Физиология растений, 2020, T. 67, № 3, стр. 298-311

ВВЕДЕНИЕ

Засуха является одним из основных абиотических экологических стрессовых факторов, которые ограничивают рост и развитие растений, играют важную роль в географическом распространении видов. Актуальность изучения данного типа стресса возрастает в связи с глобальными климатическими изменениями и аридизацией климата. Способность растений адекватно отвечать на водный дефицит и вызванный им осмотический стресс, выживать в условиях осмотического стресса зависит от эффективности крайне энергозатратных защитных механизмов растений [1].

Энергетический обмен растений является многокомпонентным. Центральная роль в общей энергетике растений и в конструктивном обмене принадлежит фотосинтезу, состоящему из световых (ФС I и ФС II) и темновых биохимических процессов. Большая роль в обеспечении клетки энергией и метаболитами принадлежит также темновому митохондриальному дыханию. В условиях водного дефицита наблюдается ингибирование фотосинтетической активности и, часто, усиление диссипации энергии в ходе темнового дыхания [2]. Лимитирование фотосинтеза претерпевает последовательные фазы. На начальной стадии (устьичная фаза) происходит частичное или полное закрытие устьиц. Это тормозит газообмен и снижает поступление СО₂ к центрам карбоксилирования. Далее в ходе неустьичной метаболической фазы наблюдается снижение активности ферментов цикла Кальвина [3].

Растения с С₃- и С₄-типом фотосинтетического метаболизма сильно отличаются по устойчивости к водному дефициту. Известно, что С₄-растения обладают эффективным фотосинтетическим аппаратом в теплых и засушливых условиях обитания. Преимущество C₄-растений, по сравнению С₃-видами, заключается в более эффективном фотосинтетическом механизме, который включает в себя дополнительную пространственно отделенную метаболическую надстройку к основному фотосинтетическому циклу Кальвина, связанную с функционированием фосфоенолпируваткарбоксилазы [4]. Данная надстройка является углерод-концентрирующим механизмом (УКМ), который позволяет более эффективно использовать свет и воду при высокой температуре и водном дефиците, в первую очередь, за счет почти полной рефиксации фотодыхательного СО₂. Высокая эффективность использования воды (WUE, англ.: water use efficiency) С₄-растениями привела к общему мнению, что данный тип фотосинтеза устойчив к засухе [5]. Однако в последнее время появляется все больше информации о слабой засухоустойчивости некоторых С₄-видов [6–8]. По мнению Sage и McKown [6], некоторые уникальные функции С₄-фотосинтеза и более сложный биохимический путь могут снизить потенциал общей фенотипической пластичности и акклиматизации фотосинтеза к изменению окружающей среды. Ghannoum [7] считает, что причиной может быть ограниченная при C₄-фотосинтезе интенсивность фотодыхания или реакции Мелера, которые являются значительными альтернативными стоками электронов в условиях водного стресса. Согласно гипотезе Osborne и Sack [8], возможно, слабая координация между углерод-концентрирующим С₄-механизмом и гидравлической функцией приводит к слабой засухоустойчивости растений. На сегодняшний день противоречия относительно засухоустойчивости С₄-растений остаются нерешенными, несмотря на большой интерес к растениям с кооперативным типом фотосинтеза в связи с их значительным вкладом в глобальный обмен углерода и продовольственную безопасность [7] на фоне изменения климата, и многочисленными попытками биотехнологически улучшить С₃-растения путем оверэкспрессии в них С₄-ферментов [9].

Показано, что снижение интенсивности С₄-фотосинтеза в условиях водного дефицита, главным образом, является следствием метаболических ограничений в ассимиляции СО₂, в то время как в C₃-видах преобладающую роль в снижении фотосинтеза, вызванного засухой, играет устьичное лимитирование [3, 7]. Водный дефицит также приводит к нарушению функционирования ФС II, нециклического транспорта электронов и активации циклического транспорта [10], в результате чего изменяется соотношение АТФ/НАДФ · Н. Эффективное регулирование работы ЭТЦ посредством активации альтернативных путей или циклического транспорта электронов имеет большое значение для выживания растений в стрессовых условиях, в том числе в условиях засухи [10]. Темновое митохондриальное дыхание в условиях дефицита воды может снижаться в результате уменьшения затрат на рост, а может усиливаться при возрастании затрат на поддержание и адаптационные механизмы [2].

Необходимым условием и важным этапом С₄-эволюции является появление фотодыхательного углеродного насоса, так называемого C₂-фотосинтеза, который использует фотодыхательный глициновый челнок для концентрирования CO₂ в клетках обкладки [11]. С₂-фотосинтез рассматривается как связующее звено между С₃- и С₄-типами фотосинтеза [12]. С другой стороны, эволюционная траектория от С₃- до С₄-фотосинтеза через промежуточные C₃–C₄-виды с С₂-фотосинтезом не так однозначна [8], и С₃–С₄-фотосинтез рассматривается как параллельный С₄-фотосинтезу путь со своими характерными особенностями. С₃–C₄-промежуточные виды представляют большой интерес для изучения эволюции С₄-фотосинтеза [11].

Известно, что эволюция C₄ фотосинтеза происходила при низкой атмосферной концентрации СО₂ [13] и высоком спросе на воду и, по мнению Osborne и Sack [8], сопровождалась одновременным улучшением углеродного и водного обмена растений. Отсутствие координации между механизмами усиления поступления углерода и потерей воды часто приводит к субоптимальным WUE и потерям фотосинтеза [14]. Дальнейшее изучение того, как эффективность водного обмена и фотосинтеза скоординированы внутри листьев, важно для изучения и прогнозирования физиологических последствий и производительности C₄-фотосинтеза в условиях изменяющейся атмосферной концентрации СО₂.

Особенностью растений семейства Маревые (Chenopodiaceae) – одного из самых больших семейств аридных и полуаридных территорий, является наличие видов ксерогалофитов с разным типом фотосинтетического метаболизма (С₃, С₄ и С₃–С₄) и разной устойчивостью к засухе. В настоящее время виды Chenopodiaceae используются в экологическом восстановлении деградированных агроландшафтов, а также в производстве кормов на засушливых землях. В рамках данной работы планируется изучение С₃-, С₄- и С₃–С₄- (с С₂-фотосинтезом) ксерогалофитов семейства Сhenopodiaceae в условиях засухи и засоления. Особое внимание будет уделено изучению влияния изменяющейся атмосферной концентрации СО₂ на координацию между фотосинтетической и гидравлической функциями.

Цель работы – сравнение параметров СО₂/Н₂О обмена и оценка степени их скоординированности у разных по устойчивости популяций С₃-, С₄- и С₃–С₄-видов семейства Chenopodiaceae в условиях умеренного ПЭГ-индуцированного водного дефицита при нормальной и низкой концентрации СО₂.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Исследования проводили на растениях С₃-вида (лебеда бородавчатая, Atriplex verrucifera M. Bieb), двух популяций (П1 и П2) С₄-вида (лебеда татарская, A. tatarica L.) и двух популяций (М и П) промежуточного С₃-С₄-вида (седобассия очитковидная, Sedobassia sedoides (Pall.) Freitag & G. Kadereit) семейства Маревые (Chenopodiaceae) в процессе их адаптации к ПЭГ-индуцированному умеренному осмотическому стрессу (–0.4…–0.5 МПа).

Умеренный уровень осмотического стресса был выбран, поскольку (1) данные виды в естественных условиях произрастания продемонстрировали чувствительность и наличие морфологических и генетических различий между популяциями в условиях умеренной засухи [15]; (2) изучение низких и средних уровней засухи представляет особый интерес, т.к. они широко распространены по всему миру и при этом изучены в меньшей мере, чем экстремальные уровни стрессовых нагрузок [16]. Адаптация к умеренной засухе не является шоковой и позволяет лучше выявить и изучить адаптивные механизмы устойчивости.

Для проведения лабораторных экспериментов семена А. verrucifera, A. tatarica и S. sedoides проращивали в дистиллированной воде. Проростки в возрасте 3–4 дней пересаживали на перлит, пропитанный 50% питательным раствором Хогланда. Растения выращивали под люминесцентными лампами при плотности потоков квантов ФАР 200 мкмоль/(м² с), 16-часовом фотопериоде и температуре 25°C. Растения в возрасте 30 дней переносили на экспериментальные растворы (полив перлита). Опыт длился 5–6 дней. ПЭГ-6000 (осмотический потенциал ψ_s = –0.4…–0.5 МПа) вносили в поддоны опытных вариантов дважды. В качестве контроля использовали 50% раствор Хогланда. Для определения сухой биомассы растительные пробы высушивали двое суток при 80°С. Содержание свободного пролина определяли с помощью кислого нингидринового реактива [17], результаты рассчитывали на 1 г сухой массы.

Для определения видимого фотосинтеза (А) и транспирации (Е) фрагмент листа помещали в термостатируемую при комнатной температуре листовую камеру и освещали оптоволоконным световодом от осветителя (KL 1500 LCD, “Shott”, Германия) с галогеновой лампой (150 Вт, “Philips”, Нидерланды) с интенсивностью ФАР в поле объекта 2000 мкмоль/(м² с). Стационарный СО₂/Н₂О газообмен листа измеряли с помощью одноканального ИК-газоанализатора (LI-820, “LICOR”, США) в открытой схеме. Транспирацию листа рассчитывали на основании разности влажности газа на входе и выходе из листовой камеры. В данной установке в опорном газовом потоке на входе в листовую камеру поддерживали известную постоянную влажность с помощью увлажнителя LI-610 (“LICOR”, США). Для определения влажности на выходе из листовой камеры использовали психрометрический датчик HMP50 (“Vaisala INTERCAP”, Финляндия). Эффективность использования воды (WUE) рассчитывали как отношение скорости видимого фотосинтеза к транспирации (А/Е). Интенсивность темнового дыхания (Rd) оценивали через 20 мин после выключения света.

Исследования А, Е, WUE и Rd проводили при современной атмосферной (400 ppm) и низкой (200 ppm) концентрации СО₂ в измерительной камере (древняя концентрация СО₂, при которой осуществлялось эволюционное развитие C₄-линий в течение 30 миллионов лет), что позволило в ходе эксперимента искусственно управлять открытием устьиц, оценивать чувствительность устьичного аппарата к внешним воздействиям [8, 13], а также дифференцировать устьичный и метаболический вклад в засухоустойчивость.

Продуктивность оценивали по накоплению сухой биомассы, устойчивость – по степени снижения данного параметра при стрессе. Степень скоординированности СО₂/H₂O газообмена оценивали по вариабельности темнового дыхания, т.е. по величине стандартного отклонения от средней арифметической, а также по степени снижения WUE и ростовых параметров.

Эффективность ФС I оценивали по изменению окислительно-восстановительного потенциала Р700 и измеряли путем мониторинга оптической плотности листьев при 820 нм с использованием “dual-wavelength” системы импульсной модуляции ED-P700DW (“Heinz-Walz, Effeltrich”, Германия) в сочетании с PAM101 (“Heinz-Walz”, Германия) [10]. Кинетика окисления P700 измерялась при освещении дальним красным светом (720 нм, 17.2 Вт/м²). Максимальное окисление P700 определяли с использованием ксеноновой газоразрядной лампы (50 мс, 1500 Вт/м²; “Heinz-Walz”, Германия) в присутствии дальнего красного света.

Во всех экспериментах было не менее трех биологических повторностей. Для факторного (ANOVA) анализа использовали программу SigmaPlot12.0. На графиках приведены средние арифметические значения полученных величин и их стандартные ошибки. Различия считались достоверными при P < 0.05.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Исследование ростовых параметров у С₃-, С₄- и С₃–С₄-видов сем. Chenopodiaceae в условиях ПЭГ-индуцированного умеренного осмотического стресса

Исследовали сухую биомассу растений С₃-вида (Atriplex verrucifera), двух популяций С₄-вида (A. tatarica) и двух популяций с разными подтипами промежуточного С₃-С₄-вида (Sedobassia sedoides) в процессе адаптации к ПЭГ-индуцированному умеренному осмотическому стрессу (‒0.4…–0.5 МПа) (рис. 1).

Рис. 1.

Сухая биомасса надземной части растений С₃-вида (Atriplex verrucifera) (а), растений из двух популяций П1 (1) и П2 (2) С₄-вида Atriplex tatarica (б) и двух популяций М (1) и П (2) С₃-С₄-вида Sedobassia sedoides (в) в условиях ПЭГ-индуцированного умеренного осмотического стресса. Достоверные различия на уровне P < 0.05 отмечены разными буквами.

В ходе проведенных экспериментов установлено, что в контрольных условиях более продуктивными были растения С₄-вида A. tatarica и С₃‑С₄-вида S. sedoides, у которых показатели сухой биомассы оказалась в 2–4 раза выше, чем у С₃-вида А. verrucifera (рис. 1а–в). Между популяциями С₄-вида наблюдались достоверные различия накопления сухой биомассы, растения популяции П2 были в 1.7 раз более продуктивными по сравнению с популяцией П1 (рис. 1б).

В условиях умеренного осмотического стресса у А. verrucifera накопление сухой биомассы не отличалось от контроля (рис. 1а). У двух популяций A. tatarica установлены различия: если растения П1 в условиях осмотического стресса снижали сухой вес на 30%, то растения П2 – в 2.2 раза (рис. 1б). Таким образом, выявленные различия между популяциями С₄-вида A. tatarica показывают, что П1 характеризуется меньшей продуктивностью, но большей устойчивостью к осмотическому стрессу, а П2 – наоборот, является более продуктивной, но менее устойчивой популяцией. У S. sedoides в условиях слабого осмотического стресса обе популяции снижали сухую биомассу примерно в 2 раза (рис. 1в).

Исследование СО₂/H₂O газообмена при разных концентрациях СО₂ (400 и 200 ppm) у С₃-вида (Atriplex verrucifera) в условиях ПЭГ-индуцированного умеренного осмотического стресса

Использование низкой концентрации СО₂ позволяет исследовать устьичный и метаболический вклад в засухоустойчивость вида, т.к. стимулирует открытие устьиц, а также дает возможность оценить чувствительность устьичного аппарата в целом. При снижении концентрации СО₂ в измерительной камере до 200 ppm в контрольных условиях ассимиляция CO₂ (интенсивность видимого фотосинтеза, А) у C₃-вида (A. verrucifera) снижалась в 9 раз (рис. 2а). Такое значительное снижение связано как с устьичной, так и с метаболической компонентами. Устьичная компонента снижалась в 2 раза, поскольку наблюдалось 2-кратное снижение интенсивности транспирации при снижении концентрации СО₂ в измерительной камере (рис. 2б). Метаболическая компонента, как правило, связана с активностью ферментов цикла Кальвина и в данном случае снижалась в 2 раза при 2-кратном снижении концентрации СО₂.

Рис. 2.

Параметры СО₂/H₂O газообмена при разных концентрациях СО₂ у С₃-вида (A. verrucifera) в условиях ПЭГ-индуцированного умеренного осмотического стресса: (а) – интенсивность видимого фотосинтеза, А; (б) – транспирация, Е; (в) – темновое дыхание, Rd; (г) – эффективность использования воды, WUE. 1 – 400 ppm СО₂; 2 – 200 ppm СО₂. Разными латинскими буквами отмечены достоверные различия на уровне P < 0.05.

При действии умеренного осмотического стресса в условиях нормальной концентрации СО₂ (400 ppm) наблюдалось небольшое возрастание WUE (рис. 2г), что связано с увеличением интенсивности видимого фотосинтеза в 1.4 раза (рис. 2а). При этом интенсивность транспирации не изменялась, т.е. устьица проявляли нечувствительность к осмотическому стрессу (рис. 2б). Увеличение интенсивности видимого фотосинтеза не сказалось на продуктивности (рис. 1а) и это, вероятно, связано с тем, что дополнительные ассимиляты диссипировались в ходе усиленного темнового дыхания (рис. 2в). Таким образом, для С₃-вида была характерна высокая чувствительность устьиц при низкой концентрации СО₂, хотя и имела место не совсем характерная реакция, а именно закрытие устьиц. При этом в условиях осмотического стресса устьица проявляли нечувствительность.

Исследование СО₂/H₂O газообмена при разных концентрациях СО₂ (400 и 200 ppm) на примере двух популяций С₄-вида (Atriplex tatarica) в условиях ПЭГ-индуцированного умеренного осмотического стресса

У С₄-вида (A. tatarica) интенсивность видимого фотосинтеза была выше, чем у С₃-вида (A. verrucifera) (рис. 2а, 3а). В контрольных условиях при снижении концентрации СО₂ в измерительной камере до 200 ppm ассимиляция CO₂ у C₄-вида снижалась в П1 почти в 1.7 раз, в П2 – более чем в 2 раза (рис. 3а, д). Данное снижение обусловлено, в первую очередь, метаболической компонентой. Ожидаемое усиление транспирации при 200 ppm, связанное с искусственным открытием устьиц [13], произошло только в П2 (рис. 2е). У П1 устьица проявляли нечувствительность к низкой концентрации СО₂ (рис. 3б). Можно предположить, что степень рассогласования компонентов энергетического и водного обмена и диссипации энергии у П1 при 200 ppm была ниже, чем у П2, поскольку колебания интенсивности темнового дыхания и снижение WUE было выражено в меньшей степени, чем у П2 (рис. 3в, г, ж, з).

Рис. 3.

Параметры СО₂/H₂O газообмена при разных концентрациях СО₂ у растений популяции П1 (а–г) и популяции П2 (д–з) С₄-вида (Atriplex tatarica) в условиях ПЭГ-индуцированного умеренного осмотического стресса: (а, д) – интенсивность видимого фотосинтеза, А; (б, е) – транспирация, Е; (в, ж) – темновое дыхание, Rd; (г, з) – эффективность использования воды, WUE. 1 – 400 ppm СО₂; 2 – 200 ppm СО₂. Достоверные различия (на уровне Р < 0.05) внутри популяций отмечены разными латинскими буквами, между популяциями – звездочкой.

При действии умеренного осмотического стресса в условиях нормальной концентрации СО₂ (400 ppm) интенсивность видимого фотосинтеза в П1 не изменялась, а в П2 имело место достоверное снижение (рис. 3а, д), которое в значительной степени связано с закрытием чувствительных устьиц, поскольку транспирация в условиях осмотического стресса снижалась в 1.7 раз по сравнению с контрольным вариантом (рис. 3е). Изменение интенсивности видимого фотосинтеза в условиях ПЭГ-индуцированного стресса у П2 отразилось на продуктивности (рис. 1б).

Таким образом, растения из двух исследуемых популяций С₄-вида продемонстрировали разные способы поддержания СО₂/H₂O газообмена листьев. Популяция П1 оказалась более устойчивой: в условиях осмотического стресса и низкой концентрации СО₂ (200 ppm) она характеризовалась нечувствительностью устьичного аппарата (рис. 3а, 3б). Снижение ассимиляции CO₂ почти в 2 раза при 200 ppm связано с метаболической компонентой. Вторая популяция П2 в контрольных условиях была более продуктивной по интенсивности фотосинтеза (рис. 3д) и накоплению сухой биомассы (рис. 1б). При действии 200 ppm устьица проявили чувствительность, наблюдалось их открытие (рис. 3е). Происходящее при этом снижение ассимиляции CO₂ более чем в 2 раза связано, в первую очередь, с метаболической компонентой и недостатком в камере СО₂. Слабая устойчивость растений П2 к осмотическому стрессу проявилась через снижение интенсивности видимого фотосинтеза, главным образом, за счет устьичной составляющей, поскольку в данной популяции поддержание водного статуса листьев достигалось путем закрытия устьиц.

Исследование СО₂/H₂O газообмена при разных концентрациях СО₂ (400 и 200 ppm) на примере двух популяций промежуточного С₃–С₄- вида (Sedobassia sedoides) в условиях умеренного ПЭГ-индуцированного осмотического стресса

Интенсивность видимого фотосинтеза (А) при низкой концентрации СО₂ (200 ppm) в контрольных условиях снижалась у популяции М в 2 раза, а у популяции П – в 3 раза (рис. 4а, 4д), т.е. реакция растений на низкую концентрацию СО₂ у С₃–С₄-вида была подобной реакции С₄-вида, несмотря на разную природу УКМ: у С₄ – аспартатный, а у С₃–С₄– фотодыхательный . При этом абсолютные значения А были ниже у С₃–С₄-вида (рис. 3а, 3д; 4а, 4д). Интенсивность транспирации при 200 ppm снижалась приблизительно в 2 раза в обеих популяциях, т.е. устьица проявляли чувствительность и закрывались (как у растений С₃-вида A. verrucifera). Таким образом, снижение интенсивности видимого фотосинтеза у растений популяции М связано, в первую очередь, с устьичной составляющей, а у растений П – как с устьичной, так и с метаболической компонентами.

Рис. 4.

Параметры СО₂/H₂O газообмена у растений популяции М (а–г) и популяции П (д–з) промежуточного С₃‒С₄-вида (Sedobassia sedoides) при разных концентрациях СО₂ в условиях ПЭГ-индуцированного умеренного осмотического стресса: (а, д) – интенсивность видимого фотосинтеза, А; (б, е) – транспирация, Е; (в, ж) – темновое дыхание, Rd; (г, з) – эффективность использования воды, WUE. 1 – 400 ppm СО₂; 2 – 200 ppm СО₂. Достоверные различия (на уровне Р < 0.05) внутри популяций отмечены разными латинскими буквами, между популяциями – звездочкой.

В условиях умеренного осмотического стресса при нормальной концентрации СО₂ (400 ppm) интенсивность видимого фотосинтеза у растений популяции М достоверно не изменялась, а у растений популяции П снижалась в 3 раза (рис. 4а, 4д). Снижение ассимиляции СО₂ у растений популяции П связано, в первую очередь, с закрытием устьиц, поскольку интенсивность транспирации при этом снижалась (относительно контрольного варианта) более чем в 2 раза (рис. 4е). У растений популяции М транспирация изменялась в меньшей степени (на 25%), т.е. устьица проявляли слабую чувствительность к ПЭГ-индуцированному стрессу (похожая реакция была у популяции П1 С₄-вида). У растений обеих популяций наблюдалась вариабельность темного дыхания (рис. 4в, ж). Популяции С₃-С₄-вида характеризовались самыми низкими значениями WUE (в контроле). При этом у растений популяции М эффективность использования воды не реагировала на низкую концентрацию СО₂ и на умеренный осмотический стресс, в то время как у растений популяции П при 200 ppm она снижалась в 2 раза, т.к. устьица проявляли чувствительность (рис. 4г, з). Таким образом, С₃–С₄-вид демонстрировал черты, сходные как с С₃-, так и с С₄-видами.

Содержание пролина у С₃-, С₄- и С₃–С₄-видов сем. Chenopodiaceae в условиях ПЭГ-индуцированного умеренного осмотического стресса

Самые низкие значения содержания пролина в контроле были у С₃-вида A. verrucifera (рис. 5а), а воздействие умеренного осмотического стресса на него не выявило достоверных изменений. Содержание пролина у С₄-вида A. tatarica в контроле было почти в 10 раз выше по сравнению с А. verrucifera (рис. 5а, б). В условиях осмотического стресса растения популяции П1 продемонстрировали возрастание содержания пролина в 1.5 раза, а в популяции П2 – на 20% (рис. 5б). У растений популяции М промежуточного С₃-С₄-вида S. sedoides содержание пролина в контроле было в 1.4 раза выше, чем у популяции П, и не изменялось в условиях ПЭГ-индуцированного осмотического стресса (рис. 5в). У растений популяции П наблюдалось возрастание содержания пролина более чем в 2 раза в условиях стресса.

Рис. 5.

Содержание пролина у растений С₃-вида (Atriplex verrucifera) (а), растений из двух популяций П1 (1) и П2 (2) С₄-вида Atriplex tatarica (б) и двух популяций М (1) и П (2) С₃-С₄-вида Sedobassia sedoides (в) в условиях ПЭГ-индуцированного умеренного осмотического стресса. Разными латинскими буквами отмечены достоверные различия на уровне Р < 0.05.

Эффективность ФС I и активность циклического транспорта электронов у С₃-, С₄- и С₃–С₄-видов сем. Chenopodiaceae в условиях ПЭГ-индуцированного умеренного осмотического стресса

Измерения ФС I показали, что значения времени выхода кинетической кривой окисления P700 на плато у растений исследуемых видов отличались. У растений С₃-вида, популяции П2 С₄-вида и популяции П промежуточного С₃-С₄-вида этот показатель в условиях осмотического стресса не изменялся (рис. 6). У растений популяции П1 С₄-вида наблюдалось его возрастание в условиях осмотического стресса в 1.7 раз (рис. 6б), а у популяции М С₃–С₄-вида – в 1.6 раз (рис. 6в).

Рис. 6.

Эффективность ФС I у растений С₃-вида (Atriplex verrucifera) (а), растений из двух популяций П1 (1) и П2 (2) С₄-вида Atriplex tatarica (б) и двух популяций М (1) и П (2) С₃–С₄-вида Sedobassia sedoides (в) в условиях ПЭГ-индуцированного умеренного осмотического стресса. Разными латинскими буквами отмечены достоверные различия на уровне Р < 0.05.

ОБСУЖДЕНИЕ

Открытие или закрытие устьиц у растений обусловлено совокупностью действующих внешних и внутренних сигналов [18], а также чувствительностью устьиц, которая различается у разных видов [19]. Как известно, устьица открываются в ответ на свет (исключение составляют устьица САМ растений), низкую концентрацию CO₂, высокую температуру и низкий уровень дефицита давления пара, в то время как закрытие стимулируется низким освещением или темнотой, высоким уровнем CO₂ и дефицита давления пара [20]. Использование низкой концентрации СО₂ в эксперименте при измерении СО₂/H₂O газообмена позволяет искусственно управлять открытием устьиц, оценивать устьичный и метаболический вклад в засухоустойчивость, тестировать чувствительность устьичного аппарата к внешним воздействиям [8, 13].

Используемый в нашей работе С₃-вид A. verrucifera является засухоустойчивым (ксерогалофитом), имеет черты суккулентности [15], характеризуется низкой скоростью роста. При концентрации СО₂ 200 ppm ожидаемого усиления транспирации, обусловленного искусственным открытием устьиц, характерного для С₃-растений [13], в нашем эксперименте не произошло. Имело место существенное снижение транспирации в 2 раза, что свидетельствует о высокой чувствительности устьиц и их быстром закрытии у С₃-вида (рис. 2б). Хотя эта реакция не характерна для С₃-вида, тем не менее, подобные результаты были ранее получены на пшенице [13]. У A. verrucifera при низкой концентрации СО₂ наблюдались большие колебания интенсивности темнового дыхания и снижение WUE (в 5 раз), что свидетельствует о рассогласовании процессов СО₂/H₂O газообмена (рис. 2в, г). Таким образом, для С₃-вида A. verrucifera характерна высокая чувствительность устьиц к низкой концентрации СО₂ и слабая чувствительность к умеренному осмотическому стрессу.

Как известно, С₄-растения имеют метаболические преимущества по сравнению с С₃-видами, благодаря наличию углерод-концентрирующего механизма, одного из наиболее конвергентных эволюционных явлений в биологическом мире. Считается, что в ходе формирования С₄ фотосинтеза УКМ возник как минимум в 66 независимых эволюционных линиях [11]. Эволюционное развитие C₄-линий в течение 30 млн лет осуществлялось при относительно низких атмосферных концентрациях CO₂, примерно, в 2 раза ниже современного уровня, что привело к снижению проводимости устьиц, их более низкой чувствительности (более медленные реакции устьиц на затенение) и более высокой абсолютной эффективности использования воды, что в результате обеспечило преимущество C₄-видов по сравнению с С₃-растениями [13]. С целью выявления причин слабой засухоустойчивости С₄-растений и анализа вклада отдельных составляющих энергетического обмена в процессе адаптации исследовали действие умеренного осмотического стресса на рост, СО₂/H₂O газообмен листьев растений двух контрастных по продуктивности популяций (П1 и П2) ксерогалофита A. tatarica (С₄ НАД-МЭ тип). Данные популяции в естественных условиях произрастания достоверно различались более чем в 2 раза по длине побегов (21 ± 0.8 и 48 ± 3.3 см) и в 10 раз по сырой и сухой биомассе (0.9 ± 0.1 и 13.7 ± 3.0 г; 0.3 ± 0.01 и 2.9 ± 0.62 г, соответственно) [15]. При проведении модельных экспериментов в лабораторных условиях в ходе исследования влияния ПЭГ-индуцированной засухи на морфофизиологические параметры, были выявлены достоверные различия между исследуемыми популяциями. Так, в контрольных условиях более продуктивной по накоплению сухой биомассы была популяция П2 по сравнению с П1 (рис. 1б). В условиях умеренного осмотического стресса популяция П2 проявляла меньшую устойчивость и снижала накопление сухой биомассы в 2.2 раза. У менее продуктивной популяции П1 снижение ростовых параметров в условиях осмотического стресса было выражено в меньшей степени (на 30%). Таким образом, выявленные различия между популяциями С₄-вида A. tatarica показывают, что популяция П1 характеризуется меньшей продуктивностью, но большей устойчивостью к осмотическому стрессу, а П2, наоборот, является более продуктивной, но менее устойчивой популяцией (рис. 1б).

Растения из двух исследуемых популяций С₄-вида продемонстрировали разные способы поддержания СО₂/H₂O газообмена листьев в условиях осмотического стресса и низкой концентрации СО₂ (200 ppm). Популяция П1 оказалась более устойчивой и характеризовалась нечувствительностью устьичного аппарата (рис. 3а, б). Снижение ассимиляции CO₂ при концентрации 200 ppm связано с метаболической компонентой, т.е. со снижением активности ферментов цикла Кальвина, вызванного нехваткой основного ресурса. У более продуктивной (по интенсивности фотосинтеза и накоплению сухой биомассы), но менее устойчивой популяции П2 при действии 200 ppm CO₂ наблюдалось открытие устьиц, т.е. устьица проявляли чувствительность. Снижение ассимиляции CO₂ при этом также связано с метаболической компонентой. Слабая устойчивость к осмотическому стрессу проявлялась через снижение интенсивности видимого фотосинтеза, в первую очередь за счет устьичной составляющей, поскольку в популяции П2 поддержание водного баланса листьев при стрессе достигалось путем закрытия устьиц. Таким образом, растения из менее устойчивой популяции П2 продемонстрировали высокую чувствительность устьиц, высокую степень рассогласования и диссипации, которая проявлялась в виде колебания интенсивности темнового дыхания при действии низкой концентрации СО₂ (рис. 3ж).

В условиях осмотического стресса у более устойчивой популяции A. tatarica имело место снижение водного потенциала (неопубликованные данные), усиление циклического транспорта электронов ФС I и увеличение содержания пролина. На C₄-растениях рода Flaveria установлено, что С₄-виды проявляют более высокую активность циклического переноса электронов, чем С₃-растения [21]. Это связано с тем, что у данных растений функционально активны как C₃-, так и C₄-цикл, что приводит к повышению энергетической стоимости ассимиляции СО₂ по сравнению с С₃-видами. Как следствие, две дополнительные молекулы АТФ требуются для каждой молекулы CO₂, фиксированной в результате действия C₄-цикла. Предполагается, что дополнительные молекулы АТФ производятся с помощью циклического транспорта электронов ФС I, что способствует генерации градиента рН на тилакоидной мембране без образования НАДФ·Н [21]. В наших исследованиях показано, что в условиях осмотического стресса у популяции П1 A. tatarica наблюдалось значительное увеличение содержания пролина (рис. 5б) и возрастание эффективности ФС I (рис. 6б). Можно предположить, что главным фактором поддержания водного баланса листа при стрессе у данной популяции является снижение водного потенциала в подустьичной полости при участии пролина в условиях постоянной транспирации. Источником дополнительной энергии может быть циклический транспорт электронов ФС I. Таким образом, сравнивая С₃- и С₄-виды сем. Chenopodiaceae можно сказать, что при низкой и нормальной концентрациях СО₂ C₄-виды имеют преимущества по сравнению с C₃-видами из-за высокой интенсивности ассимиляции CO₂, более низкой чувствительности устьиц и более высокой абсолютной эффективности использования воды. У П1 – менее продуктивной, но более устойчивой С₄-популяции – высокие значения эффективности использования воды свидетельствуют о более высоком уровне согласования СО₂ и H₂O газообмена листьев. Как следует из изменений интенсивности темнового дыхания (повышенный уровень вариабельности), более высокий уровень рассогласования и диссипации у С₃-видов имеет место в условиях низкой концентрации СО₂ и умеренного осмотического стресса, у С₄-видов – при низкой концентрации СО₂.

Интересной и перспективной моделью изучения возникновения и эволюционного преобразования С₄-пути являются промежуточные С₃–С₄-виды. Показано, что одним из путей формирования углерод-концентрирующего механизма является видоизменение фотодыхания [11], направленное на возвращение фотодыхательного СО₂, количество которого в условиях засухи и высокой температуры очень высоко [22]. Данный фотодыхательный углеродный насос, так называемый “C₂-фотосинтез”, использует фотодыхательный шаттл глицина для концентрирования CO₂ в клетках обкладки [11]. С₂-фотосинтез рассматривается как “эволюционный мост” между С₃- и С₄-растениями [12]. Данный путь на сегодняшний день показан и изучен на основе филогенетического анализа гликофитов рода Flaveria (сем. Asteraceae) [11, 23]. С₃–С₄-виды подразделяются на отдельные подтипы, соответствующие последовательным этапам С₄-эволюции: С₃ – прото-Кранц – С₂ (I и II тип) – С₄-подобные – С₄ [11], и отражающие степень формирования С₄-углерод-концентрирующего механизма. Промежуточные С₃–С₄-виды с С₂-фотосинтезом определены также в сем. Chenopodiaceae [11]. В частности, представителем данного семейства является ксерогалофит Sedobassia sedoides (синоним Bassia sedoides), который был отнесен к С₃–С₄ промежуточным видам на основе анатомических особенностей [24], а также анализа газообмена и иммунолокализации глициндекарбоксилазы [25].

Ранее на примере двух популяций S. sedoides нами была показана генетическая пластичность в стрессовых условиях, которая проявлялась во внутривидовых различиях в устойчивости к осмотическому стрессу [26] и к засолению [27, 28]. С целью изучения механизмов засухоустойчивости на разных этапах формирования С₄-фотосинтеза в процессе эволюции мы исследовали две популяции М и П промежуточного С₃–С₄-вида (S. sedoides), отличающиеся по продуктивности и устойчивости в естественных условиях произрастания. Предварительные эксперименты показали, что растения популяции М более продуктивны и устойчивы, а растения популяции П – низкопродуктивны и менее устойчивы [28]. В настоящих экспериментах при низкой концентрации СО₂ обе популяции S. sedoides продемонстрировали связанное с метаболической и устьичной компонентами снижение интенсивности видимого фотосинтеза у растений популяции М в 2 раза, популяции П – в 3 раза. У обеих популяций наблюдалось рассогласование СО₂ обмена, что проявлялось в вариабельности темнового дыхания. Однако растения популяции М проявляли большую стабильность, так как у них WUE изменялось незначительно. У растений популяции П снижение WUE при низкой концентрации СО₂ свидетельствовало о значительном снижении ассимиляции СО₂ в большей степени за счет метаболической компоненты, в отличие от растений популяции М.

Сравнительная оценка вклада отдельных составляющих энергетического обмена: фотосистемы I и циклического транспорта электронов, видимого фотосинтеза, темнового дыхания у С₃‑ (Atriplex verrucifera), С₄- (A. tatarica) и промежуточного С₃–С₄- (Sedobassia sedoides) видов сем. Chenopodiaceae в процесс адаптации к ПЭГ-индуцированному осмотическому стрессу представлена в таблице 1. Подводя итог сравнительного анализа механизмов устойчивости у представителей разных видов, отличающихся типом фотосинтетического метаболизма, в условиях осмотического стресса можно сформулировать следующие выводы (табл. 1):

Таблица 1.  

Сравнительная оценка вклада составляющих СО₂/H₂O обмена: видимого фотосинтеза, транспирации, темнового дыхания в механизмы засухоустойчивости, а также данные по биомассе, содержанию пролина, эффективности циклического транспорта электронов у С₃- (Atriplex verrucifera), С₄- (A. tatarica) и промежуточного С₃–С₄- (Sedobassia sedoides) видов растений сем. Chenopodiaceae в условиях ПЭГ-индуцированного осмотического стресса при нормальной и низкой концентрации СО₂

Условия и итоговый вывод	Снижение устойчивости к осмотическому стрессу
	С3-вид (Atriplex verrucifera)	С4-вид (Atriplex tatarica)
		П1 (устойчивая популяция)	П2 (неустойчивая популяция)
Низкая концентрация СО2 (200 ppm)	Устьица чувствительные (закрываются). Темновое дыхание вариабельно. WUE снижается в 5 раз	Устьица нечувствительные. Темновое дыхание вариабельно. WUE снижается почти в 2 раза	Устьица чувствительные (открываются). Темновое дыхание вариабельно, может возрастать в 2–3 раза (диссипация). WUE снижается в 3 раза
Умеренный осмотический ПЭГ-индуцированный стресс (при 400 ppm СО2)	Сухой вес не изменяется. Устьица нечувствительные Темновое дыхание вариабельно, возрастает (диссипация). Содержание пролина не изменяется. Циклический транспорт ФСI не изменяется или снижается [29]. WUE не изменяется	Сухой вес снижается на 30%. Устьица нечувствительные. Водный потенциал снижается [не опубликованные данные]. Содержание пролина увеличивается в 1.5 раза. Циклический транспорт ФСI усиливается в 1.7 раза. WUE не изменяется	Сухой вес снижается в 2 раза. Устьица чувствительные (закрываются). Водный потенциал не изменяется [не опубликованные данные]. Содержание пролина увеличивается на 20%. Циклический транспорт ФС I не изменяется. WUE не изменяется
		С3–С4-вид (Sedobassia sedoides)
		Популяция М	Популяция П
Низкая концентрация СО2 (200 ppm)		Устьица чувствительные (закрываются). WUE не изменяется	Устьица чувствительные (закрываются). WUE снижается в 2 раза
Умеренный осмотический ПЭГ -индуцированный стресс (при 400 ppm СО2)		Сухой вес снижается в 1.7 раза. Устьица менее чувствительные. Транспирация снижается на 20%. Темновое дыхание вариабельно. Содержание пролина высокое в контроле и не изменяется при осмотическом стрессе. Циклический транспорт ФС I усиливается в 1.6 раза. WUE не изменяется	Сухой вес снижается в 2 раза. Устьица более чувствительные (закрываются). Транспирация снижается в 2 раза. Темновое дыхание более вариабельно. Содержание пролина увеличивается в 2 раза. Циклический транспорт ФСI не изменяется. WUE не изменяется
Итоговый вывод о механизмах устойчивости:	Засухоустойчивый С3-вид. Суккулентный. Устьица чувствительные к низкой концентрации СО2 и нечувствительные к осмотическому стрессу. Излишки энергии диссипируются через темновое дыхание	Несмотря на разную природу УКМ, у С4- (аспартатный), у С3–С4- (фотодыхательный) видов, механизмы устойчивости у устойчивых популяций сходны: устьица менее чувствительные к осмотическому стрессу. Фактором поддержания водного баланса листьев при стрессе может быть снижение водного потенциала в подустьичной полости у С4-растений при участии пролина в условиях постоянной транспирации. Источником дополнительной энергии может быть циклический транспорт электронов ФС I	У неустойчивых популяций С4- и С3–С4-видов в условиях осмотического стресса стабилизация водного баланса листьев достигается закрыванием более чувствительных устьиц. Темновое дыхание вариабельно (результат метаболического и энергетического рассогласования). Излишки энергии диссипируются через темновое дыхание

Примечание. А – интенсивность видимого фотосинтеза, Е – интенсивность транспирации, WUE – эффективность использования воды. М – популяция Макан, П – популяция Подольск.

1. В условиях осмотического стресса С₃-вид данного семейства проявил черты засухоустойчивости, суккулентности и характеризовался нечувствительными устьицами. Излишки энергии диссипировались через темновое дыхание.

2. Несмотря на разную природу УКМ (у С₄-вида – аспартатный, у С₃–С₄ – фотодыхательный), механизмы устойчивости у устойчивых популяций подобны: устьица в меньшей степени чувствительны к осмотическому стрессу. Важным фактором поддержания водного баланса клеток листа при стрессе был пролин. Источником дополнительной энергии может быть циклический транспорт электронов ФС I.

3. У неустойчивых популяций С₄- и С₃–С₄-видов в условиях осмотического стресса стабилизация водного баланса листьев достигалась закрыванием устьиц. Темновое дыхание было вариабельно (результат метаболического и энергетического рассогласования) и участвовало в диссипации излишней энергии.

Итак, главной причиной слабой засухоустойчивости некоторых популяций С₄-ксерогалофитов сем. Chenopodiaceae является различие в способах поддержания водного баланса листьев. У неустойчивых популяций С₄- и С₃–С₄-видов в условиях осмотического стресса отсутствует механизм стабилизации водного обмена листьев, который есть у устойчивых популяций с С₄- и С₃–С₄-типом фотосинтеза и, несмотря на разную природу УКМ, имеет общие черты. Таким образом, в процессе эволюции совершенствовались УКМ (от фотодыхательного С₃-С₄ к нормальному С₄) и механизм стабилизации Н₂О обмена.

Работа выполнена при поддержке проекта Российского фонда фундаментальных исследований № 17-04-00853-а.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов. Настоящая статья не содержит каких-либо исследований с участием людей и животных в качестве объектов исследований.