоящих экспериментах. Вместе с тем, уровень АБК в корнях при гомогенном распределении ионов был таким же, как в НК-корнях (рис. 5б), в то время как корни Гом-растений были короче, чем НК-корни (рис. 3б).

Известно, что ауксины стимулируют рост боковых корней и тормозят удлинение главного корня [16]. Это свойство ауксинов позволило связать укорочение ВК-корней с более высоким содержанием в них ауксинов. Однако, как и в случае АБК, уровень ауксинов в корнях Гом-растений был таким же, как и в НК-корнях.

Более короткие ВК-корни и корни Гом-растений отличались повышенным содержанием цитокининов по сравнению с НК-корнями. С помощью иммуногистохимического подхода в наших экспериментах впервые показано, что возрастание содержания цитокининов под влиянием повышенного уровня минерального питания наблюдается именно в кончиках корней, где происходит активный рост (рис. 7). Зависимость уровня цитокининов от минерального питания хорошо известна, и неоднократно было показано повышение продукции цитокининов под влиянием, например, нитратов [7]. Разбавление питательного раствора, напротив, приводило к снижению содержания цитокининов в корнях растений пшеницы [17]. Известно, что фитогормоны цитокинины способны ингибировать рост корней: как их удлинение, так и накопление массы [18, 19]. Двукратное повышение суммарного содержания цитокининов в корнях (в результате поглощения экзогенного зеатина) ингибировало удлинение корней пшеницы и в наших экспериментах. Более высокий уровень этих гормонов наблюдали в корнях Гом-растений по сравнению с НК-корнями Гет-растений (различия между НК- и ВК-корнями были еще более значительными). Таким образом, в наших экспериментах повышенный уровень цитокининов мог способствовать торможению удлинения корней в ответ на возрастание концентрации ЭМП в среде. На фоне 300% Х-А корни были короче, чем на растворе ПЭГ-6000 с тем же осмотическим потенциалом, а при этом накопления цитокининов на фоне ПЭГ не было зарегистрировано. Эти результаты свидетельствуют о том, что замедление роста корня при высокой концентрации макроэлементов обусловлено именно накоплением цитокининов, а не пониженным осмотическим потенциалом питательного раствора.

Хотя роли цитокинов в реакции на изменение уровня минерального питания уделялось много внимания, в основном обсуждалось их значение в передаче сигналов из корней и регуляция процессов, которые происходят в побеге [7]. В работе Kiba с соавторами отмечалась возможная роль цитокининов в регуляции архитектуры корней при изменении уровня нитратов в питательной среде [20]. Вместе с тем, нет четких доказательств участия цитокининов в регуляции роста корней при изменении уровня нитратов, что указывает на значимость полученных нами результатов, свидетельствующих о связи между накоплением цитокининов в кончиках корней и скоростью их удлинения. Содержание цитокининов именно в кончиках корней при изменении уровня минерального питания оценивалось впервые. Повышение уровня цитокининов под влиянием нитратов было зарегистрировано ранее в целых корнях, а не в их кончиках [21].

Поскольку экспрессия гена AtIPT5 была выявлена в примордиях боковых корней [22], можно предполагать, что повышенный уровень цитокининов у Гет-растений является следствием усиления ветвления, зарегистрированного на фоне неравномерного распределения элементов минерального питания [6]. Однако при сборе образцов на анализ не обнаружено различий по сумме боковых корней и их примордиев. Вероятно, в корнях 4-дневных растений повышенный уровень цитокининов мог быть скорее следствием способности нитратов активировать синтез цитокининов [21, 22]. Косвенным свидетельством возможности такого объяснения является более интенсивное окрашивание на цитокинины кончиков ВК-корней по сравнению с НК-корнями (рис. 7). На повышенный уровень синтеза цитокининов в ВК-корнях указывает также большее суммарное содержание цитокининов в расчете на целые Гет-растения по сравнению с Гом-растениями.

Таким образом, наши результаты свидетельствуют о том, что уровень ЭМП сказывается на содержании гормонов в растениях Triticum durum, что может обеспечивать изменение роста и развития корневой системы. Снижение уровня АБК и ИУК в НК-корнях может способствовать активации их удлинения, а повышенный уровень цитокининов в корнях на фоне повышения уровня ЭМП – укорочению корней.

Работа выполнена при частичной поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (проект № 18-04-00460).

Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов. Настоящая статья не содержит каких-либо исследований с участием людей и животных в качестве объектов исследований.