Физиология растений, 2019, T. 66, № 5, стр. 354-359

ВВЕДЕНИЕ

Галофиты – растения, обитающие на почвах с высоким содержанием солей натрия, в процессе эволюции сформировали механизмы, эффективно поддерживающие (1) концентрации Na⁺ и Cl^– в цитоплазме на более низком уровне, чем в почвенном растворе и (2) снижающие водный потенциал в клетках до более низких значений, чем в почве. Механизмы первого типа избавляют биополимеры от токсического действия ионов [1–4], второго – обеспечивают в условиях засоления водоснабжение клеток [2–6]. Затрачивая энергию, клетки выводят поглощенные ионы Na⁺ назад в экстраклеточное пространство и осуществляют их компартментацию в вакуолях [1, 4, 5]. Благодаря накоплению ионов, в вакуолях снижается водный потенциал клетки. В цитоплазме водный потенциал снижается за счет биосинтеза осмолитов – низкомолекулярных органических соединений, обладающих по отношению к цитоплазматическим биополимерам еще и протекторным действием [7]. Стратегия поддержания ионного и водного гомеостаза у растений проявляется не только на клеточном, но и на тканевом и организменном уровнях. Избыток Na⁺ и Cl^– может быть депонирован в специализированных тканях и старых листьях [4, 5, 8], или выведен наружу через солевые железки [9], что снижает содержание этих ионов в молодых, активно метаболизирующих тканях. Примером механизма Na⁺-гомеостатирования, проявляющегося на уровне целого растения, является ксилемная разгрузка Na⁺, происходящая в базальной части корня и в местах прикрепления листьев к стеблю [10]. Благодаря такой разгрузке содержание Na⁺ снижается в листовой пластинке, что вносит вклад в защиту хлоропластов и процесса фотосинтеза от избытка этого иона. В стратегии выживания растений в условиях длительного почвенного засоления важную роль, по-видимому, играет размер депо для ионов Na⁺, Cl^– и воды. В соответствии с этим, проведенные нами ранее на С₃- и С₄-галофитах исследования показали, что чувствительность фотосинтетической функции к почвенному засолению тем ниже, чем выше степень суккулентности листьев. При засолении изменяется соотношение между фототрофными и водоносными тканями в пользу последних [11], а вакуоли клеток ассимилирующих тканей увеличиваются в объеме [12].

Как было показано А.Т. Мокроносовым с сотрудниками [13, c. 48–52], ряд морфометрических параметров хлоропластов коррелирует друг с другом, а также со скоростью фотосинтеза. В частности, положительная корреляция была установлена между содержанием хлорофилла в листе (мг/дм²) и его содержанием в единичном хлоропласте, а также с числом хлоропластов, рассчитанным на единицу площади листа. Скорость фотосинтеза (мг CO₂/(дм² час)) обнаружила положительную корреляцию с содержанием хлорофилла в единичном хлоропласте, числом хлоропластов на единицу площади листа и индексом поверхности хлоропласта. По данным Цельникер [14], скорость фотосинтеза находится в положительных коррелятивных отношениях с такими параметрами мезоструктуры листа как сухая масса, рассчитанная на единицу поверхности листа, число хлоропластов на единицу поверхности, суммарная поверхность хлоропластов, внутренняя поверхность листа и толщина листа. Растения одного и того же вида (сорта) и одного возраста, выращенные в одинаковых условиях, характеризуются приблизительно одинаковыми морфометрическими параметрами хлоропластов и мезоструктуры фотосинтетических тканей, а также одинаковыми скоростями фотосинтеза и одинаковой активностью фотосинтетических ферментов. В стрессовых условиях происходят нарушения фотосинтетической функции, которые сопровождаются изменениями морфометрических параметров хлоропластов и структуры фотосинтетических тканей. Формирование фотосинтетического аппарата с одной стороны обнаруживает стабильность и четкое проявление генотипа, с другой стороны – специфически реагирует на экологические факторы [13, c. 84–92]. Следует отметить, что изменение функции и структуры хлоропластов в ответ на действие стрессового фактора может отражать как активирование защитных процессов, так и быть следствием вызванных этим фактором повреждений.

Исходя из вышесказанного предположили, что морфометрические параметры фотосинтетического аппарата и мезоструктуры листа могут быть использованы для оценки амплитуды напряженности того или иного стрессового фактора, в которой растение поддерживает гомеостаз в условиях действия данного фактора и отвечает на стрессовое воздействие в пределах нормы реакции организма. Задача настоящей работы состояла в изучении реакции фотосинтетического аппарата растений галофитов на засоление путем измерения морфометрических параметров хлоропластов галофитов, выращенных при разных уровнях почвенного засоления и обладающих разной устойчивостью к засолению.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Объектом исследования служили электронно-микроскопические образцы хлоропластов листьев различающихся по солеустойчивости галофитов. Climacoptera aralocaspica L. (климакоптера аралокаспийская), Salicornia europaea L. (солерос европейский) и Suaeda arcuata (Bange) L. (сведа дуголистная) представляют собой высоко солеустойчивые галофиты, тогда как Kochia prostrata (Shrad.) L. (кохия распростертая) и Kochia scoparia L. (кохия веничная) являются относительно менее устойчивыми к засолению галофитами [11].

Растительный материал был получен в описанной ранее экспериментальной модели почвенного солевого стресса [11]. Растения выращивали в течение 2.5 месяцев (апрель–июнь) в оранжерее на свету (12 клк) с дополнительной подсветкой ртутными лампами высокого давления ДРЛ-1000 (СССР). Общая освещенность составляла 25–30 клк. Растения выращивали в сосудах, содержащих 4.5 кг серо-подзолистой почвенно-песчаной смеси (3 : 1 v/v) (далее почва). Через месяц после прорастания растения прореживали до плотности посадки 5 растений на сосуд. Температурный режим – 25/18°С (день/ночь). Растения поливали смесью солей NaCl и Na₂SO₄ (весовое отношение 2 : 1) порциями (50 ммоль Na⁺ на дм³ почвы с расчетом достижения конечной концентрации Na⁺, указанной в тексте, в таблицах и на рисунках. Контрольные растения поливали водопроводной водой.

Для электронно-микроскопических исследований образцы ткани листа подготавливали в соответствии со стандартной методикой [11]. Для каждого варианта засоления каждого вида исследовали 3–5 растений. Для этого в первой половине дня (с 10 до 12 часов) отбирали листья среднего яруса, фрагменты из средней части листовой пластины фиксировали 2.5% глутаровым альдегидом с последующей дофиксацией 1% OsО₄ и заключением в эпоксидную смолу Эпон-812 после обезвоживания в растворах спиртов и ацетоне. Поперечные и продольные ультратонкие срезы получали на ультрамикротоме LKB-4801 (“LKB”, Швеция). Срезы контрастировали в растворах уранилацетата и цитрата свинца и просматривали в электронном микроскопе JEM-100B (“Jeol”, Япония). Анализировали не менее 3 микрофотографий с каждого листа, так что общее число повторностей для измерения размеров хлоропластов и численной плотности включений было не менее 15 для каждого варианта вида. Объем и структурные параметры хлоропластов определяли с использованием проекционного метода [15] и с применением автоматизированной системы анализа изображений Siams Mesoplant (SIAMS, Екатеринбург, Россия) [16]. Линейные размеры пластоглобул измеряли в количестве повторностей от 50 до 100 на каждый вариант для данного вида. Доли включений крахмала и пластоглобул определяли по отношению площади включений к площади стромы хлоропласта. Значимость различий между вариантами оценивали с помощью Тьюки HSD-теста в программе Statistica 6.0. В таблицах и на рисунках приведены средние значения и стандартные ошибки среднего.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Ранее для высоко солеустойчивых галофитов C. aralocaspica, S. europaea и S. arcuata была продемонстрирована ассимиляционная активность вплоть до уровня почвенного засоления в 1000 ммоль/дм³ Na⁺. В случае же умеренных галофитов K. prostrata и K. scoparia предел фотосинтетической активности соответствовал засолению почвы в 600 ммоль/дм³. При этом в обеих группах галофитов с ростом уровня засоления наблюдалось усиление признака суккулентности [11]. Такой ответ на засоление предполагал, что вплоть до указанных концентрационных пределов солей все исследовавшиеся растения-галофиты остаются способными поддерживать ионный и водный гомеостаз цитоплазмы и, соответственно, создавать благоприятные условия для функционирования хлоропластов. Вместе с тем, наличие механизмов ионного и водного гомеостатирования, проявляющихся на клеточном и надклеточном уровнях, не исключает участия самих хлоропластов в ответе растений на почвенное засоление [17, с. 277]. Более того, активирование этих механизмов в стрессовых условиях предполагает повышенный запрос на продукты фотосинтеза, в частности АТФ и ассимиляты. Если же концентрации ионов в почве выходят за пределы нормы реакции растения, то изменения в структуре и в функциях хлоропластов должны отражать также повреждающие эффекты солей.

В качестве показателей структурной и функциональной перестройки хлоропластов, вызванной засолением, были выбраны изменения линейных размеров хлоропластов (длин большой и малой осей) [18, 19], а также размеров, числа и плотности крахмальных гранул и пластоглобул в строме. Изменение доли объема стромального компартмента, занятого крахмальными гранулами, можно рассматривать как показатель изменения соотношения биосинтетической и экспортной функций хлоропластов, т.е. соотношения между скоростями фотосинтеза и потребления ассимилятов (source/sink) [13, с. 143–146]. Накопление пластоглобул в строме отражает процесс деградации фотосинтетических мембран. Доля объема стромального компартмента, занятого пластоглобулами, может служить маркером индивидуального возраста хлоропласта и степени его старения [20]. Потенциальное увеличение этой доли может свидетельствовать об усилении индуцированного стрессом старения хлоропластов и, как следствие, о частичной или полной утрате ими функции.

Ранее было показано, что выращивание высоко солеустойчивых галофитов C. aralocaspica, S. europaea и S. arcuata в условиях почвенного засоления вплоть до 1000 ммоль/дм³ Na⁺ не приводит к полному подавлению фотосинтетической функции. У всех высоко солеустойчивых видов было отмечено постоянство содержания хлорофилла в листьях [11]. В данном исследовании не было обнаружено статистически достоверных различий в размерах большой и малой осей хлоропластов, а также в их соотношении во всем диапазоне засоления от 0 до 1000 ммоль/дм³ (рис. 1). Для умеренно солеустойчивых галофитов K. prostrata и K. scoparia ранее было показано, что более чем 20% от максимальных значений снижение фотосинтеза и содержания хлорофилла (a + b) происходит только, начиная с 400 ммоль/дм³ Na⁺. При этом соотношение хлорофиллов а и b остается таким же, как в контроле [11]. Результаты морфометрических измерений, выполненные нами, показывают, что умеренные галофиты сохраняют постоянство размеров хлоропластов во всем диапазоне засоления вплоть до 600 ммоль/дм³ (рис. 2).

Рис. 1.

Морфометрические параметры хлоропластов листьев группы высоко солеустойчивых галофитов – Climacoptera aralocaspica L. (а), Salicornia europea L. (б), Suaeda arcuata (Bange.) L. (в), выращенных при разных уровнях засоления почвы. 1 – длина большой оси хлоропласта, 2 – длина малой оси хлоропласта, 3 – отношение длины большой оси к малой оси хлоропласта. Достоверные отличия количественных показателей отмечены разными латинскими буквами.

Рис. 2.

Морфометрические параметры хлоропластов листьев растений умеренных галофитов – Kochia prostrata (Schrad.) L. (a), Kochia scoparia L. (б). 1 – длина большой оси хлоропласта, 2 – длина малой оси хлоропласта, 3 – отношение длины большой оси к малой оси хлоропласта. Достоверные отличия количественных показателей отмечены разными латинскими буквами.

Для большинства обследованных галофитов, как предельно, так и умеренно устойчивых к засолению, крахмальные включения занимали относительно небольшую (около 3–5%) долю площади стромального компартмента при разных уровнях почвенного засоления (табл. 1). Такое относительно небольшое содержание крахмальных включений в строме может указывать на стабильное отношение потоков (синтез + реассимиляция)/экспорт продуктов фотосинтеза. Аналогичный результат (4–9%) получен и в отношении доли стромального компартмента, занятого пластоглобулами (табл. 2). Этот результат свидетельствует в пользу постоянства среднего индивидуального возраста хлоропластов в клетках мезофилла листьев [20], при уровне почвенного засоления в пределах физиологической нормы реакции растения на стресс.

Таким образом, полученные данные показывают, что морфометрические параметры хлоропластов мезофилла листьев двух различающихся по устойчивости групп галофитов сохраняются и поддерживаются на постоянном уровне практически во всем диапазоне поддержания функциональной активности фотосинтеза листа. В этом диапазоне растения-галофиты демонстрируют ответ в пределах нормы реакции организма и не обнаруживают повреждающих эффектов засоления на хлоропласт. Это означает, что, обеспечивая энергией и ассимилятами процессы ионного и водного гомеостатирования, реализуемые на клеточном и надклеточном уровнях, хлоропласты на субклеточном уровне вносят свой вклад в устойчивость растений-галофитов к почвенному засолению.

Исследования Ивановой Л.А. и Ронжиной Д.А. выполнены в рамках проекта № АААА-А17-117072810011-1, поддержанного Российским федеральным бюджетом.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов. Настоящая статья не содержит каких-либо исследований с участием людей и животных в качестве объектов исследований.