Физиология растений, 2020, T. 67, № 5, стр. 490-500

ВВЕДЕНИЕ

Необходимым условием и важным этапом С₄ эволюции является создание фотодыхательного углеродного насоса, так называемого C₂-фотосинтеза, который использует фотодыхательный глициновый челнок для концентрирования CO₂ в клетках обкладки и рассматривается как “эволюционный мост” между С₃- и С₄-типами фотосинтеза [1, 2, 3] . Обычно С₂-фотосинтез встречается в С₃–C₄ промежуточных видах [1 ] и поэтому данные виды представляют большой интерес для изучения эволюции С₄-фотосинтеза [4].

С₃–С₄ виды выявлены в 14 семействах, в том числе в Chenopodiaceae [4]. К представителям данного семейства относится вид Sedobassia sedoides (подсемейство Camphorosmoideae), который на основе анатомических особенностей, а также анализа газообмена и иммунолокализации глициндекарбоксилазы [4] был отнесен к промежуточным С₃–С₄ видам с С₂-фотосинтезом [1, 5] . Разные виды с С₂-фотосинтезом могут соответствовать разным этапам С₄ эволюции. В ходе изучения нескольких видов Flaveria и Heliotropus с разным фотосинтезом были выделены следующие этапы С₄ эволюции: С₃ – прото-Кранц – С₂–С₄ [1] . Термин “прото-Кранц” был введен для описания начальной фазы С₄ эволюции. Кранц-анатомия рассматривается как структура, необходимая для захвата и утилизации фотодыхательного СО₂ [6] . К настоящему времени выделены основные черты развития и оптимизации C₄ цикла и параметры, подчеркивающие потенциальные изменения устьичных характеристик в ходе данных этапов. При этом этап С₂ был разделен на два типа, различающихся по активности ФЕП-карбоксилазы, и введен этап C₄-подобного фотосинтеза, отличающийся от С₄-фотосинтеза только активностью Рубиско в клетках мезофилла [5]. Было показано, что С₂-кранц – это упрощенная версия С₄-кранц анатомии, а прото-Кранц – начальная стадия формирования С₂-кранц, сопровождающаяся сдвигом митохондрий к внутреннему краю стенки клеток обкладки, примыкающей к проводящему пучку. Таким образом, эволюционный прогресс от С₃- к С₄-фотосинтезу содержит три отдельные фазы: прото-Кранц – С₂ (I и II типа) – C₄-подобный фотосинтез [5].

Определение наличия и активности C₄ цикла у C₃–C₄ промежуточных видов оказалось очень сложным, особенно у видов, находящихся на начальных фазах эволюционного С₃–C₄ перехода из-за низкой активности C₄ цикла. Положительный результат дает использование комбинации из нескольких методов, например, сочетание измерения СО₂-газообмена, лазерной спектроскопии (TDLAS) и оценки величины дискриминации изотопа углерода при низком парциальном давлении О₂ [7] . В тоже время есть данные, свидетельствующие о том, что С₂- и С₃-растения могут иметь схожие значения изотопной дискриминации [1 ] .

Исследования гранальности в хлоропластах клеток обкладки у промежуточных C₃–C₄ и С₄ видов Flaveria показали, что фотосинтетический перенос электронов у них отличается. Было установлено, что растения с C₄ метаболизмом имеют более низкую активность ФС II и более активный циклический транспорт электронов. Предполагается, что эти изменения имели важное значение для формирования С₄ фотосинтеза из промежуточного C₃–C₄ фотосинтеза у Flaveria [8] .

Одним из подходов для изучения С₂ фотосинтеза и этапов С₄ эволюции является анализ анатомического строения листа на уровне мезо- и ультраструктуры [4, 9] . Понятие “мезоструктура” было введено академиком А.Т. Мокроносовым и отражает клеточный и тканевой уровень организации структуры листа. Данный термин охватывает систему морфофизиологических характеристик листа, клеток мезофилла, обкладки проводящего пучка, а также хлоропластов. Показатели мезоструктуры листа могут значительно варьировать в зависимости от внешних факторов среды, от физиологического состояния растений, а также от типа фотосинтеза [1, 10]. Изучение ультраструктуры клеток мезофилла и клеток обкладки C₃–C₄ вида, оценка расположения органелл (митохондрий и хлоропластов), их площади позволяет дифференцировать отдельные этапы С₂ фотосинтеза [1] .

Известно, что особенно трудно выявить внутривидовые различия, отражающие этапы С₄ эволюции [11]. Ранее нами были показаны подобные различия между двумя популяциями промежуточного C₃–C₄ вида S. sedoides. Наличие разных популяций одного вида было подтверждено с помощью популяционно-генетического анализа [12] . Проведенные морфо-физиологические и биохимические исследования показали, что растения из разных популяций различаются по продуктивности (по приросту биомассы) и устойчивости (по интенсивности дыхания, соотношению Na⁺/K⁺ и содержанию пролина в побегах растений) в условиях засоления [3, 12, 13] . Разные популяции S. sedoides отличались также по интенсивности фотодыхания и активности циклического транспорта электронов ФС I. Было высказано предположение о разной степени проявления у них С₄ синдрома и принадлежности разных популяций S. sedoides к разным этапам С₂ фотосинтеза [3 ] .

Засоление является одним из основных абиотических стрессов, ограничивающих рост и продуктивность растений. Адаптация растений или устойчивость к засолению включает в себя сложные биохимические, физиологические и молекулярные механизмы [14] . Механизм адаптации на ранних этапах реализуется путем модификации внутриклеточных физиологических процессов, сопровождающихся ультраструктурными изменениями. Согласно ультраструктурному анализу наиболее вариабельными и высоко динамичными клеточными органеллами в стрессовых условиях являются хлоропласты [15] и митохондрии [16]. На С₄ галофитах показано, что хлоропласты клеток обкладки более устойчивы к засолению, за счет увеличения в них гранальности [17], а на С₄ гликофитах установлено, что хлоропласты клеток мезофилла более чувствительные, у них наблюдается формирование шаровидной [18] или волнистой (ажурной) структуры [19] . В клетках обкладки С₄ и у промежуточных С₃–С₄ видов при засолении формируется уникальная структура “хлоропластные карманы”, т.е. инвагинации хлоропластов в которые включаются митохондрии и пероксисомы [20]. Информация об ультраструктурных изменениях у С₃–С₄ видов при засолении крайне фрагментарна и нуждается в дальнейших исследованиях.

Целью данной работы явилось изучение морфо-физиологических и структурных характеристик двух разных популяций промежуточного C₃–C₄ ксерогалофита S. sedoides, предположительно с разными этапами С₂ фотосинтеза, в условиях умеренного засоления.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В естественных условиях Южного Урала были выбраны две популяции ксерогалофита Sedobassia sedoides (Pall.) Freitag & G. Kadereit (Chenopodiaceae), которые различались по продуктивности почти в 10 раз (сухая масса надземной части составила 0.41 ± 0.1 и 3.12 ± 0.5 г). Для подтверждения генетических различий между данными популяциями был проведен популяционно-генетический анализ. Для этого были собраны семена с 10–20 отдельных растений S. sedoides в каждой популяции. Экстракцию и разделение белков семян (глутамат-оксалоацетат-трансаминаза (E.C. 2.6.1.1), диафораза (E.C. 1.6.99), глутаматдегидрогеназа (E.C. 1.4.1.2), супероксиддисмутаза (E.C. 1.15.1.1), глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа (E.C. 1.1.1.49), 6‑фосфогюконатдегидрогеназа (E.C. 1.1.1.44), малатдегидрогеназа (E.C. 1.1.1.37), малик энзим (E.C. 1.1.1.40)) проводили по методике Гончаренко и др. [21] с модификациями. Оценку генетической дистанции между популяциями проводили в программе PopGen 1.32 [22] .

Для проведения лабораторных экспериментов семена S. sedoides из двух популяций проращивали в дистиллированной воде. Проростки в возрасте 3–4 дней пересаживали на перлит, пропитанный 50% питательным раствором Хогланда. Растения выращивали под люминесцентными лампами при плотности потоков квантов ФАР 200 мкмоль/(м² с), 16-часовом фотопериоде и температуре 25°C. Растения выращивали в кюветах на агроперлите. Для создания умеренного для ксерогалофита S. sedoides засоления в экспериментах использовали раствор 200 мМ NaCl, который заливали в поддоны, на которые переносили кюветы с растениями в возрасте 30 дней. Опыт длился 14 дней, в ходе которого NaCl вносили в поддоны дважды. В качестве контроля использовали 50% раствор Хогланда. Для определения сухой биомассы (надземная часть растений) растительные пробы (не менее 5 растений для каждого варианта) высушивали двое суток при 80°С.

Определение квантового выхода флуоресценции ФС II адаптированного к темноте (20 мин) фрагмента листа осуществляли с помощью PAM флуориметра (PAM 101, “Walz”, Германия). Измеряли максимальный квантовый выход флуоресценции ФС II (F_v/F_m). Измерение проводили с досветкой образца слабым модулированным потоком красного света по ходу измерений, которая осуществлялась с помощью PDA-100 (“Walz”), преобразующим первичный сигнал от PAM-101 на компьютер со специализированным программным интерфейсом. Расчет показателей проводили на основании текущего значения минимальной (F₀) и максимальной (F_m) флуоресценции адаптированного к темноте листа по формуле F_v/F_m = (F_m – F₀)/F_m. F₀ измеряли при освещении 0.1 мкмоль фотонов /(м² с), F_m при действии насыщающего импульсного света (SP, 5000 мкмоль фотонов /(м² с) в течение 0.8 с). Измерения проводились на 3–5 растениях для каждого варианта опыта.

Изотопный анализ листьев 3–5 растений каждого варианта выполнен в лаборатории стабильных изотопов Дальневосточного геологического института ДВО РАН с использованием элементного анализатора Flash EA 1112 (“ThermoFinnigan”, Германия), соединенного с изотопным масс-спектрометром MAT 253 (“ThermoFinnigan”). Результаты анализов представлены в общепринятой форме:

где R − отношение ¹³С/¹²С и выражены в промиллях (‰) относительно международных эталонов для углерода − карбонат VPDB (ViennaPeeDeeBelemnite, δ¹³C = 0). Воспроизводимость результатов ± 0.1 ‰.

Ультраструктуру клеток изучали с помощью трансмиссионной электронной микроскопии (ТЭМ). Образцы подготавливали в соответствии со стандартной методикой, как описано ранее [23]. Срезы на сеточках контрастировали спиртовым раствором уранилацетата. Контрастированные срезы просматривали в электронном микроскопе LIBRA 120 (Германия). Площади органелл на срезах измеряли с помощью программы ZEN-2012 Microsoft, используя инструмент “контур”. При изучении ультраструктуры клеток мезофилла и обкладки листа, были использованы 90−100 срезов (10 листьев с 3−5 растений на каждый вариант).

Определение параметров мезоструктуры листа проводили по методике А.Т. Мокроносова [24] . Количество хлоропластов в кранц-подобных клетках обкладки проводящего пучка (термин кранц-подобные клетки взят по Freitag [9] ) подсчитывали в 30 клетках мацерата, приготовленного из фиксированных в 3.5% растворе глутарового альдегида в фосфатном буфере (pH = 7) 5−10 листьев. Растительный материал мацерировали в 5% растворе СrO₃ в 1 N HCl. Оси клеток измеряли на поперечных срезах листьев 5 растений (по 7 измерений на каждом срезе) для каждого варианта, объем кранц-подобных клеток рассчитывали по формуле эллипсоида. Исследования выполнены с использованием оборудования ЦКП “Микротехническая лаборатория Ботанического сада-института ДВО РАН”.

Во всех экспериментах было не менее трех биологических повторностей. Для факторного (ANOVA) анализа использовали программу SigmaPlot 12.0. На графиках приведены средние арифметические значения полученных величин и их стандартные ошибки. Различия считались достоверными при Р < 0.05.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Популяционно-генетический анализ на основе 8 ферментных систем показал, что популяции П1 и П2 S. sedoides значительно различаются (генетические расстояния (D) = 0.0805). Между популяциями П1 и П2 S. sedoides в контрольных условиях достоверных различий по ростовым параметрам не выявлено (табл. 1). При засолении накопление сухой биомассы было снижено в обеих популяциях. Более значительно в П1 – на 27%. По значениям δ¹³С и максимального квантового выхода ФС II в контрольных условиях и при засолении достоверных различий между популяциями не установлено (табл. 1).

Исследование ультраструктуры поперечных срезов листьев растений из двух популяций S. sedoides показал, что анатомический тип представляет собой вариант промежуточного С₃–С₄ фотосинтеза, для которого характерно 2–3 слоя клеток мезофилла и внутрений слой кранц-подобных клеток обкладки в контакте с проводящим пучком. Кранц-подобные клетки образуют ровный ряд и более четко выражены у представителей П2 и в меньшей степени у П1 (рис. 1).

Исследование мезоструктуры листьев растений из двух популяций S. sedoides не выявило различий между П1 и П2 по объему клеток мезофилла в контрольных условиях, но при этом, в обеих популяциях наблюдалось увеличение объема клеток при засолении (табл. 1). В тоже время в контрольных условиях растения П2 отличались от растений П1 достоверно большим объемом кранц-подобных клеток обкладки проводящего пучка (в 1.5−1.8 раз). Также, наблюдались различия по соотношению объемов клеток мезофилла и кранц-подобных клеток. У П2 в контроле и при засолении данное соотношение было достоверно меньше и составляло 1.6−1.8, тогда как у П1 – 2.9−3.2. Аналогичная картина наблюдалась и по соотношению числа хлоропластов в клетках мезофилла и в кранц-подобных клетках: у П1 оно составило 2.8–3.1, а у П2 – 1.5−1.7 (табл. 1).

Изучение ультраструктуры показало, что в контрольных условиях популяции отличались по размеру и количеству хлоропластов и митохондрий. Так, площадь одного и общая площадь всех хлоропластов видимых на срезе в клетках мезофилла и в кранц-подобных клетках была значительно больше в П2 (рис. 2а–г). При этом количество хлоропластов в расчете на клетку мезофилла у растений П1 и П2 не различалось, а в кранц-подобных клетках обкладки у П2 было больше на 30% (рис. 2д, е). Также у растений из П2 была больше площадь одной и общая площадь всех митохондрий видимых на срезе в клетках мезофилла и в кранц-подобных клетках обкладки (рис. 3а–г). При этом количество митохондрий в клетках мезофилла и кранц-подобных клеток обкладки было также больше на 50 и 57% в П2 (рис. 3д, е). У растений обеих популяций количество митохондрий было значительно больше в кранц-подобных клетках обкладки, по сравнению с клетками мезофилла, у П1 в 10 раз, у П2 в 6 раз (рис. 3д, е). Больший объем кранц-подобных клеток обкладки и большее в них количество, более крупных по площади хлоропластов и митохондрий, свидетельствуют о том, что Кранц синдром у растений П2 выражен в большей степени, чем у П1.

Исследование ультраструктуры органелл клеток мезофилла и кранц-подобных клеток обкладки у представителей обеих популяций выявило внутривидовые различия в реакции растений на засоление. Внесение NaCl в питательный раствор привело к увеличению площади одного хлоропласта у растений П1 в клетках мезофилла (в 1.5 раза) и в кранц-подобных клетках обкладки (в 1.7 раз), и общей площади хлоропластов в кранц-подобных клетках (в 3 раза), тогда как у растений П2 площадь хлоропластов в условиях стресса не изменялась (рис. 2а, б, г). Исследование митохондрий у растений обеих популяций, показало, что при засолении у П1 площадь одной и общая площадь всех митохондрий видимых на срезе в клетках мезофилла и в кранц-подобных клетках обкладки возрастала, а у П2 наблюдалось снижение всех этих параметров, а также количества митохондрий в кранц-подобных клетках обкладки (рис. 3а–г, е).

В обеих популяциях в кранц-подобных клетках обкладки наблюдалось скопление митохондрий преимущественно около сосудистого пучка (СП) и у радиальных граней (рис. 4а, б). При этом растения П2 отличались большим количеством митохондрий (рис. 3е) и хлоропластов (рис. 2е), расположенных вдоль стенок кранц-подобных клеток, прилегающих к сосудистому пучку (рис. 4б). Выращивание растений обеих популяций в условиях умеренного засоления, привело к ряду изменений в ультраструктуре клеток листа. В кранц-подобных клетках обкладки листа растений популяции П1 хлоропласты приобретали шарообразную форму и располагались вдоль клеточных стенок (рис. 4 в), мембранная система тилакоидов увеличивалась в объеме, в результате чего формировалась “ажурная” структура ламелл, что свидетельствовало о нарушении их гранальности и о начале деградационных процессов в клетках (рис. 4в, вставка). У растений П2 в кранц-подобных клетках обкладки хлоропласты почти полностью были заполнены мембранными компонентами с очень плотной упаковкой. Основную часть объема хлоропластов занимала ламеллярная система со стопками отчетливо выраженных гран. Процессы внутриклеточного разрушения в кранц-подобных клетках обкладки у растений П2 наблюдались только в отдельных клетках и протекали преимущественно по вакуолярному типу (рис. 4 г, вставка).

ОБСУЖДЕНИЕ

Проведенный популяционно-генетический анализ показал, что растения промежуточного C₃–C₄ вида S. sedoides значительно отличающиеся по продуктивности в естественных условиях, характеризуются генетическими отличиями и принадлежат к разным популяциям (П1 и П2). Однако достоверных различий между популяциями по значениям δ¹³С, сухой массы надземной части растений и функционированию фотосистемы II не установлено. Отсутствие различий по значениям δ¹³С совпадает с данными других авторов [1] и еще раз подтверждает сложность выявления внутривидовых отличительных особенностей [11] . Проведенные нами ранее морфо-физиологические и биохимические исследования растений из разных популяций S. sedoides, позволили предположить, что исследуемые популяции соответствуют разным этапам С₄ эволюции [3, 12, 13] . Анализ ультра- и мезоструктуры растений из двух популяций (П1 и П2) S. sedoides в норме и особенно в условиях умеренного засоления также выявил различия между популяциями внутри одного вида.

Известно, что S. sedoides имеет специфическое анатомическое строение, которое выделено в отдельный тип – Sedobassia тип. Данный анатомический тип представляет собой вариант промежуточного С₃–С₄ фотосинтеза. Кранц-подобные клетки обкладки отличаются от обычных клеток палисадного мезофилла более компактной округлой формой, утолщенными стенками, и специфическим расположением хлоропластов и митохондрий вдоль внутренней периклинальной и антиклинальной стенок, что характерно для С₂ типа фотосинтеза [9] . На других C₂ видах (Homolepis aturensis и Steinchisma hians) также было показано, что в клетках обкладки все митохондрии, пероксисомы и большинство хлоропластов расположены центростремительно [5] . В наших экспериментах у S. sedoides кранц-подобные клетки обкладки образовывали неполное кольцо вокруг групп пучков на краю листа, при этом, у растений П2 кранц-подобные клетки имели более ровный и четкий ряд, по сравнению с растениями П1 (рис. 1а, б). Подобная структура поперечного среза листа S. sedoides показана и другими авторами [9 ] .

Известно, что эволюционный переход от C₃ к С₄ сопровождался увеличением объема клеток обкладки [25] и возрастанием в них объема и количества органелл, в частности числа хлоропластов [26]. А метаболизм фотодыхательного глицина в клетках обкладки, способствовал увеличению в них числа митохондрий и пероксисом [27−29]. Исследования расположения, количества и площади органелл (хлоропластов и митохондрий) в кранц-подобных клетках обкладки и клетках мезофилла растений позволили выявить внутривидовые различия между популяциями П1 и П2 и предположить, что данные популяции отличаются по стадии формирования фотодыхательного СО₂-концентрирующего механизма. Так, растения П2 характеризуются большим объемом кранц-подобных клеток обкладки, большим содержанием в них хлоропластов и митохондрий, меньшим соотношением объемов клеток мезофилла и кранц-подобных клеток, соотношением числа хлоропластов в них, а также значительно большей общей площадью хлоропластов и митохондрий (табл. 1, рис. 2б, г, е, 3б, г, е). Эти структурные характеристики свидетельствуют о том, что Кранц синдром у популяции П2 выражен в бόльшей степени. Исходя из полученных данных растения популяции П1 можно отнести к прото-Кранц типу фотосинтеза (переходный от С₃- к С₂-фотосинтезу), а растения популяции П2 к С₂-фотосинтезу (с вполне сформированным фотодыхательным СО₂ концентрирующим механизмом).

Известно, что клетки мезофилла по сравнению с клетками обкладки более чувствительны к засолению, это проявляется в нарушении гранальности хлоропластов и набухании тилакоидов [18, 19] . Исследование площади хлоропластов видимых на срезе клеток мезофилла в условиях засоления также выявило различия между популяциями: у П1 – площадь одного хлоропласта увеличилась, общая площадь хлоропластов не изменилась, у П2 – площадь одного хлоропласта не изменилась, общая площадь хлоропластов уменьшилась (рис. 2а, в). При этом у обеих популяций сохранялось одинаковое число хлоропластов в расчете на клетку (рис. 2д) и увеличивался объем клеток мезофилла (табл. 1). Увеличение объема клеток вероятно приводило к более рассеянному расположению хлоропластов в клетке, вследствие чего число хлоропластов, видимых на срезе уменьшилось и поэтому общая их площадь на срезе осталась прежней в П1 и уменьшалась у П2. В кранц-подобных клетках при засолении в П2 не изменялись параметры хлоропластов, а в П1 наблюдалось увеличение их площади (рис. 1б, г).

В условиях засоления в клетках растений обеих популяций имели место деградационные процессы, более выраженные у растений популяции П1 (рис. 4, табл. 1). Наблюдаемое увеличение размеров хлоропластов, в результате набухания ламеллярной системы, и митохондрий в кранц-подобных клетках обкладки (рис. 2б, г, 3б, г) сопровождалось нарушением гранальности хлоропластов и приводило к образованию характерной для условий засоления “ажурной” структуры (рис. 4в, вставка), иногда хлоропласты скручивались полукругом и в последующем приобретали шарообразную форму (рис. 4в). Подобные результаты были получены на неустойчивых к засолению С₄ видах [18, 19]. Кроме того, в некоторых случаях, скручивание хлоропластов растений П1 при засолении может приводить к формированию “хлоропластных карманов”, т.е. инвагинациям хлоропластов, в которые включались митохондрии и пероксисомы (рис. 4в, вставка). Подобные структуры имели место в клетках обкладки С₄ и у промежуточных С₃–С₄ видов при засолении, на которых было показано, что NaCl вызывает избыточное накопление АФК в хлоропластах и набухание тилакоидов. В этих условиях тесный контакт между хлоропластами, митохондриями и пероксисомами очень важен для подавления накопления избыточной энергии в хлоропластах путем поддержания фотодыхательного метаболизма [20] .

У представителей обеих популяций S. sedoides наблюдалось перемещение поврежденных органелл в вакуоль, что также свидетельствует о проявлении деградационных процессов в этих клетках, по морфологической картине напоминающих программированную клеточную смерть вакуолярного типа. У растений П2 в клетках обкладки органеллы сохранялись лучше, хотя и были полностью деградированные по вакуолярному типу клетки (рис. 4г, вставка). В тоже время имеющиеся в условиях засоления ультраструктурные изменения и деградационные процессы в хлоропластах П1 и П2 не приводили к значительным функциональным нарушениям – не выявлено достоверных различий в значениях максимального квантового выхода ФС II (табл. 1). Это можно объяснить устойчивостью ксерогалофита S. sedoides к умеренному засолению. Подобные результаты были получены нами ранее при слабом и умеренном засолении на разных популяциях S. sedoides [13] и другими авторами на галофитах сем. Chenopodiaceae [30]. Кроме того показано, что небольшие концентрации ионов натрия в строме хлоропластов у галофитов играют положительную функциональную роль в активности ФС II [17 ] .

Таким образом, выявлены внутривидовые ультра- и мезоструктурные различия у растений разных популяций промежуточного C₃–C₄ вида S. sedoides, которые отражают разные этапы формирования фотодыхательного СО₂-концентрирующего механизма в процессе эволюции С₄ фотосинтеза (П1 – прото-Кранц, П2 – С₂ фотосинтез). В условиях засоления растения из изученных популяций проявили различные стратегии адаптации на уровне ультра- и мезоструктуры клеток мезофилла и, особенно, кранц-подобных клеток обкладки, которые выражались в увеличении площади единичных органелл и общей площади хлоропластов и митохондрий у растений П1, и уменьшении площади единичных и общей площади митохондрий и их количества в П2.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов. Настоящая статья не содержит каких-либо исследований с участием людей и животных в качестве объектов исследования.