1. На главную
  2. Электронные версии
  3. Физиология растений
  4. T. 67, № 4, 2020

Физиология растений, 2020, T. 67, № 4, стр. 428-437

Физиолого-биохимические аспекты морозостойкости Оlea europaea L.

Т. Б. Губанова a, *, А. Е. Палий a

a Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Никитский ботанический сад – Национальный научный центр Российской академии наук
Ялта, Россия

* E-mail: gubanova-65@list.ru

Поступила в редакцию 02.09.2019
После доработки 15.10.2019
Принята к публикации 23.10.2019

Полный текст (PDF)

Аннотация

Представлены результаты исследований морозостойкости сортов Olea europaea L. и ее подвида O. еuropаea subsp. cuspidatа (Wall. and G. Don) Cif. в условиях Южного берега Крыма (ЮБК), а также влияния температуры, близкой к значению абсолютного минимума (–15°С) на состояние фотосинтетического аппарата, активность каталазы, полифенолоксидазы, содержание пролина и фенольных соединений. Установлено, что в условиях ЮБК относительно высокая морозостойкость характерна для сорта Никитская. Слабоморозостойкими оказались сорта Асколяно, Кореджиоло, Раццо. Минимальная устойчивость выявлена у подвида O. еuropаea subsp. cuspidatа. У слабостойких сортов Раццо, Кореджиоло и O. еuropаea subsp. cuspidatа действие температуры –15°С привело к необратимым нарушениям в работе фотосинтетического аппарата, что проявилось в значительном снижении фотосинтетической активности сразу после окончания низкотемпературного воздействия (на 80.19, 50.0 и 89.78%, соответственно), а также коэффициента спада флуоресценции ниже витальной нормы. Спустя 24 ч у сортов Асколяно и Никитская отмечено замедление снижения параметров индукции флуоресценции хлорофилла (ИФХ). Выявлено, что отрицательные температуры способствуют снижению активности каталазы у слабоустойчивых генотипов O. europaea (в среднем на 40–60%), в отличие от морозостойкого сорта Никитская, у которого активность этого фермента практически не изменилась. Изменение активности полифенолоксидазы было разнонаправленным. У сортов Раццо и Кореджиоло отмечено возрастание полифенолоксидазной активности (19 и 24%, соответственно), а у подвида O. europaea subsp. cuspidata и сорта Никитская – снижение (на 8 и 37%, соответственно). Показано, что при действии отрицательных температур у представителей O. europaea происходит снижение концентрации пролина в тканях листьев (на 17–55%). Наиболее значительные изменения выявлены у сорта Кореджиоло (на 45.09%). Суммарное содержание фенольных соединений снижалось у всех слабоморозостойких сортов и O. europaea subsp. cuspidata на 7–42%, а у морозостойкого сорта Никитская – оставалось неизменным. Установлено, что отрицательные температуры вызывают необратимые изменения в работе фотосинтетического аппарата у слабоустойчивых представителей O. europaea. Выявлена связь степени морозостойкости изучаемых генотипов с активностью каталазы, а также с содержанием пролина и фенольных соединений в тканях листьев.

Ключевые слова: Olea europaea, морозостойкость, фотосинтез, активность ферментов, пролин, фенольные соединения

ВВЕДЕНИЕ

Вопросы морозостойкости растений и функционирования механизмов, обеспечивающих это жизненно важное свойство, несмотря на огромный объем накопленного экспериментального материала, не утратили актуальности в наши дни. Исследования механизмов адаптации растительных организмов к действию гидротермического стресса в большей части проводятся на примере травянистых модельных объектов, что позволяет за относительно короткий срок детально изучить отдельные звенья сложных адаптивных процессов. Информация о реакциях на действие отрицательных температур древесных вечнозеленых лиственных растений немногочисленна. Реализация механизмов морозостойкости у этой группы растительных организмов вызывают особый интерес в связи с тем, что у них даже в зимнее время метаболические процессы весьма интенсивны. Исследование работы фотосинтетического аппарата в условиях отрицательных температур является ключевым моментом в изучении физиологии устойчивости вечнозеленых растений, которые в зимнее время часто подвержены одновременному действию стимулирующего (высокая инсоляция) и ингибирующего (низкие и отрицательные температуры) фактора. В настоящее время известно, что в условиях интенсивной освещенности и отрицательной температуры избыток энергии, который не может быть использован в фотохимических реакциях, является одной из причин деструктивных изменений фотосинтетического аппарата [1]. К защитным реакциям относится увеличение доли тепловой диссипации с участием каротиноидов виолоксантинового цикла [2].

Ряд авторов отмечает высокую чувствительность процессов флуоресценции хлорофилла к температурному фактору. В частности, известно, что при действии разнообразных факторов характер кривой индукции флуоресценции хлорофилла (ИФХ) позволяет получить объективную информацию об изменениях фотосинтетических процессов, как связанных с развитием адаптационного синдрома, так и с необратимыми нарушениями в работе фотосинтетического аппарата, что в свою очередь позволяет получить объективную характеристику устойчивости изучаемого вида растения [3, с. 148–155].

Низкотемпературный стресс проявляется на всех уровнях организации растительного организма. На клеточном уровне морозные повреждения затрагивают прежде всего мембраны [6], при этом происходит увеличение уровня АФК, которое впоследствии может привести к перекисному окислению липидов, разрушению мембран, деградации белков и нарушению метаболической функции [7]. Для смягчения или защиты от индуцированного отрицательными температурами окислительного повреждения в растениях выработаны механизмы удаления АФК с помощью ферментативной и неферментативной антиоксидантных систем, в состав которых входят окислительно-восстановительные ферменты (супероксиддисмутаза, каталаза, пероксидаза и др.) и протекторные соединения (фенольные вещества, аскорбиновая кислота, пролин и др.) [8]. Немаловажную роль в ликвидации последствий действия отрицательных температур играет полифенолоксидаза, поскольку она помогает избежать серьезного окислительного повреждения, вызванного замораживанием [9]. При возникновении стрессовых условий изменение активности полифенолоксидазы связано с образованием химических барьеров, препятствующих дальнейшему распространению АФК. Таким образом, ферменты антиоксидантной системы и полифенолоксидаза, принимая участие в регуляции метаболизма, способствуют быстрой адаптации растения к изменяющимся условиям окружающей среды.

Маслина является одной из субтропических культур, которая часто выращивается в климатических условиях, граничащих с пределами их зимостойкости [10]. Исследования, проведенные ранее, показали, что существует корреляция между некоторыми физиолого-биохимическими характеристиками (размер и плотность устьиц, содержание фенольных соединений, общих растворимых белков, водорастворимых сахаров, экзосмос электролитов и др.) и морозостойкостью генотипов маслины [11, 12].

Поскольку действие отрицательных температур на древесные вечнозеленые растения затрагивает все звенья их жизнедеятельности, то цель наших исследований заключалась в выявлении связи степени морозостойкости у представителей Olea europaea с изменениями параметров ИФХ, активности окислительно-восстановительных ферментов и содержания некоторых криопротекторных соединений.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В качестве материалов исследований были выбраны сорта Olea europaea L.: Никитская (селекция Никитского ботанического сада), Асколяно, Раццо, Кореджиоло (средиземноморского происхождения) и подвид O. europaea subsp. cuspidatа (Wall. and G. Don) Cif. Все растения достигли состояния полного плодоношения. С 2015 по 2018 гг. проводили визуальную оценку состояния растений после понижения температуры воздуха до отрицательных значений и в конце холодного периода, с учетом рекомендаций В.М. Бурдасова [13].

Для определения влияния отрицательных температур на состояние фотосинтетического аппарата генотипов O. europaea с различной степенью морозостойкости была проведена серия экспериментов по искусственному промораживанию однолетних побегов в течение 6 часов при температуре, близкой к значению абсолютного минимума на ЮБК –15°С. Опыты осуществляли в климатической камере Votsсh VT 4004 (“Vötsch Industrietechnik GmbH”, Германия) в период максимальной вероятности наступления морозов на ЮБК (третья декада января), с предварительной закалкой при 0°С не менее 6 часов. Градиент изменения температуры в камере составил 2°С в час [14, с. 4–6].

Интенсивность флуоресценции хлорофилла (ИФХ) измеряли с помощью портативного хронофлуориметра Флоратест (Институт кибернетики НАН Украины) [15]. Для интегральной оценки состояния фотосинтетического аппарата анализировали следующие показатели фотоиндукции флуоресценции [16, 17]: F0 – базовый уровень флуоресценции, зависящий от потерь энергии возбуждения во время миграции по пигментной матрице, а также от содержания молекул хлорофилла, не имеющих функциональной связи с реакционными центрами; Fpl – уровень флуоресценции в момент достижения ее временного замедления; Fm – максимальное значение флуоресценции; Fst – стационарный уровень флуоресценции, отмечаемый через три минуты после момента освещения – показатель количества хлорофиллов, не принимающих участия в передаче энергии на реакционные центры. В качестве расчетных параметров флюоресценции использовали: вариабельную флуоресценцию Fv = Fm – F0 (индикатор фотохимических окислительно-восстановительных процессов); характеристику тепловой диссипации энергии возбужденных молекул хлорофилла (Fm – Fst)/Fst; относительную фотосинтетическую активность (Fm – Fst)/Fm; коэффициент спада флуоресценции, эффективность квантового выхода фотосинтеза Fv/Fst (индекс жизнеспособности); эффективность световой фазы фотосинтеза Fv/Fm; количество невосстановленных Qа в реакционных центрах ФС II (Fpl – F0)/Fv.

Биохимические показатели определяли по общепринятым методикам: содержание пролина – по модифицированной методике Чинарда с использованием нингидринового реактива [18], суммы фенольных веществ – спектрофотометрическим методом с использованием реактива Фолина-Чокальтеу [19, с. 35–40]. Активность каталазы (КФ 1.11.1.6) определяли титриметрическим методом [20, с. 72], полифенолоксидазы (КФ 1.14.18.1) – колориметрически в присутствии пирокатехина и п-фенилендиамина [20, с. 43–46], с использованием спектрофотометра Evolution 220 UV/VIS (“Thermo Scientific”, США).

Компонентный состав фенольных соединений определяли методом высокоэффективной жидкостной хроматографии [21] на хроматографе Dionex UltiMate 3000 (“Thermo Scientific”, США) с диодноматричным детектором DAD-3000. Для проведения анализа была использована аналитическая хроматографическая колонка ZORBAX Eclipse Plus C18, 4.6 м × 250 мм × 5 мкм. Применяли градиентный режим элюирования. Подвижная фаза В – ацетонитрил, С – 0.1% раствор муравьиной кислоты в деионизированной воде: 0–5 мин 5% В, 5–35 мин – подъем от 5 до 30% В, 35–40 мин подъем от 30 до 90% В, 40–41 мин подъем до 100% В, 41–46 мин – 100% В, 46–51 мин снижение от 100% В до 5% В, 51–55 мин 5% В. Скорость потока 0.7 мл/мин. Температура термостата колонок 400°С. Объем пробы 7 мкл. Идентификацию пиков производили на основании совпадения времени удерживания аналита и стандартного образца, а также совпадения УФ-спектров. Расчет количественного содержания индивидуальных компонентов производили по калибровочным графикам зависимости площади пика от концентрации вещества, построенным по растворам индивидуальных веществ. В качестве стандартов использовали лютеолин-7-О-глюкозид, апигенин-7-О-глюкозид, олеуропеин и рутин (“Sigma-Aldrich”, США). Для обеспечения однородности результатов концентрации суммы фенольных соединений и отдельных компонентов рассчитывали в пересчете на сырой вес.

Физиолого-биохимические эксперименты проводили в 3-кратной биологической и в 3-кратной аналитической повторностях. Каждый эксперимент был повторен 2 раза. Для статистической обработки и факторного анализа (ANOVA) использовали программы MS Excel 2007 и Statistica 6.0. Достоверность различий между вариантами рассчитывали по t-критерию Стьюдента при 5% уровне значимости. В таблицах и на графиках представлены средние значения определений и их стандартные ошибки.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

В результате многолетнего изучения устойчивости O. europaea к действию отрицательных температур определена степень морозостойкости и ее изменение в течение холодного периода на ЮБК. Установлено, что изучаемые генотипы различаются по степени устойчивости: относительно устойчивым оказался сорт Никитская, сорта Асколяно, Кореджиоло, Раццо проявляли более низкую морозостойкость, а подвид O. еuropаea subsp. cuspidata – минимальную. Резистентность к действию отрицательных температур у O. еuropаea в течение холодного периода на ЮБК динамична. Ее максимум приходится на вторую половину декабря – начало января. Негативное влияние на реализацию потенциальной морозостойкости оказывают теплые погодные условия в осенне-зимний период (среднесуточная температура +7…+10°С), поскольку они способствуют позднему завершению ростовых процессов. Анализ повреждений, вызванных температурой –15°С (в контролируемых условиях), которая соответствует значению абсолютного минимума на ЮБК, показал, что у сортов маслины их интенсивность различна. В большей степени чувствительными к такому температурному воздействию оказались сорта Кореджиоло, Асколяно, Раццо и подвид O. еuropаea subsp. cuspidatа. У морозостойкого сорта Никитская наблюдались повреждения листьев (в пределах 10–15% от их количества), расположенных в базальной части однолетнего побега и единичные случаи обмерзания апикальной части побегов. У сортов Кореджиоло, Асколяно, Раццо обмерзание составило 90, 60 и 80% листьев, соответственно. Наиболее значительные морозные повреждения, вызванные действием указанной температуры, были у подвида O. еuropаea subsp. cuspidatа: практически полное обмерзание листвы, нарушение целостности камбия и проводящей системы, распространившееся в базипетальном направлении по побегу до 10–12 см. Анализ научной литературы показал, что исследования влияния температурного стресса на фотосинтетическую активность и кинетику флуоресценции многочисленны. В настоящее время установлено, что низкотемпературный стресс связан с уменьшением рециклирования фосфатов и фотофосфорилирования, замедлением фотосинтетического транспорта электронов и возрастанием вероятности фотоингибирования [22–24]. В связи с выше сказанным, нами была проведена серия экспериментов по оценке состояния фотосинтетического аппарата генотипов O. europaea с различной степенью морозостойкости после действия температуры –15°С (табл. 1, рис. 1).Параметры кривых ИФХ в контрольном варианте (до воздействия отрицательной температуры) у слабоустойчивых сортов O. europaea – Кореджиоло и Асколяно, а также подвида O. europaea subsp. cuspidatа по уровню базовой флуоресценции имели близкие значения. Максимальное значение F0 отмечено у сорта Раццо, что свидетельствует о существенных затратах энергии возбуждения и сравнительно большем количестве молекул хлорофилла, не связанных с реакционными центрами. Морозостойкий сорт Никитская по этому параметру занимает промежуточное положение. Существенные различия у генотипов O. europaea выявлены в уровне максимальной флуоресценции (Fm). Самым низким значением параметра Fm характеризовался подвид O. europaea subsp. cuspidatа, а высоким – сорта Никитская и Раццо. Коэффициент спада флуоресценции у всех изучаемых сортов в контрольном варианте не выходил за пределы нормы витальности. Аналогичная картина отмечена при анализе стационарного уровня флуоресценции: максимальные значения этого параметра наблюдались у сортов Никитская и Раццо, а минимальные – у Асколяно и подвида O. europaea subsp. cuspidatа. Сравнение параметров Fm и Fst до воздействия низкотемпературного фактора позволяет сделать обоснованное предположение о том, что в фотосинтетическом аппарате неустойчивых к отрицательным температурам генотипов (например, подвида O. europaea subsp. cuspidatа) большая часть хлорофилла в пределах фотосистемы входит в реакционные центры. У морозостойкого сорта Никитская соотношение этих параметров значительно выше, что, вероятно, связано с наличием некоторого “пула” хлорофиллов, обеспечивающих стабильность фотосинтетических процессов в стрессовых условиях. Максимальные значения относительной фотосинтетической активности ((Fm – Fst)/Fst) наблюдались у сортов Раццо и Никитская.

Таблица 1.  

Изменение параметров ИФХ (в отн. ед.) листьев представителей O. europaea под влиянием отрицательной температуры (–15°С; 6 ч)

Генотип F0 Fpl Fm Fst Fv (Fm – Fst)/Fst (Fm – Fst)/Fm Fv/Fst Fv/Fm (Fpl – F0)/Fv
Контроль
O. europaea ssp. cuspidatа 229 ± 6ж 320 ± 5к 501 ± 9и 250 ± 6к 272 ± 7и 1.01 ± 0.20в 0.50 ± 0.02г 1.08 ± 0.02з 0.54 ± 0.02в 0.33 ± 0.01г
Асколяно 272 ± 8г 501 ± 9д 938 ± 11д 357 ± 9е 666 ± 8е 1.62 ± 0.31б,  в 0.62 ± 0.03б 1.86 ± 0.04д 0.75 ± 0.03а 0.34 ± 0.01г
Раццо 400 ± 5а 997 ± 10а 1872 ± 21а 576 ± 9а 1472 ± 12а 2.25 ± 0.20а 0.69 ± 0.01а 2.56 ± 0.05а 0.79 ± 0.01а 0.41 ± 0.04в
Кореджиоло 264 ± 9г 576 ± 8г 1080 ± 25г 392 ± 7г 816 ± 10г 1.76 ± 0.12б 0.64 ± 0.02б 2.08 ± 0.10в 0.76 ± 0.02а 0.38 ± 0.01в
Никитская 325 ± 4б 736 ± 6б 1530 ± 21б 496 ± 8б 1205 ± 13б 2.08 ± 0.31а, б 0.68 ± 0.02а, б 2.43 ± 0.20б 0.77 ± 0.03а 0.34 ± 0.01г
Сразу после действия температуры –15°С
O. europaea ssp. cuspidatа 95 ± 2.4и 102 ± 5л 113 ± 3м 111 ± 6м 18 ± 2м 0.20 ± 0.10д 0.02 ± 0.01в 0.1 ± 0.016м 0,16 ± 0.01ж 0,39 ± 0.02в
Асколяно 240 ± 4е 432 ± 4ж 768 ± 5е 304 ± 8з 528 ± 9ж 1.52 ± 0.22б, в 0.60 ± 0.03б, в 1.74 ± 0.04е 0.69 ± 0.02б 0.36 ± 0.02в, г
Раццо 250 ± 6е 309 ± 9к 346 ± 7л 282 ± 9и 96 ± 4л 0.23 ± 0.01д 0.18 ± 0.01е 0.34 ± 0.02л 0.28 ± 0.01е 0.61 ± 0.03а
Кореджиоло 300 ± 5в 456 ± 5е 560 ± 9ж 376 ± 6д 260 ± 8и 0.49 ± 0.01г 0.32 ± 0.02д 0.69 ± 0.01и 0.46 ± 0.02г 0.60 ± 0.01а
Никитская 324 ± 8б 650 ± 8в 1046 ± 12г 373 ± 8д 722 ± 9д 1.80 ± 0.22б 0.64 ± 0.03б 1.93 ± 0.21г 0.69 ± 0.03б 0.45 ± 0.01б
Через 24 часа
O. europaea ssp. cuspidatа * * * * * * * * * *
Раццо * * * * * * * * * *
Асколяно 17 6 ± 10 з 336 ± 6и 528 ± 10з 224 ± 4л 352 ± 6з 1.36 ± 0.21в 0.57 ± 0.01в 1.57 ± 0.21ж 0.67±0.03б 0.45 ± 0.01б
Кореджиоло 256 ± 7г, е 352 ± 9з 416 ± 8к 336 ± 7ж 160 ± 5к 0.24 ± 0.02д 0.19 ± 0.01е 0.48 ± 0.01к 0.38 ± 0.01д 0.60 ± 0.02а
Никитская 304 ± 5в 656 ± 10в 1168 ± 13в 416 ± 8в 864 ± 8в 1.81 ± 0.11б 0.64 ± 0.01б 2.08 ± 0.21в 0.74 ± 0.06б 0.41 ± 0.01в

Примечание. Приведены средние арифметические значения полученных величин и их стандартные ошибки. Достоверные различия на уровне P < 0.05 отмечены разными буквами. * – Исследования не проводились в связи с гибелью листа.

Рис. 1.

Индукционные кривые флуоресценции хлорофилла листьев представителей Olea europaea. 1 – O. europaea spp. cuspidata, 2 – Кореджиоло, 3 – Асколяно, 4 – Никитская, 5 – Раццо.

Параметр (Fpl – F0)/Fv, соответствующий количеству невосстановленных Qа в реакционных центрах ФС II, у всех изучаемых генотипов O. europaea в контрольном варианте имел близкие значения. Параметр Fv/Fm, определяющий эффективность световой фазы фотосинтеза, у сортов O. europaea не имел существенных различий до воздействия отрицательной температуры. В то же время, по сравнению с сортами, у подвида O. europaea subsp. cuspidatа этот показатель был ниже в среднем на 30%.

Анализ параметров ИФХ у генотипов O. europaea показал, что их фотосинтетическая активность имеет сортовые особенности. Наиболее значительные отличия по форме кривой ИФХ и ее характеристикам выявлены у подвида O. europaea subsp. cuspidatа.

Действие температуры –15°С в течение 6 ч привело к изменению параметров ИФХ у всех изучаемых объектов. У подвида O. europaea subsp. cuspidatа и сорта Раццо отмечено чрезвычайное снижение базового уровня флуоресценции – на 58.52 и 37.57%, соответственно, что свидетельствует о необратимых процессах, вероятно, связанных с деструкцией хлорофилла. У этих же генотипов выявлено резкое падение относительной фотосинтетической активности в результате развития низкотемпературного стресса на 80.19 и 89.78%, соответственно. Наличие необратимых нарушений в фотосинтетическом аппарате у подвида O. europaea subsp. cuspidatа и сорта Раццо подтверждается значениями коэффициента спада флуоресценции (индекса жизнеспособности) и отсутствием выраженных пиков на кривой ИФХ. У сорта Кореджиоло действие отрицательной температуры также привело к снижению максимального уровня флуоресценции (на 48.14%), что может быть связано с разрушением светособирающих комплексов. При этом практически не изменилось количество молекул хлорофилла, не принимающих участия в передаче энергии к реакционным центрам (Fst). Однако наблюдалось снижение более чем на 50% таких параметров, как относительная фотосинтетическая активность, эффективность световой фазы и коэффициента спада флуоресценции, ниже витальной нормы, что свидетельствует об инактивации фотосинтеза у этого сорта. Подтверждением развития стрессового состояния сразу после окончания низкотемпературного воздействия у сортов Асколяно и Никитская является снижение максимума и коэффициента спада флуоресценции, характеризующего квантовый выход фотосинтеза. Однако эти изменения не являлись критическими: Fv/Fst ≥ 1.50–2.50 [16]. Также у этих сортов отмечено незначительное снижение эффективности световой фазы фотосинтеза (на 8% у сорта Асколяно и на 10.39% у сорта Никитская). Действие отрицательной температуры также оказало влияние на уровень относительной фотосинтетической активности, причем эти изменения у сорта Никитская составили 13.46%, что почти в два раза больше, чем у сорта Асколяно. Выявленные изменения, с нашей точки зрения, характеризуют наличие обратимых нарушений в течение световой фазы фотосинтеза, более выраженных у сорта Асколяно. У морозостойкого сорта Никитская более чувствительными к действию отрицательных температур оказались процессы восстановления реакционных центров c окисленным Qa – их количество увеличилось на 32.35%, в то время как у более чувствительного к отрицательным температурам сорта Асколяно оно практически не изменилось.

Анализ характера изменений параметров и формы кривой ИФХ через 24 часа, после окончания низкотемпературного воздействия, показал, что у сорта Кореджиоло они были необратимыми. У сорта Асколяно большая часть параметров продолжала снижаться; в частности, наблюдалось замедление фотохимических окислительно-восстановительных процессов, при этом происходило увеличение количества невосстановленных реакционных центров. Тем не менее, изменения ключевых параметров, таких как относительная фотосинтетическая активность, коэффициент спада флуоресценции, а также индекс жизнеспособности, были незначительными. Это, с нашей точки зрения, связано с наличием у сорта Асколяно физиолого-биохимических механизмов, замедляющих скорость нарастания стрессового состояния. В отличие от сорта Асколяно, у морозостойкого сорта Никитская изменения параметров ИФХ носили другой характер. В данном случае наблюдалось возрастание уровня максимальной, стабилизирующей и вариабельной флуоресценции, а также параметров Fv/Fst и Fv/Fm, определяющих эффективность световой фазы фотосинтеза. С нашей точки зрения, полученные результаты говорят не только о снижении уровня стресса у этого сорта O. europaea, но и об активации репарационных механизмов, нормализующих работу фотосинтетического аппарата после окончания действия стрессора. Подтверждением этому является тот факт, что у морозостойкого сорта Никитская через 24 часа после окончания действия температуры некоторые параметры ИФХ (F0, Fv/Fm, (Fpl – F0)/Fv) практически не отличались от их значений в контроле.

Анализ активности каталазы и полифенолоксидазы в листьях маслины до воздействия отрицательных температур показал, что изучаемые сортообразцы имеют существенные различия в данных характеристиках. Так, листья сорта Асколяно обладают максимальной активностью каталазы и минимальной – полифенолоксидазы. Самая низкая каталазная и высокая полифенолоксидазная активность отмечена у неустойчивого подвида O. europaea subsp. cuspidata. Остальные сорта O. europaea характеризовались близкими значениями активности этих ферментов, за исключением сорта Раццо, у которого полифенолоксидазная активность в некоторой степени снижена (табл. 2).

Таблица 2.  

Активность ферментов в листьях Olea europaea до и после действия температуры –15°С

Генотип Вариант опыта Активность каталазы,
мл О2/(г мин) 		Активность полифенолоксидазы,
усл. ед./(г с)
Асколяно Контроль 6.80 ± 0.17а 0.050 ± 0.002е
Опыт 5.53 ± 0.14б 0.050 ± 0.002е
O. europaea ssp. cuspidata Контроль 3.83 ± 0.10д 0.200 ± 0.006б
Опыт 1.28 ± 0.03ж 0.184 ± 0.005в
Кореджиоло Контроль 4.68 ± 0.11в 0.202 ± 0.006б
Опыт 1.26 ± 0.04ж 0.251 ± 0.008а
Раццо Контроль 4.67 ± 0.12в 0.084 ± 0.003в
Опыт 3.40 ± 0.10е 0.100 ± 0.004д
Никитская Контроль 4.55 ± 0.13г 0.184 ± 0.005в
опыт 4.68 ± 0.11в 0.117 ± 0.004г

Примечание. Приведены средние арифметические значения полученных величин и их стандартные ошибки. Достоверные различия на уровне P < 0.05 отмечены разными буквами.

В результате действия температуры –15°С наблюдалось снижение активности каталазы у всех генотипов, за исключением морозостойкого сорта Никитская. Самое значительное падение активности этого фермента выявлено у чувствительных к действию отрицательных температур сорта Кореджиоло и подвида O. europaea subsp. cuspidata, более чем на 60%. Изменение активности полифенолоксидазы в опытных вариантах происходило разнонаправленно. В листьях сортов Раццо и Кореджиоло она возрастала на 19 и 24% соответственно, у подвида O. europaea subsp. cuspidata и сорта Никитская – падала на 8% и 37% соответственно, а у Асколяно оставалась неизменной.

По литературным данным, развитие адаптационного синдрома у O. europaea при нарастающем действии отрицательных температур сопровождается увеличением активности антиоксидантных ферментов (каталазы, пероксидазы, аскорбатпероксидазы) и полифенолоксидазы [9, 12, 25]. В то же время имеется информация о снижении активности каталазы в листьях маслины при температуре ниже –10°С [26], что согласуется с полученными нами данными. В нашем эксперименте активность полифенолоксидазы возрастала не у всех исследуемых генотипов. Выявленные противоречия, вероятно, связаны с произрастанием конкретных генотипов на северной границе культигенного ареала маслины, а также со скоростью понижения температуры и длительностью температурного воздействия в условиях лабораторного опыта. Также существенное значение имеет факт, что начальные повреждающие температуры для многих сортов находятся в пределах –8…–10°С, а температуры –12°С и ниже являются критическими [27].

При исследовании содержания протекторных соединений установлено, что в контрольном варианте содержание пролина колебалось в пределах 43–72 мкг/г, суммы фенольных соединений – 1036–1332 мг/100 г, лютеолин-7-О-глюкозида – 235–345 мг/100 г, рутина – 79–114 мг/100 г, олеуропеина – 450–1850 мг/100 г (табл. 3). Максимальное содержание пролина выявлено у сорта Никитская, суммы фенольных соединений – у подвида O. europaea subsp. cuspidata, лютеолин-7-О-глюкозида, рутина и олеуропеина – у сорта Кореджиоло.

Таблица 3.  

Содержание протекторных соединений в листьях маслины Olea europaea до и после действия температуры –15°С

Генотип Пролин,
мкг/г 		Сумма ФС, мг/100 г Лютеолин-7-О-глюкозид, мг/100 г Рутин,
мг/100 г 		Олеуропеин,
мг/100 г
Асколяно Контроль 51.6 ± 1.52г 1249 ± 38б 235 ± 24б 86.8 ± 8.7в 611 ± 61в
Опыт 43.0 ± 1.08д 1166 ± 35в 293 ± 29а,б 81.0 ± 8.0в 882 ± 80б
O. europaea ssp. cuspidata Контроль 64.2 ± 1.96б 1332 ± 33а 241 ± 24б 81.5 ± 8.1в 674 ± 68в
Опыт 34.2 ± 1.03е 766 ± 21е 187 ± 19в 135.0 ± 13.5а,б 307 ± 31д
Кореджиоло Контроль 42.8 ± 1.07д 1036 ± 28г 345 ± 35а 114.0 ± 11.0 б 1850 ± 185а
Опыт 19.3 ± 0.48ж 800 ± 25е 247 ± 25б 151.0 ± 15.1а 702 ± 70в
Раццо Контроль 55.6 ± 1.67в 1232 ± 36б 330 ± 33а 112.5 ± 1.3б 1840 ± 184а
Опыт 32.1 ± 0.96е 916 ± 23д 241 ± 24б 143.0 ± 14.3а 680 ± 68в
Никитская Контроль 72.8 ± 1.82а 1216 ± 30б 257 ± 26б 79.0 ± 7.9в 450 ± 45г
Опыт 42.8 ± 1.05д 1248 ± 31б 71.0 ± 7.1г 54.9 ± 5.5г 202 ± 20е

Примечание. Приведены средние арифметические значения полученных величин и их стандартные ошибки. Достоверные различия на уровне Р < 0.05 отмечены разными буквами.

Воздействие отрицательных температур приводило к снижению уровня пролина на 17–55% в листьях всех исследуемых генотипов. Наиболее значительно концентрация пролина падала у сорта Кореджиоло. Такая картина является типичной реакцией маслины на низкотемпературный стресс. Поскольку пролин в качестве криопротектора участвует в неферментативной регуляции ПОЛ, то и снижение его концентрации может быть обусловлено реализацией защитных реакций [26].

Неоднократно отмечалась, что роль фенольных соединений в устойчивости растений к отрицательным температурам связана с их высокой биологической активностью и широким разнообразием функций в растительном организме, в частности – с участием в процессах регуляции роста и неферментативной защиты растения от АФК [28]. В настоящее время известно о высоких концентрациях фенольных соединений в листьях и плодах маслины, которые представлены фенольными кислотами и спиртами, флавоноидами и секо-иридоидами [29]. При этом одним из важнейших метаболитов маслины является олеуропеин [30]. Однако большая часть исследований этого соединения посвящена его фармакологическим свойствам. Информация о роли олеуропеина непосредственно в организме растений O. europaea отрывочна и противоречива. В частности, испанскими учеными констатируется связь содержания олеуропеина и его предшественников гидрокситирозола и тирозола со степенью устойчивости некоторых сортов маслины к низкотемпературному стрессу [9, 25].

Для выявления значения фенольных соединений в морозостойкости маслины изучено изменение концентрации данной группы веществ в контролируемых условиях. Установлено, что суммарное содержание фенольных соединений снижалось у всех слабоморозостойких сортов и O. europaea subsp. cuspidata на 7–42%, а у морозостойкого сорта Никитская оставалось неизменным. Также происходили значительные изменения концентраций индивидуальных фенольных соединений. Так, содержание лютеолин-7-О-глюкозида и олеуропеина падало у всех генотипов, за исключением сорта Асколяно. Содержание рутина росло у сорта Раццо и подвида O. europaea subsp. cuspidata, у сортов Кореджиоло и Никитская падало, а у сорта Асколяно оставалось неизменным.

На основе полученных данных можно предположить участие как суммы фенольных соединений, так и их индивидуальный вклад в механизмы устойчивости маслины к отрицательным температурам. Снижение концентрации этих веществ отмечено практически у всех сортов сразу после воздействия стрессового фактора. Вероятно, что действие критических температур приводит к активному расходованию данной группы соединений растительным организмом в качестве антиоксидантов.

Результаты проведенных исследований позволяют заключить, что действие температуры, близкой к значению абсолютного минимума на ЮБК, на слабоморозостойкие генотипы O. europaea приводит к инактивации фотосинтетических процессов сразу после окончания действия стрессора. Наиболее чувствительным к низкотемпературному воздействию у устойчивого сорта Никитская и слабоустойчивого Асколяно оказались параметры, характеризующие эффективность световой фазы фотосинтеза и относительную фотосинтетическую активность. Однако у этих сортов изменения параметров ИФХ носили обратимый характер, о чем свидетельствуют значения индекса жизнеспособности. Необходимо отметить, что в характеристиках флуоресценции до стрессового воздействия у изучаемых представителей O. europaea также выявлены различия. В частности, сорта с низкой морозостойкостью и подвид O. europaea subsp. cuspidatа значительно отличались от морозостойкого сорта Никитская как по уровню начальной флуоресценции, так и по ее максимальному значению. Эти отличия могут быть связаны с сортовыми особенностями и позволяют предположить, что высокая чувствительность фотосинтетического аппарата к действию отрицательных температур у сортов Раццо, Кореджиоло и подвида O. europaea subsp. cuspidatа связана с большей потерей энергии возбуждения во время ее транспортировки от светособирающих комплексов, по сравнению с морозостойким сортом Никитская. Отдельно следует отметить, что сорт Никитская значительно отличается по соотношению параметров Fm и Fst, что показывает наличие некоторого “пула” хлорофилла, обеспечивающего относительную стабильность фотосинтетических процессов в стрессовых условиях. Установлено, что у спустя 24 часа после окончания стрессового воздействия у слабоустойчивого сорта Асколяно и морозостойкого сорта Никитская интенсивность изменений параметров ИФХ уменьшилась, что, вероятно, связано со стабилизацией фотосинтетических процессов. При этом у резистентного сорта Никитская через сутки после действия отрицательной температуры базовый уровень флуоресценции и эффективность световой фазы фотосинтеза практически не отличались от контрольных.

Исследования изменений в активности окислительно-восстановительных ферментов и содержания некоторых биологически активных веществ показали, что развитие низкотемпературного стресса сопровождается специфическими изменениями как в работе ферментов, так и в концентрации фенольных соединений и пролина. Выявлено, что у чувствительных к действию отрицательных температур генотипов O. europaea активность каталазы существенно снизилась, а у морозостойкого сорта Никитская практически не изменилась. Поскольку отрицательные температуры способствуют активации процессов образования АФК, а в нейтрализации их токсичных продуктов принимает участие каталаза, то сохранение ее нормальной активности имеет существенное значение для поддержания гомеостаза в растительном организме в целом и, в частности, для сохранения фотосинтетической функции. Изменения полифенолоксидазной активности в условиях действия критических температур происходили разнонаправленно, что, возможно, связано как с индивидуальными сортовыми особенностями, так и со степенью криорезистентности.

Результаты исследования влияния отрицательных температур на концентрацию фенольных соединений и пролина в тканях листьев представителей O. europaea позволили сделать вывод о связи изменения их содержания с реализацией защитных механизмов. Установлено, что у всех изучаемых генотипов происходит снижение содержания пролина, суммы фенольных соединений и одного из ключевых веществ в метаболизме маслины европейской – олеуропеина, сразу после окончания действия температуры –15°С. Полученные данные свидетельствуют об участии этих веществ в первичных неспецифических реакциях на действие стрессора.

Таким образом, в результате проведенных исследований получена характеристика морозостойкости генотипов маслины в условиях Южного берега Крыма и выявлены особенности работы фотосинтетического аппарата, изменения ферментативной активности и содержания протекторных веществ в листьях данной культуры в связи со степенью устойчивости к действию отрицательных температур.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов. Настоящая статья не содержит каких-либо исследований с участием людей и животных в качестве объектов исследований.

Список литературы

  1. Adams W.W.I., Demmig-Adams B., Rosenstiel T.N., Ebbert V. Dependence of photosynthesis and energy dissipation activity upon growth form and light environment during the winter // Photosynth. Res. 2001. V. 67. P. 51. https://doi.org/10.1023/A:1010688528773

  2. Demming-Adams B. Carotenoides and photoprottction in plants. A role for xanthophyll zeaxanthin // Biochim. Biophys. Acta. 1990. V. 10. P. 2401. https://doi.org/10.1016/0005-2728(90)90088-L

  3. Гаевский Н.А., Моргун В.Н. Использование переменной и замедленной флуоресценции хлорофилла для изучения фотосинтеза растений // Физиология растений. 1993. Т. 40. С. 119.

  4. Бородин И.Ф., Будаговский А.В., Будаговская О.Н., Будаговский И.А., Судник Ю.А. Применение эффекта фотоиндуцированной изменчивости оптических свойств хлорофиллсодержащих тканей для диагностики функционального состояния растений // Доклады РАСХН. 2008. № 5. С. 62.

  5. Гольцев В.Н., Кузманова М.А., Каладжи Х.М., Аллахвердиев С.И. Переменная и замедленная флуоресценция хлорофилла а – теоретические основы и практическое приложение в исследовании растений. Ижевск–Москва: Институт компьютерных исследований, 2014. 220 с.

  6. Levitt J. Responses of Plants to Environmental Stresses. New York: Academic Press, 1980. 497 p.

  7. Lin S.Z., Zhang Z.Y., Liu W.F., Lin Y.Z., Zhang Q., Zhu B.Q. Role of glucose-6-phosphate dehydrogenase in freezing-induced freezing resistance of Populus suaveolens // J. Plant Physiol. Mol. Biol. 2005. V. 31. P. 34.

  8. Mittler R. Oxidative stress, antioxidants and stress tolerance // Trends Plant Sci. 2002. V. 7. P. 405. https://doi.org/10.1016/s1360-1385(02)02312-9

  9. Ortega-García F., Peragón J. The response of phenylalanine ammonia-lyase, polyphenol oxidase and phenols to cold stress in the olive tree (Olea europaea L. cv. Picual) // J. Sci. Food Agric. 2009. V. 89. P. 1565. https://doi.org/10.1002/jsfa.3625

  10. Bartolozzi F., Rocchi P., Camerini F., Fontanazza G. Changes of biochemical parameters in olive (Olea europaea L.) leaves during an entire vegetative season, and their correlation with frost resistance // Acta Hortic. 1999. V. 474. P. 435. https://doi.org/10.17660/ActaHortic.1999.474.89

  11. Roselli G., Venora G. Relationship between stomatal size and winter hardiness in the olive // Acta Hortic. 1990. V. 286. P. 89. https://doi.org/10.17660/ActaHortic.1990.286.15

  12. Cansev A., Gulen H., Eris A. Cold-hardiness of olive (Olea europaea L.) cultivars in cold-acclimated and non-acclimated stages: seasonal alteration of antioxidative enzymes and dehydrin-like proteins // J. Agric. Sci. 2009. V. 147. P. 51. https://doi.org/10.1017/S0021859608008058

  13. Бурдасов В.М. Методические указания по определению элементов зимостойкости садовых растений. Москва: ВАСХНИЛ, 1984. 20 с.

  14. Лищук А.И. Физиологические и биофизические методы в селекции плодовых культур: методические рекомендации. Москва: ВАСХНИЛ, 1991. 58 с.

  15. Romanov V.A., Galelyuka I.B., Sarakhan Ie.V. Portable fluorometer Floratest and specifics of its application // Sensor Electronics and Microsystem Technology. 2010. V. 1(7). № 3. P. 39.

  16. Будаговская О.Н., Будаговский А.В., Будаговский И.А. Лазерная диагностика растений: методические рекомендации. Мичуринск: “Мичуринск”, 2010. 54 с.

  17. Stirbet A., Govindjee J. On the relation between the Kautsky effect (chlorophyll a fluorescence induction) and Photosystem II: Basics and applications of the OJIP fluorescence transient // J. Photochem. Photobiol. B. 2011. V. 104. P. 236. https://doi.org/10.1016/j.jphotobiol.2010.12.010

  18. Андрющенко В.К., Саянова В.В., Жученко А.А. Модификация метода определения пролина для выявления засухоустойчивых форм Lycopersicon Tourn // Изв. АН Молд. ССР. Сер. биол. и хим. наук. 1981. № 4. С. 55.

  19. Методы технохимического контроля в виноделии / Под ред. В.Г. Гержиковой. Симферополь: Таврида, 2002. 259 с.

  20. Ермаков А.И. Методы биохимического исследования растений. Ленинград: Колос, 1987. 456 с.

  21. Plazonic A., Bucar F., Males Z., Mornar A., Nigovi B., Kujundzij N. Identification and quantification of flavonoids and phenolic acids in burr parsley (Caucalis platycarpos L.), using high-performance liquid chromatography with diode array detection and electrospray ionization mass spectrometry // Molecules. 2009. V. 14. № 7. P. 2466. https://doi.org/10.3390/molecules14072466

  22. Kalaji H., Govindjee, Goltsev V., Bosa K., Allakhverdiev S.I., Strasser R. Experimental in vivo measurements of light emission in plants: A perspective dedicated to David Walker // Photosynth. Res. 2012. V. 114. P. 69. https://doi.org/10.1007/s11120-012-9780-3

  23. Goltsev V., Zaharieva I., Chernev P., Kouzmanova M., Kalaji H.M., Yordanov I., Krasteva V., Alexandrov V., Stefanov D., Allakhverdiev S.I., Strasser R.J. Drought-induced modifications of photosynthetic electron transport in intact leaves: Analysis and use of neural networks as a tool for a rapid non-invasive estimation // Biochim. Biophys. Acta. 2012. V. 1817. № 8. P. 1490. https://doi.org/10.1016/j.bbabio.2012.04.018

  24. Yordanov I., Stefanov D., Krasteva V., Gourmanova M., Goltsev V. Drought stress responses in plants – molecular biology, physiology and agronomical aspects // J. Agric. Sci. 2012. V. 4. P. 7.

  25. Ortega-Garcıa F., Peragon, J. Phenol metabolism in the leaves of the olive tree (Olea europaea L.) cv. Picual, Verdial, Arbequina, and Frantoio during Ripening // J. Agric. Food Chem. 2010. V. 58. P. 12440. https://doi.org/10.1021/jf102827m

  26. Hashempour A., Ghasemnezhad M., Fottohi Ghazvini R., Sohani M.M. The physiological and biochemical responses to freezing stress of olive plants treated with salicylic acid // Physiol. Plant. 2014. V. 61. P .476. https://doi.org/10.1134/S1021443714040098

  27. Губанова Т.Б., Браилко В.А., Палий А.Е. Морозостойкость некоторых вечнозеленых видов семейств Oleaceae и Caprifoliaceae на Южном берегу Крыма // Бюллетень Никитского ботанического cада. 2017. Вып. 125. С. 103.

  28. Saibandith B., Spencer J.P., Rowland I.R., Commane D.M. Olive polyphenols and the metabolic syndrome // Molecules. 2017. V. 22. P. 1082. https://doi.org/10.3390/molecules22071082

  29. Silva S., Gomes L., Leitao F., Coelho A.V., Boas L.V. Phenolic compounds and antioxidant activity of Olea europaea L. fruits and leaves // Food Sci. Technol. Int. 2006. V. 12 P. 385. https://doi.org/10.1177/1082013206070166

  30. Karakaya S.N. Olive tree (Olea europaea) leaves: potential beneficial effects on human health // Nutr. Rev. 2009. V. 67. P. 632. https://doi.org/10.1111/j.1753-4887.2009.00248.x

Дополнительные материалы отсутствуют.

Инструменты

следующая статья выпуска предыдущая статья выпуска содержание выпуска

Физиология растений

Архивы выпусков Информация о журнале Отправить рукопись в журнал