Физиология растений, 2020, T. 67, № 2, стр. 149-156

ВВЕДЕНИЕ

Исследования механизмов устойчивости растений к действию гипотермии, являющейся одной из фундаментальных проблем физиологии растений, становятся все более актуальными в связи с глобальными изменениями климата и вопросом продовольственной безопасности постоянно возрастающей численности населения Земли.

Среди трех основных групп растений (морозостойкие, холодостойкие, теплолюбивые), различающихся по степени устойчивости к низкой температуре и льдообразованию, остаются наименее изученными механизмы закаливания и устойчивости к гипотермии холодостойких растений [1–3]. Известно, что относящиеся к этой группе растения, в отличие от теплолюбивых, выживают после действия любых низких положительных температур, а в переохлажденном состоянии даже после заморозков. От морозостойких растений они отличаются отсутствием свойств устойчивости к образующемуся при отрицательных температурах льду.

В связи с этими особенностями механизмов устойчивости и повреждения следует предположить, что закаливание холодостойких растений к гипотермии должно быть направлено, главным образом, на сохранение структурно-функционального состояния клеток в течение длительного пребывания при низких положительных температурах и в условиях заморозка до начала процесса льдообразования в растениях.

Наиболее уязвимой к действию гипотермии в клетке является мембранная система, изменение структуры которой приводит к нарушению ее функций и в итоге к необратимым повреждениям и гибели растений. Как известно, одной из важнейших причин повреждения мембран при снижении температуры рассматривается фазовый переход мембранных липидов из жидкокристаллического состояния в твердый гель, что приводит к потере их текучести. В результате, с одной стороны, повышается проницаемость мембран для ионов, а с другой – увеличивается энергия активации ферментов, связанных с мембраной. Скорость реакций, катализируемых мембранными ферментами, снижается после фазового перехода быстрее, чем скорость реакций, связанных с растворимыми энзимами. Все это приводит к неблагоприятным сдвигам в обмене веществ, резкому возрастанию количества эндогенных токсинов [4]. Часто повреждения структуры мембран и ее липидных компонентов связывают с активацией под действием гипотермии свободно-радикальных процессов и образованием АФК, которые атакуют полиненасыщенные жирные кислоты (ПНЖК), что сопровождается повышением содержания продуктов перекисного окисления липидов (ПОЛ). Исходя из этих предположений, сначала нами было изучено продолжительное действие низких закаливающих температур на процессы окислительного стресса (ОС) картофеля, являющегося типичным представителем холодостойких растений. Полученные данные [5, 6] показали, что, в отличие от теплолюбивых растений, у картофеля при длительной гипотермии, не сопровождающейся образованием льда, не происходит существенного накопления АФК и активации процессов ПОЛ, т.е. мембраны этих растений, в том числе мембраны хлоропластов и митохондрий, которые являются основными продуцентами АФК при нарушении их функциональной активности, достаточно устойчивы к ОС.

Поскольку адаптивная способность растений к гипотермии зависит от того, насколько долго они могут сохранять жидкостное состояние мембран и предотвращать фазовый переход липидов в бислое, у них выработался механизм снижения температуры фазового перехода за счет увеличения доли ПНЖК. Повышение их содержания осуществляют ферменты дегидрогеназного типа – десатуразы ЖК, катализирующие образование двойных (олефиновых) связей в ацильных цепях ЖК [7]. Известно, что мембранные липиды растений, выращенных при пониженной температуре, характеризуются, как правило, повышенным содержанием ПНЖК, т.е. величина индекса ненасыщенности (ИН) ЖК находится в обратной зависимости от снижения температуры [8]. Однако уровень ИН ЖК мембранных липидов при гипотермии определяется не только температурой, но и генотипом растений, в том числе экспрессией генов десатураз и их активностью в условиях гипотермии. В нашей предыдущей работе [9] это было подтверждено на трансформированных растениях картофеля с введенным геном desA Δ12-ацил-липидной десатуразы цианобактерий, характеризующихся увеличенной долей ПНЖК в мембранных липидах (в особенности линолевой (С_18:2) и линоленовой (С_18:3) кислот), а также повышенным ИН и содержанием общего количества ЖК. Такие изменения в липидном бислое мембран сопровождались снижением интенсивности процессов ОС и ПОЛ в клетках вегетирующих растений (незакаленных) после действия повреждающей, но не вызывающей льдообразования температуры, а также повышением конститутивной устойчивости вегетирующих растений к гипотермии. При этом почти неизученным оставался вопрос об изменении липидного метаболизма при формировании устойчивости холодостойких растений в условиях длительного низкотемпературного закаливания и об участии в этом процессе Δ12‑ацил-липидной десатуразы, осуществляющей образование второй двойной связи в ацильных цепях ЖК и являющейся критическим ферментом, необходимым для выживания цианобактерий [10], и, возможно, растений, при низких температурах. Корреляцию между активностью десатураз и устойчивостью к холоду у растений наблюдали при использовании мутантов с “выключенными” генами десатураз (FAD – fatty acid desaturase) [11]. Так, проростки A. thaliana с выключенным геном FAD2, неспособные к синтезу диеновых ЖК в ЭПР при холодовой экспозиции (6°С в течение 42 дней), которая не является повреждающей для исходного экотипа, погибали. Мутант A. thaliana по гену FAD6 с неактивной хлоропластной Δ12‑десатуразой накапливал высокие концентрации пальмитолеиновой (С_16:1) и олеиновой (С_18:1) кислот. При этом сокращалось содержание диеновых и триеновых ЖК в галактолипидах хлоропластов и наблюдалось снижение устойчивости к низкой температуре.

В связи с этим, цель настоящей работы состояла в изучении изменений в содержании отдельных видов ЖК в мембранных липидах холодостойких растений (на примере картофеля) в процессе их закаливания при низкой температуре, приводящей к повышению устойчивости к действию заморозков, а также в выявлении роли Δ12-ацил-липидной десатуразы в этих процессах. В частности, с использованием трансформированных растений, отличающихся повышенным конститутивным содержанием ПНЖК, выясняли, происходят ли у них во время закаливания дополнительные изменения в составе и содержании ЖК мембранных липидов, степени их ненасыщенности и, как следствие, устойчивости к гипотермии.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Объектами исследования служили нетрансформированные растения (контроль) типичного представителя группы холодостойких растений – картофеля клубненосного (Solanum tuberosum L., cорт Десница) и трансформированные конструкцией, несущей ген desA Δ12-ацил-липидной десатуразы цианобактерии Synechocystis sp. РСС 6803, мембраны которой, согласно ранее полученным данным, были обогащены липидами с повышенным содержанием ПНЖК [9, 12]. В данной конструкции последовательность гена десатуразы была трансляционно слита с последовательностью репортерного гена licBM3, кодирующего термостабильную лихеназу (далее desA-licBM3 растения). Наличие и экспрессия введенного гена desA ∆12‑ацил-липидной десатуразы в desA-licBM3 растениях были подтверждены методом ПЦР, в том числе с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР), т.е. по образованию матричной РНК [12].

Растения выращивали в течение 8 нед. на минеральной среде “перлит” с периодической подкормкой минеральным удобрением “Кемира-Люкс” при температуре 22°С и 16-часовом фотопериоде с освещенностью 100 мкмоль квантов/(м² с). Закаливание проводили при температуре 5°С в течение 6 сут, согласно нашим предыдущим работам [6]. Изменения в устойчивости растений картофеля после закаливания определяли, воздействуя на них повреждающей температурой –3°С в течение 18 ч, а также регистрировали измерения электропроводности экстракта из клеток листьев [13]. Устойчивость оценивали по величине обратной максимальному выходу электролитов, по формуле:

где где Н – устойчивость, E_L – максимальный выход электролитов, E_L (%) = 100(E_охл – Е_исх)/(Е_кип – Е_исх), L_исх – выход электролитов до воздействия, L_охл – выход электролитов после охлаждения, L_кип – выход электролитов после кипячения, соответственно.

Определение качественного состава и абсолютного содержания ЖК общих липидов проводили методом ГЖХ их метиловых эфиров (МЭЖК) [14, 15]. С целью получения последних к листьям (5 г) добавляли 50 мл изопропанола, 0.5 мл 0.001% изопропанольного раствора ионола в качестве антиоксиданта, а также 4 мл изопропанольного раствора маргариновой кислоты (С_17:0, 98 мкг/мл) в качестве внутреннего стандарта. Смесь гомогенизировали, добавляли в нее 2 г КОН и омыляли в течение 60 мин при температуре кипения. Спирт отгоняли и замещали водой; неомыляемые компоненты препарата отделяли гексаном. Оставшийся водно-щелочной раствор нейтрализовали до рН 2 20% раствором серной кислоты. Образовавшиеся свободные ЖК экстрагировали гексаном. Метилирование ЖК проводили путем их каталитической этерификации при температуре кипения в смеси 10 мл CH₃OH и 0.5 мл CH₃COCl в течение 1 ч, как описано ранее [9]. Полученные МЭЖК очищали с помощью ТСХ на пластинке с силикагелем, в качестве растворителя применяя смесь: гексан : эфир : уксусная кислота в соотношении 90 : 10 : 1, экстрагировали бензолом и анализировали методом ГЖХ-МС на приборе Aligent 7890A GC (США). Массивы данных площадей индивидуальных видов МЭЖК были обработаны с помощью пакета программ Excel.

Для оценки ненасыщенности ЖК в липидах использовали индекс ненасыщенности:

где P_i –содержание i-той ЖК (%), e_i – число двойных (олефиновых) связей в i-той ЖК [4]. Расчетная активность ацил-липидных ∆9-, ∆12- и ω3-десатураз, катализирующих введение двойных связей в алифатические углеродные цепи олеиновой (С_18:1), линолевой (С_18:2) и линоленовой (С_18:3) кислот ЖК, определялась как стеароил(SDR)-, олеоил(ODR)- и линолеоил(LDR)-десатуразные отношения, рассчитанные на основании содержания отдельных компонентов суммы С₁₈-ЖК [16]: где С_18:0, С_18:1, С_18:2 и С_18:3 – процентное от суммы ЖК содержание стеариновой, олеиновой, линолевой и линоленовой кислот, соответственно.

Статистическую обработку результатов проводили с использованием критерия Стьюдента. Обсуждаются различия между экспериментальными данными, достоверно значимые при Р ≤ 0.05. Результаты в таблицах (кроме табл. 3) представлены как средние арифметические значения опыта из трех биологических и аналитических повторностей и их стандартные ошибки.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Известно, что устойчивость растений к гипотермии формируется в процессе длительного закаливания при низких (но не повреждающих) температурах [2] и обусловливается структурно-функциональной перестройкой клеток, связанной с изменениями на молекулярном уровне, в зависимости от генотипа растений. Поэтому, прежде чем приступить к решению поставленных в работе задач, необходимо было убедиться, что закаливание используемых нами растений картофеля при 5°С в течение 6 сут приводило к повышению их устойчивости к продолжительному действию заморозков. Для этого нами был применен метод прямого промораживания незакаленных и закаленных растений обоих генотипов с последующим измерением выхода электролитов из клеток после повреждающего (но не губительного) действия отрицательной температуры, что позволяет оценить степень их повреждения, которая является величиной, обратной выходу электролитов. Температуры с разной длительностью воздействия подбирали в диапазоне от 0 до –3°С.

Как видно из таблицы 1, при действии температуры 0°С в течение 24 ч, ни у контрольных, ни у desA-licBM3 растений как в незакаленном, так и в закаленном состоянии различий в выходе электролитов из клеток не выявлено. Снижение температуры до –2°С сопровождалось заметным повышением выхода электролитов из листьев незакаленных как контрольных, так и desA-licBM3 растений (~80%), но после закаливания оба генотипа выживали практически во всех вариантах опыта, выход электролитов из их тканей составлял от 10 до 30%. Это свидетельствует об отсутствии существенных повреждений мембран, и, что очень важно, указывает на способность растений картофеля повышать устойчивость к заморозкам в условиях низкотемпературного закаливания. Для получения более значимых различий между закаленными и незакаленными растениями обоих генотипов было применено более жесткое воздействие температурой (–3°С, 24 ч), которое привело к их замерзанию и практически полному выходу электролитов (выше 90%) из растений всех вариантов опыта и, как следствие, к их гибели, в связи с чем время воздействия температуры –3°С было снижено до 18 ч. Эта экспозиция вызывала гибель обоих генотипов картофеля в незакаленном состоянии, у которых был обнаружен более чем 75% выход электролитов, однако закаленные растения повреждались лишь частично. Так, выход электролитов из тканей закаленных трансформированных растений составил 45%, что свидетельствует о меньшем повреждении их мембран, по сравнению с закаленными контрольными растениями, у которых выход электролитов достигал 60%. По-видимому, трансформированные растения обладали способностью оставаться во время заморозка в переохлажденном состоянии более длительное время. Таким образом, именно воздействие температурой –3°С в течение 18 ч было наиболее подходящим при оценке устойчивости к заморозкам закаленных растений картофеля обоих генотипов. Следует отметить, что контрольные растения картофеля в процессе закаливания также повышали устойчивость к заморозку (–2°С), который они выдерживали практически без повреждений в течение суток, тогда как контрольные растения в незакаленном состоянии полностью погибали после такой температурной экспозиции (рис. 1).

В связи с этим, как у контрольных, так и у трансформированных растений картофеля был изучен качественный состав и абсолютное содержание этерифицированных ЖК клеток в процессе низкотемпературного закаливания.

Как видно из табл. 2, вегетирующие растения картофеля, экспрессирующие ген цианобактериальной ∆12-ацил-липидной десатуразы, уже до закаливания имели большее, по сравнению с контролем, количество мембранных липидов с преимущественным содержанием ПНЖК в их составе. Трансформация приводила к увеличению абсолютного содержания мембранных липидов примерно на 20%, с преобладанием в их составе линолевой (C_18:2) и линоленовой (C_18:3) кислот. Содержание моноеновых (С_16:1 и C_18:1) кислот у трансформантов также было выше, чем в контроле, на 30 и 45%, соответственно. По-видимому, трансформированные растения имели дополнительный субстрат в виде олеиновой кислоты для образования С_18:2 линолевой кислоты за счет увеличения активности собственных ∆9-десатураз картофеля, превращающих C_18:0 стеарат в C_18:1 олеат.

Как показано в таблице 2, в процессе закаливания в листьях контрольных растений происходило повышение содержания общей суммы ЖК почти на 25%. Эти изменения включали увеличение содержания как насыщенных (~ на 10%), так и ненасыщенных ЖК (~ на 30%), в том числе за счет одинакового повышения доли С_18:2 линолевой и С_18:3 линоленовой кислот ЖК примерно на 30%. В результате такого повышения, концентрация этих двух ЖК составила почти 70% от общей суммы ЖК с преимущественным содержанием С_18:3 линоленовой кислоты. Изменение соотношения насыщенных и ненасыщенных ЖК при действии холода и роль ПНЖК в формировании устойчивости в процессе закаливания морозостойких растений были неоднократно описаны в литературе. Так, в листьях различных генотипов пшеницы в условиях холодового закаливания при 4°С снижалось содержание насыщенных С_16:0 и С_18:0 ЖК, тогда как содержание ненасыщенных С_18:2 и С_18:3 линолевой и линоленовой ЖК возрастало [17].

На основании полученных нами данных были рассчитаны индексы активности Δ9-, Δ12- и Δ15(ω3)-десатураз, участвующих в образовании С_18:1, С_18:2, С_18:3 кислот, соответственно. Так, у контрольных растений картофеля во время закаливания (табл. 3) выявлено существенное увеличение активности ∆9-десатураз (SDR повысился с 0.45 до 0.65). Это подтверждается данными литературы, согласно которым при низкотемпературном закаливании у холодостойких растений A. thaliana [18, 19] происходила индукция гена ADS Δ9-ацил-липидной десатуразы. Согласно нашим данным и данным литературы, повышение активности Δ9-десатураз, по-видимому, объясняется необходимостью образования первой двойной связи для обеспечения субстратами последующих десатураз. Что же касается рассчитанных нами активностей ∆12- и Δ15(ω)-десатураз во время закаливания картофеля, то они оставались практически без изменений, хотя в литературе имеются данные об увеличении уровня экспрессии гена FAD6 ∆12-десатуразы хлоропластной локализации, участвующей в образовании С_18:2 линолевой кислоты в первые часы холодового закаливания картофеля [20].

Таким образом, согласно полученным нами результатам, мембраны клеток листьев картофеля в процессе закаливания обогащаются ЖК, в том числе и ПНЖК, что согласуется с данными по повышению устойчивости этих растений к заморозкам (табл. 1) и окислительному стрессу [6]. В работе Лавровой с соавт. [16] при закаливании картофеля в условиях длительного действия низкой температуры также показано увеличение ненасыщенности ЖК липидов за счет диеновых и триеновых ЖК, а при кратковременном действии холода наблюдалось повышение только триеновых ЖК и, соответственно активности ω3-десатураз. У проростков морозостойкой пшеницы в результате закаливания на свету наблюдалось преимущественное повышение содержания линоленовой ЖК [21], что свидетельствует о ее важной роли в формировании устойчивости растений к морозу.

Рассматривая изменения в качественном составе и абсолютном содержании индивидуальных видов этерифицированных ЖК общих липидов при закаливании трансформированных растений, особенно важно отметить, что уже до закаливания они были обогащены липидами в такой же степени, как контрольные растения после закаливания. Их расчетный индекс активности ∆9-десатураз (табл. 3) был выше, по сравнению с незакаленным контролем (0.60 и 0.48, соответственно). Кроме того, в соответствии с более высоким общим содержанием ЖК мембранных липидов, трансформанты к началу закаливания обладали большим числом тилакоидов [22], чем контрольные растения (у контрольных растений – 86, а у трансформантов – 154). Такое количество тилакоидов у контрольных растений наблюдали только после закаливания. Следовательно, состав и содержание ЖК липидов мембран контрольных и трансформированных растений к началу закаливания существенно различался, что в значительной степени определило дальнейший ход процессов закаливания трансформантов при низкой температуре [9]. При этом, совместное влияние трансформации и действия закаливающих температур на состав и содержание ЖК мембранных липидов ранее практически не изучалось.

Поскольку трансформанты к началу закаливания обладали более высоким содержанием ЖК, в процессе их закаливания повышение общей суммы ЖК происходило в меньшей степени, по сравнению с контролем. Если у контрольных растений во время закаливания накапливались как насыщенные, так и ПНЖК, то у трансформантов содержание насыщенных ЖК даже несколько снижалось, а повышалось лишь содержание ПНЖК. Так, количество С_18:2 линолевой кислоты у трансформанта возрастало на 10%, гексадекатриеновой (С_16:3) кислоты – на 80% (то есть в 2 раза больше, чем в контроле). Повышение содержания С_16:3 гексадекатриеновой кислоты, вероятно, происходило в результате активации низкой температурой собственных ω3-десатураз картофеля. Из литературных данных известно, что у трансформированного томата при сверхэкспрессии генов десатураз FAD3 и FAD7, которые катализируют превращение линолевой в линоленовую кислоту, изменялся ЖК-состав общих липидов, что сопровождалось повышением устойчивости к охлаждению. Авторы предполагают существование отдельного пула С_18:3 линоленовой кислоты для обеспечения выживания растений в неблагоприятных условиях [21, 23]. В работе De Palma [24] картофель Solanum tuberosum, который трансформировали ∆9-десатуразой устойчивого к холоду S. commersonii, после закаливания также проявлял более высокую устойчивость к низкой температуре. Эти литературные данные указывают на то, что дополнительная десатурация ЖК (повышение активности ∆9- и ∆15(ω3)-десатураз) мембранных липидов приводит к увеличению уровня устойчивости растений к холоду.

Как было упомянуто ранее, в образовании диеновых ЖК у растений участвуют ∆12-десатуразы FAD6 в хлоропластах и семейство ∆12-десатураз FAD2 в ЭПР, однако необходимо подчеркнуть, что они изучались, в основном, у теплолюбивых растений [25]. Тогда как при выращивании холодостойких растений арабидопсиса при низких температурах, по сравнению с контролем, не было обнаружено значительных различий в уровнях экспрессии генов FAD2 и FAD6 [26]. Однако позже было показано, что мутанты арабидопсиса по гену FAD6 отличались высоким содержанием мононенасыщенных ЖК и пониженным содержанием ПНЖК в мембранных липидах [11] и были более чувствительны к низкотемпературным повреждениям по сравнению с растениями дикого типа. Это подтверждается и в работах других авторов [27], где показано, что мутанты арабидопсиса при “выключении” гена FAD2 были неспособны регулировать текучесть плазмалеммы при смене циклов тепло/холод (12 ч 27°С/12 ч 12°С), по сравнению с проростками дикого типа.

Таким образом, на основании полученных нами данных можно сделать заключение, что в процессе низкотемпературного закаливания в листьях контрольных растений картофеля происходит накопление cуммы ЖК мембранных липидов примерно на 25% преимущественно за счет накопления ПНЖК. По-видимому, это происходит за счет активации закаливающей температурой липидного метаболизма в целом, и, в частности, ферментов-десатураз, что приводит к более стабильному функционированию мембранных структур клетки и предотвращению частичного сброса электронов на кислород с образованием АФК [5, 6]. Следует отметить, что мембраны, богатые ПНЖК, в последнее время рассматриваются в качестве супрамолекулярных антиоксидантов. Их окисление может служить механизмом защиты от АФК других, более важных макромолекул [28].

Трансформанты, еще до закаливания обогащенные ПНЖК в такой же степени как закаленные контрольные растения, в процессе закаливания продолжали повышать содержание ненасыщенных С_18:2 линолевой и С_16:3 ЖК гексадекатриеновой кислот. Это, по-видимому, обеспечивало им более благоприятное прохождение процессов закаливания. Так, согласно полученным нами ранее данным трансформанты отличались более интенсивным синтезом сахаров в начале закаливания [21], низким уровнем Н₂О₂ и МДА, повышенной активностью антиоксидантных ферментов супероксиддисмутазы и каталазы [5], что в итоге привело к повышению их устойчивости к более продолжительному действию заморозков. Это свидетельствует о важной роли ∆12 ацил-липидной десатуразы при закаливании растений к низкой температуре.

Авторы выражают благодарность А.М. Носову и И.В. Голденковой-Павловой (Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева) за предоставленный для исследования материал.

Работа поддержана Российским фондом фундаментальных исследований (проект 16-34-00604 мол_а).

Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов. Настоящая статья не содержит каких-либо исследований с участием людей и животных в качестве объектов исследований.