Физиология растений, 2020, T. 67, № 5, стр. 475-481

ВВЕДЕНИЕ

Фитогормоны регулируют развитие плода на всех этапах онтогенеза, а ключевым гормоном в этом процессе является ИУК [1, 2]. Опыление цветков и последующее оплодотворение вызывают повышение содержания ауксина в завязи, что является сигналом начала роста и развития плода. Неблагоприятные факторы (высокие и низкие температуры, слишком высокая или низкая влажность, недостаточная освещенность и т.д.) нарушают процесс оплодотворения, в результате индукции синтеза ИУК не происходит, что, в свою очередь, приводит к прекращению развития плода и потере урожая. Одним из способов преодоления неблагоприятных для завязывания плодов условий является обработка цветков синтетическими ауксинами, в частности, хлорзамещенными феноксиуксусными кислотами, например, 4-хлорфеноксиуксусной (4-ХФУ). Образовавшиеся в результате такой обработки партенокарпические плоды характеризуются ускоренным развитием и созреванием в сравнении с семенными плодами [3, 4].

Вопрос о механизме действия синтетических ауксинов на процессы роста и развития плода остается открытым. Возможны, по крайней мере, три пути действия синтетических ауксинов на плодообразование: 1) стимуляция синтеза эндогенного ауксина – ИУК, 2) восполнение недостатка эндогенного ауксина за счет синтетического, 3) реализация обеих этих возможностей. В пользу первого пути свидетельствует то, что обработка плода синтетическими ауксинами как на стадии завязывания, так и в период роста способствует повышению уровня эндогенной ИУК, что позволяет бессемянным плодам достигать и даже превосходить массу семенных плодов [5–8].

Принято считать, что эндогенная ИУК является главным гормональным фактором развития партенокарпического плода, а экзогенные ауксины лишь индуцируют аккумуляцию ИУК в завязи [5]. Тем не менее, возможность замены эндогенной ИУК синтетическим ауксином при регуляции онтогенеза плода остается далеко не изученной. Данная работа была проведена для проверки такой возможности. С этой целью в течение всего периода развития плода (от завязывания до созревания) исследовали содержание ИУК в семенных, а ИУК и 4-ХФУ – в партенокарпических плодах и в плодах, у которых центры синтеза ИУК были заменены искусственными источниками ИУК или 4-ХФУ. Плоды из всех вариантов эксперимента сравнивали по скорости роста, периоду развития до полной зрелости, накоплению АБК, продукции этилена и интенсивности дыхания.

ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Работу проводили на растениях томата (Solanum lycopersicum L.) сорта “Сливовидный”, выращенных в почвенной культуре в период с апреля по август при естественном освещении и температуре 18˚С ночью и 28˚С днем в оранжерее Института физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН.

У 8-недельных растений оставляли 2–3 средних цветка в каждой кисти, находившихся на стадии полураскрытого бутона, остальные цветки удаляли. Для получения семенных плодов цветки кастрировали, удаляя венчик и тычиночный круг, а затем вручную опыляли пыльцой, собранной накануне с этих же растений (вариант “опыление”) [9]. Для получения партенокарпических плодов цветки кастрировали, удаляя венчик, тычиночный круг и столбик, а на внешнее основание чашечки микропипеткой наносили 10 мкл водного раствора, содержавшего 1.25 мкг натриевой соли 4-ХФУ (вариант – “обработка 4-ХФУ”). Обработку и опыление проводили в один и тот же день. Возраст собранных для анализа плодов определяли от момента опыления или обработки 4-ХФУ.

На части растений у 10-дневных завязей, развившихся из опыленных цветков, удаляли верхнюю половину. У некоторых из оставшихся на растении половинок удаляли плаценту с семязачатками (рис. 1). На места срезов наносили ланолиновую пасту, содержавшую ИУК (0.5%), 4-ХФУ (0.1%) или чистый ланолин. На срез половинок, из которых не удаляли плаценты с семязачатками, наносили только ланолин.

Рис. 1.

Замена плаценты с семязачатками искусственным источником ауксина. У 10-дневных завязей, развившихся из опыленных цветков, удаляли верхнюю половину. Из оставшейся на растении половины удаляли плаценту с семязачатками. На места среза наносили ланолиновую пасту, содержавшую ИУК (0.5%), 4-ХФУ (0.1%) или чистый ланолин. У половинок плодов, из которых не удаляли плаценту с семязачатками, срез смазывали ланолином.

Измерение выделения этилена и интенсивности дыхания проводили в герметично закрывающихся сосудах объемом от 15 до 500 мл в зависимости от размера плодов. Скорость выделения этилена и интенсивность дыхания определяли газохроматографическим методом [10].

Очистку растительных образцов для последующего количественного анализа ИУК, АБК и 4-ХФУ осуществляли методом твердофазной экстракции. Плоды томата фиксировали жидким азотом и измельчали в 10-кратном объеме охлажденного (–20°С) 80% метанола, содержавшего антиоксидант – 2,6-ди-трет-бутил-4-метилфенол (10 мг/л). Гомогенат фильтровали через стеклянный фильтр GF/F (“Whatman”, Великобритания). Полученный экстракт последовательно очищали сначала на анионообменной колонке – 30х9 мм DEAE Si 100 (“Serva”, ФРГ), затем на колонке C-18 – 30 × × 6 мм Chromosorb LC-7 (“Sigma”, США). Окончательная очистка и разделение образца на фракции, содержавшие ИУК, АБК и 4-ХФУ, происходила на колонке 250 × 4 мм Sephasorb HP Ultrafine (“Pharmacia”, Швеция). Количественное определение АБК в виде метилового эфира, а ИУК и 4-ХФУ в виде пентафторбензиловых эфиров проводили на газовом хроматографе Газохром 1109 (Россия) с детектором по захвату электронов и кварцевой капиллярной колонкой 10 м × 0.53 мм HP-17 (“Hewlett-Packard”, США), с последующим подтверждением результатов анализа методом газовой хроматографии – масс-спектрометрометрии с использованием газового хроматографа НР 5890А с масс-спектрометрическим детектором НР 5970 и кварцевой колонкой 25 м х 0.32 мм НР-5 (“Hewlett-Packard”, США) [11].

На графиках представлены средние арифметические величины из трех биологических повторностей и их стандартные ошибки. Каждая биологическая повторность представляла собой усредненную пробу из 10–60 плодов, собранных с 5–15 растений.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Партенокарпические плоды, образовавшиеся под влиянием 4-ХФУ, росли быстрее, чем семенные, образовавшиеся в результате опыления. Так, максимальную скорость роста у партенокарпических плодов – 1.8 г/сутки – наблюдали на 25 день после обработки 4-ХФУ, а скорость роста семенных плодов достигала максимума в 1.5 г/сутки только на 30 сутки после опыления (рис. 2а). Партенокарпические плоды достигали максимальной массы – 53 г (стадия зеленых выросших плодов) на 45 и созревали на 57 сутки после обработки 4‑ХФУ. Семенные плоды набирали максимальную массу – 45 г на 50 сутки и созревали на 63 день после опыления. Период созревания составлял 12 суток у партенокарпических плодов и 13 суток – у семенных. В течение всего периода развития партенокарпических плодов экзогенный ауксин (4‑ХФУ) присутствовал в их тканях в свободной форме.

Рис. 2.

Скорость накопления сырой массы (а), содержание 4-ХФУ (б), ИУК (в), АБК (г), скорость выделения этилена (д) и поглощения кислорода плодами томата (е). 1 – опыление; 2 – обработка 4-ХФУ. Вставки показывают скорость выделения этилена и поглощения кислорода в первые 4 дня после опыления/обработки.

Нанесенная на чашечки цветков 4-ХФУ быстро поступала в завязь, ее содержание уже через сутки составляло 1 нг/плод. Содержание 4-ХФУ достигало максимального значения (128 нг/плод) на 25 день после обработки цветков 4ХФУ, что совпадало с максимумом скорости роста (рис. 2б). Содержание эндогенной ИУК в завязях резко возрастало уже в первые дни после опыления или обработки цветков 4-ХФУ (рис. 2в). В динамике содержания ИУК наблюдали два максимума. Первый на пятые сутки, причем содержание ИУК (95 нг/плод) в завязях из обработанных 4-ХФУ цветков было в 2 раза больше, чем в завязях из опыленных цветков (43 нг/плод). Второй пик в содержании ИУК совпадал с максимумом в скорости роста плода и приходился на 25 день у партенокарпических (125 нг/плод) и на 30 день у семенных плодов (305 нг/плод).

В завязях неопыленных и необработанных 4‑ХФУ кастрированных цветков содержание ИУК оставалось на исходном, очень низком уровне (менее 1 нг/плод), цветки опадали или образовывали нерастущие, так называемые “сидячие” плоды. Содержание АБК в плодах повышалось по мере их роста, достигая максимума непосредственно перед началом созревания: на 35 сутки у партенокарпических (2.3 мкг/плод) и на 40 сутки – у семенных плодов (2.8 мкг/плод) (рис. 2г).

Обращает на себя внимание параллелизм в изменении выделения этилена и интенсивности дыхания. Исходные завязи из полураскрытых бутонов выделяли 0.02 нл С₂Н₄/плод ∙ ч (рис. 2д) и потребляли 2 мкл О₂/плод · ч (рис. 2е). За первые сутки после опыления выделение этилена завязью увеличивалось в 11 раз, достигая величины 0.22 нл С₂Н₄/плод · ч, а потребление кислорода возрастало в 13.5 раза до 27 мкл О₂/плод · ч. Обработка цветков 4-ХФУ за сутки увеличивала выделение этилена завязью лишь в 3.5 раза до 0.07 нл С₂Н₄/плод · ч и только в 2.5 раза увеличивала потребление кислорода до 5 мкл О₂/плод · ч. Однако к пятым суткам эксперимента завязи цветков, обработанных 4‑ХФУ, выделяли 0.11 нл С₂Н₄/плод · ч и потребляли 120 мкл О₂/плод · ч, т.е. в 2 раза больше, чем завязи из опыленных цветков (0.06 нл С₂Н₄/плод · ч и 60 мкл О₂/плод · ч). Выделение этилена и поглощение кислорода плавно увеличивались по мере роста плодов. Резкое усиление выделения этилена и потребления кислорода происходило после окончания роста плодов в начале созревания. Максимальное выделение этилена и потребление кислорода происходило на стадии розовых плодов: у партенокарпических на 50 сутки и составляло 455 нл С₂Н₄/плод · ч и 2000 мкл О₂/плод · ч, а у семенных плодов на 55 сутки и достигало 352 нл С₂Н₄/плод · ч и 1800 мкл О₂/плод · ч.

Половинки плодов, у которых удаленные плаценты с семязачатками были заменены источниками экзогенного ауксина (ИУК или 4-ХФУ), росли так же, как и половинки, из которых не были удалены плаценты. Рост половинок плодов, лишенных естественных и не получавших искусственные источники ауксинов, был сильно заторможен. У половинок плодов с искусственными источниками 4-ХФУ и ИУК скорость накопления сырой массы достигала наибольшего значения на 30 сутки и составляла 0.5 и 0.45 г/сут, соответственно (рис. 3, 4а).

Рис. 3.

Развитие плодов томата с естественными и искусственными источниками ауксинов. 1 – интактные плоды; 2 – плоды, у которых удалена верхняя половина, но семязачатки оставлены; 3 – плоды, у которых удалена верхняя половина и плацента с семязачатками из оставшейся на растении половины, а на поверхности срезов нанесен чистый ланолин; 4 – то же, что и 3, но ланолин содержал 0.5% ИУК; 5 – то же, что и 3, но ланолин содержал 0.1% 4-ХФУ. Верхний ряд – плоды на 10 сутки, нижний ряд – на 60 сутки после опыления цветков.

Рис. 4.

Скорость накопления сырой массы (а), содержание 4-ХФУ (б), ИУК (в), АБК (г), скорость выделения этилена (д) и поглощения кислорода (е) плодами томата, в которых плаценты с семязачатками заменены искусственными источниками ауксинов (ИУК или 4-ХФУ). 1 – ланолин; 2 – ланолин + 0.5% ИУК; 3 – ланолин + 0.1% 4-ХФУ.

Скорость роста половинок плодов, лишенных плаценты с семязачатками, находилась в прямой зависимости от содержания экзогенных ауксинов, поступавших в них из ланолиновой пасты 4‑ХФУ или ИУК (рис. 4а–в). Следует отметить, что в половинках плодов, лишенных плаценты с семязачатками, 4-ХФУ не была способна индуцировать образование ИУК в течение всего периода роста (рис. 4в). Содержание АБК в половинках плодов с искусственными источниками ауксинов (ИУК или 4-ХФУ) увеличивалось вплоть до начала созревания, однако уровень ее накопления был в несколько раз меньше, чем в семенных плодах. В плодах, лишенных естественных и искусственных источников ауксинов, АБК присутствовала в следовых количествах (рис. 4г).

Характер изменения скорости выделения этилена и интенсивности дыхания был сходным у половинок плодов с искусственными источниками ИУК или 4-ХФУ и интактных плодов: постепенное повышение по мере роста плода сменялось резким подъемом при переходе к созреванию (рис. 2д, е; 4д, е).

У половинок плодов, в которых удаленные плаценты с семязачатками не были заменены искусственными источниками ауксинов, выделение этилена и поглощение кислорода оставалось на низком уровне вплоть до начала созревания, при котором наблюдалось характерное для климактерических плодов повышение выделения этилена и потребления кислорода (рис. 4д, е). Период созревания половинок плодов во всех вариантах эксперимента продолжался 15 суток и завершался к 60 суткам от момента опыления исходных завязей.

ОБСУЖДЕНИЕ

В онтогенезе плода томата можно выделить несколько этапов. Первый этап включает в себя опыление цветка и оплодотворение завязи. Образование зиготы дает старт началу роста и развития плода. Рост завязи начинается с периода клеточного деления (приблизительно, 10–14 суток), сменяющегося периодом роста растяжением образовавшихся клеток (4–7 недель). Достигнув максимальной массы, плоды вступают в стадию созревания (приблизительно, 10–14 суток) [12]. Каждый из этапов регулируется фитогормонами: деление контролируют ИУК и цитокинины, растяжение – ИУК и гиббереллины. Далее при созревании вступают в действие АБК и этилен [13, 14].

Онтогенез плода томата зависит от его способности синтезировать ИУК. Опыление и оплодотворение стимулируют закладку в завязи семязачатков, которые становятся источниками ИУК в развивающемся плоде. ИУК регулирует деление клеток завязи и последующий рост растяжением образовавшихся клеток. Возможно, ее действие, по крайней мере, частично, реализуется через регуляцию синтеза гиббереллинов и цитокининов [15], а также путем стимуляции sink-активности растущего плода [16]. Нарушение процесса опыления препятствует формированию в плоде источника ауксина, что вызывает опадение завязи или образование не растущих так называемых “сидячих” плодов. На практике это может приводить к значительной потере урожая плодов [3]. Обработка цветков синтетическими ауксинами, например 4-ХФУ, позволяет заменить опыление и получить повышенный урожай плодов в более короткие сроки. Наиболее вероятным источником ИУК в завязях, обработанных 4-ХФУ, служат плаценты с неоплодотворенными семяпочками. Следует отметить, что развитие и размер плодов томата “Северянин” с естественной (не индуцированной экзогенными ауксинами) партенокарпией напрямую зависит от таких семяпочек [17].

Завязи из обработанных 4-ХФУ цветков характеризовались повышенным уровнем ИУК в первые дни развития (рис. 2в) и более высокой скоростью роста, чем у завязей, образовавшихся в результате опыления (рис. 2а), что согласуется с результатами, полученными ранее в процессе индукции 4‑ХФУ партенокарпии у томата [18] и баклажана [5]. При последующем росте растяжением содержание ИУК было выше у семенных плодов, однако партенокарпические продолжали расти с большей скоростью (рис. 2а, в). Одновременно с увеличением содержания эндогенной ИУК в партенокарпических плодах происходило накопление экзогенного ауксина – 4-ХФУ (рис. 2б, в). Учитывая большую, чем у ИУК, химическую устойчивость в растительной ткани синтетического ауксина [19], можно предположить, что повышенная скорость роста партенокарпических плодов является результатом совместного действия синтетического и эндогенного ауксина и 4-ХФУ может, по крайней мере, отчасти, восполнить недостаток ИУК в плоде.

Для доказательства данного предположения у плодов, вступивших в стадию роста растяжением, были удалены плаценты с семенами, что привело к полной остановке роста. Восстановить рост удалось, возобновив снабжение плода ИУК или 4‑ХФУ. Нормальное развитие плода продолжалось независимо от того, ИУК или 4-ХФУ были применены. Плоды в обоих случаях достигали размера, сравнимого с таковым у интактных плодов, и созревали одновременно. Содержание АБК, выделение этилена и дыхание были практически идентичными у обоих вариантов, что позволяет предположить одинаковый механизм действия ИУК и 4-ХФУ в регуляции роста плода томата. Дополнительным доказательством является тот факт, что 4-ХФУ, как и ИУК, стимулирует синтез гиббереллинов и цитокининов [15], а также активацию ферментов, регулирующих sink-активность плодов [16].

Ускоренный рост партенокарпических плодов сопровождался повышенными уровнями содержания АБК, выделения этилена и дыхания, причем характер изменений этих показателей был такой же, как у семенных плодов. Предположительно, АБК участвует в регуляции снабжения развивающего органа ассимилятами [14] и индукции синтеза этилена в созревающих плодах [20], а также предотвращает преждевременное прорастание сформировавшихся семян в плоде [13]. Одной из важнейших функций этилена является регуляция дыхания в те моменты развития плода, когда в короткое время нужно обеспечить быстропротекающий процесс необходимым количеством энергии [21]. В условиях нормального развития плода, т.е. в отсутствие стрессовых воздействий, критическими этапами его развития являются оплодотворение (завязывание) и созревание, когда происходит переключение генетически детерминированной программы развития плода в первом случае на рост, а во втором – на его прекращение и переход к созреванию. Именно в эти периоды наблюдается увеличение образования этилена, сопровождающееся усилением дыхания (рис. 2д, е).

Полученные данные свидетельствуют о том, что в онтогенезе плода томата ауксин является лимитирующим фактором как индукции, так и последующего развития от завязывания до созревания. Любые воздействия, приводящие к уменьшению уровня ауксина в плоде, вызывают замедление или полное прекращение его роста, который возобновляется при снабжении плода ауксином. Приведенные данные позволяют сделать вывод об участии синтетического ауксина не только в инициировании роста партенокарпического плода через стимуляцию синтеза эндогенной ИУК, но также демонстрируют возможность независимой от ИУК регуляции развития плода на всех стадиях вплоть до созревания.

Настоящая статья не содержит каких-либо исследований с участием людей и животных в качестве объектов. Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов.