Физиология растений, 2020, T. 67, № 5, стр. 538-546

ВВЕДЕНИЕ

Большинство растений на Земле подвергаются действию разных неблагоприятных факторов, в том числе действию холода (низких положительных температур) и мороза (температуры ниже 0°С). Для растений, произрастающих в зоне умеренного климата, способность переносить действие низких температур имеет решающее значение для выживания в условиях холодового стресса разной продолжительности и интенсивности [1].

Принято считать, что одной из основных причин повреждения растений при гипотермии может быть окислительный стресс, вызванный повышенным содержанием АФК [2]. Низкие температуры могут вызывать смещение баланса оксидантов/антиоксидантов в сторону оксидантов, что и является причиной развития окислительного стресса. Чаще всего мишенью синглетного кислорода (¹О₂), супероксидного анион-радикала (${\text{O}}_{2}^{{\centerdot - }}$), пероксида водорода (H₂O₂) и гидроксильного радикала (ОН^•) становятся молекулы липидов, содержащие полиненасыщенные жирные кислоты. В процессе ПОЛ снижается количество полиненасыщенных жирных кислот, что приводит к повышению вязкости клеточных мембран, нарушению работы связанных с мембранами ферментных систем и гибели клетки [2].

В природных условиях понижение температуры, как правило, происходит постепенно, давая возможность растениям адаптироваться к гипотермии. Считается, что различия в эффективности закаливания разных видов растений могут быть связаны в том числе с функционированием антиоксидантной системы, регулирующей уровень АФК и продуктов ПОЛ в клетке [3]. Система антиоксидантной защиты включает высокомолекулярные и низкомолекулярные компоненты. К первым относятся ферменты антиоксидантной защиты, важнейшими из которых являются супероксиддисмутаза (СОД), аскорбат-пероксидаза (АПО) и каталаза (КАТ), тогда как ко вторым – такие соединения, как аскорбиновая кислота, каротиноиды, антоцианы, α-токоферол, глутатион и др. [4].

Опубликован значительный массив данных, характеризующих развитие окислительного стресса и работу антиоксидантных ферментов в условиях низких температур у разных по устойчивости к гипотермии видов растений. Так, при исследовании сортов риса, отличающихся по устойчивости к холоду, после 14 суток охлаждения при 9°С большинство растений чувствительного к холоду сорта погибали, а устойчивого – выживали [5]. Содержание МДА у чувствительного к холоду сорта за время охлаждения увеличивалось почти в 5 раз, тогда как у холодоустойчивого сорта существенных изменений содержания МДА выявлено не было [5]. Установлено, что холодостойкие сорта реагируют на действие низкой положительной температуры повышением активности СОД, АПО и КАТ, в то время как у чувствительных к холоду сортов риса наблюдалось снижение активности всех антиоксидантных ферментов [6].

Во время закаливания растений гороха при температуре 4°С было обнаружено увеличение активности СОД, АПО и КАТ. Повышение активности антиоксидантных ферментов сопровождалось ростом устойчивости растений к морозу, что свидетельствует о непосредственном влиянии этих ферментов на развитие устойчивости к низкой температуре [7]. Показано, что во время закаливания проростков озимой и яровой пшеницы при 2°С происходило снижение активности АПО и КАТ, что не помешало этим растениям после закаливания выдержать промораживание при –6°С [8].

Таким образом, представлено большое количество противоречивых данных, описывающих изменение активности СОД, АПО и КАТ в ответ на действие гипотермии, что не позволяет сделать однозначный вывод о роли этих антиоксидантных ферментов в низкотемпературном закаливании растений. Результаты экспериментов сильно зависят от видовых особенностей, фаз развития растений и режимов холодовой обработки. Кроме того, существенным недостатком большинства публикаций является отсутствие экспериментальных данных о локализации исследуемых антиоксидантных ферментов в клетке. В связи с этим целью нашей работы являлось исследование особенностей локализации и функционирования основных антиоксидантных ферментов (СОД, АПО, КАТ) у растений табака и озимой ржи при низкотемпературном закаливании.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Растительный материал. Объектами исследования являлись теплолюбивое растение табак (Nicotiana tabacum L., сортотип Samsun) и морозостойкая озимая рожь (Secale cereale L., с. Пурга). Растения выращивали в почвенной культуре в камерах фитотрона ИФР РАН при температуре 22°С, 16-часовом фотопериоде и освещенности 100 мкмоль/(м²с). Для опытов использовали растения в возрасте четырех недель. Закаливание растений проводили в течение 5 суток в климатической камере KBW-240 (“Binder”, Германия) при следующих условиях: табак – температура +8°С, 16-часовой фотопериод и освещенность 100 мкмоль/(м² с), озимая рожь – температура +2°С, 16-часовой фотопериод и освещенность 100 мкмоль/(м² с). Данные режимы закаливания были подобраны в ходе предварительных опытов. За время низкотемпературного закаливания у растений табака и озимой ржи подвядания листьев не наблюдалось. Содержание воды в листьях обоих видов исследованных растений в динамике закаливания оставалось на уровне незакаленных растений. Отбор проб проводили в динамике закаливания на 1, 3 и 5 сутки. В качестве контроля использовали растения, не подвергнутые воздействию закаливающей температуры.

Устойчивость растений к гипотермии. Для оценки устойчивости N. tabacum и S. cereale к низким температурам незакаленные и закаленные 5-суточные растения обоих видов охлаждали (0°С) и промораживали (от –2°С до –8°С) в течение 1 суток в климатической камере MIR-153 (“Sanyo”, Япония). Степень устойчивости незакаленных и закаленных растений оценивали по выходу электролитов (в %) из листовой ткани в водную фазу. Для этого электропроводность водных экстрактов определяли при помощи кондуктометра SG7-ELK (“Mettler Toledo”, Швейцария). Выход электролитов из тканей листьев (V, в %) рассчитывали по формуле: V = 100 × (L_о/L_k), где L_о – электропроводность исследуемого образца до или после холодовой экспозиции и L_k – электропроводность того же образца после кипячения [9].

Определение содержания МДА. Об интенсивности процессов ПОЛ судили по накоплению одного из продуктов окисления – МДА. Содержание МДА определяли по реакции с тиобарбитуровой кислотой. Навеску листьев (300 мг) гомогенизировали в 5 мл среды выделения (0.1 М трисНСI буфер, рН 7.6, содержащий 0.35М NaCI). К 3 мл гомогената добавляли 2 мл 0.5% тиобарбитуровой кислоты в 20% трихлоруксусной кислоте, инкубировали при 95°С в течение 30 минут, охлаждали, фильтровали и регистрировали оптическую плотность при длине волны 532 нм. В качестве контроля использовали среду выделения с реагентом. Содержание МДА рассчитывали в мкмоль/г сырой массы [10].

Выделение растворимого белка. Для выделения белка из листьев навеску последних (~300 мг) гомогенизировали в жидком азоте, помещали в пробирку и затем приливали два объема среды выделения (50 мМ трис-НСl, рН 7.6, 3 мМ ЭДТА, 250 мМ сахароза, 3.6 мМ цистеин, 5 мМ аскорбиновая кислота, 3 мМ MgCl₂, 2 мМ ДТТ, 2 мМ ФМСФ). Образцы центрифугировали в течение 20 мин при 16 000 g и отбирали супернатант с раствором белка. Для выделения белка из интактных хлоропластов навеску листьев (5 г) гомогенизировали в буфере (0.33 М сорбит, 50 мМ трицин рН 8.0, 2 мМ ЭДТА, 1 мМ МgCl₂, 5 мМ меркаптоэтанол). Гомогенат фильтровали через 2 слоя Miracloth (США). Полученный фильтрат центрифугировали при 2000 g. Осадок ресуспендировали в буфере, наслаивали на ступенчатый градиент перкола (40/80%) и центрифугировали при 5000 g. Интактные хлоропласты отбирали на границе 40% и 80% перкола. Для подтверждения интактности хлоропласты просматривали под световым микроскопом Axio Imager D1 (“Karl Zeiss”, Германия) в светлом поле и в режиме флуоресценции (возбуждение λ = 540 − 580 нм, эмиссия λ = 593 − 668 нм). Полученные хлоропласты разрушали, подвергая их нескольким циклам замораживания-оттаивания в среде выделения, центрифугировали в течение 20 мин при 16 000 g и отбирали супернатант с раствором белка. [11].

Определение активности антиоксидантных ферментов в ПААГ. Для этого проводили электрофорез в нативных условиях по методу Орнстейна и Дэвиса в ПААГ в камере Bio-Rad Mini PROTEAN Tetra (“Bio-Rad”, США). Для СОД и АПО использовали 15% гель толщиной 1 мм. Для КАТ применяли 10% гель толщиной 0.75 мм. В лунки вносили по 20 мкг (СОД, АПО) и по 7 мкг (КАТ) белка с добавлением сахарозы для “утяжеления” образца и 2 мкл 0.5% бромфенолового синего. Электрофорез проводили при 4°С в течение 2.5 ч при напряжении 180 В (СОД, АПО) и в течение 20 ч при напряжении 80 В (КАТ) с использованием источника тока PowerPac™ Universal Power Supply (“Bio-Rad”, США). Продолжительность электрофореза и напряжение электрического тока подбирали в предварительных опытах.

Для визуализации активности СОД гели инкубировали в 50 мМ Трис-НСl (рН 7.6) с добавлением 30 мкМ рибофлавина и 245 мкМ нитро-синего тетразолия (НСТ), выдерживали в течение 30 мин в темноте на шейкере, после чего промывали 50 мМ Трис-НСl, рН 7.6 и переносили на свет, где гель приобретал фиолетовую окраску, а участки геля, в которых проявлялась активность СОД, оставались более светлыми по сравнению с фоном [12]. Визуализацию активности АПО проводили по методу Миттлер и Зилинскас [13], а КАТ – посредством инкубации геля в 4 мМ растворе Н₂О₂ и последующего окрашивания в 1% растворе FeCl₃ и K₃[Fe(CN)₆] [14]. Гели сканировали, инвертировали и анализировали с помощью программы 1DScan (“Scanalitics”, США).

Определение суммарной активности антиоксидантных ферментов. Активность СОД (КФ 1.15.1.1) в листьях табака и озимой ржи определяли при помощи метода, основанного на способности СОД конкурировать с НСТ за супероксидные радикалы, и выражали в ед. активности/г сырой массы [15].

Активность АПО (КФ 1.11.1.11) в листьях определяли по методу, основанному на регистрации снижения оптической плотности раствора при окислении аскорбата, и выражали в мкмоль аскорбата/(г сырой массы мин) [16].

Активность КАТ (КФ 1.11.1.6) в листьях измеряли по скорости деградации H₂O₂ согласно Кумар и Ноулес и выражали в мкмоль H₂O₂/(г сырой массы мин) [15].

Во всех экспериментах биологическая повторность измерений была 6-кратной, аналитическая – 3–4-кратной. Каждый эксперимент повторяли не менее 3–4 раз. Результаты экспериментов обработаны статистически с помощью программы SigmaPlot 12.3. На рис. 2, 3, 4 представлены результаты типичных экспериментов. На гистограммах и в таблицах представлены средние значения и их стандартные ошибки. Достоверность различий между средними значениями оценена по t-критерию Стьюдента для 95% уровня значимости (P < 0.05). Достоверно различающиеся между собой величины обозначены разными надстрочными буквами.

Рис. 1.

Изменение содержания МДА в листьях растений табака и озимой ржи при низкотемпературном закаливании (1 – табак, 2 – озимая рожь). Достоверные различия средних значений при P < 0.05 отмечены разными латинскими буквами над барами.

Рис. 2.

Изоферментный спектр СОД в листьях и хлоропластах растений табака (а) и озимой ржи (б) (1 – лист, 2 – хлоропласт).

Рис. 3.

Изоферментный спектр АПО в листьях и хлоропластах растений табака (а) и озимой ржи (б) (1 – лист, 2 – хлоропласт).

Рис. 4.

Изоферментный спектр КАТ в листьях и хлоропластах растений табака (а) и озимой ржи (б) (1 – лист, 2 – хлоропласт).

РЕЗУЛЬТАТЫ

Активность СОД

Результаты экспериментов по определению активности СОД в листьях растений табака и озимой ржи при низкотемпературном закаливании продемонстрированы на рис. 5. Незакаленные растения озимой ржи превосходили табак в 1.5 раза по активности СОД. В процессе закаливания активность СОД у озимой ржи колебалась незначительно и к концу периода закаливания возвращалась к контрольным значениям. У табака активность СОД за время закаливания плавно росла и достигала максимальных значений (61 ед. активности/г сырой массы) на 5 сутки закаливания.

Рис. 5.

Изменение активности СОД в листьях растений табака и озимой ржи при низкотемпературном закаливании (1 – табак, 2 – озимая рожь). Достоверные различия средних значений при P < 0.05 отмечены разными латинскими буквами над барами.

Активность АПО

Из данных, представленных на рис. 6, видно, что активность АПО в контрольных растениях озимой ржи почти в 2 раза превышала величину активности в клетках табака. В процессе закаливания активность АПО табака росла и достигала максимальных значений (~1.5-кратный рост по отношению к контролю) к 5 суткам закаливания. У растений озимой ржи в течение пяти суток воздействия закаливающей температуры достоверных изменений активности АПО не наблюдалось.

Рис. 6.

Изменение активности АПО в листьях растений табака и озимой ржи при низкотемпературном закаливании (1 – табак, 2 – озимая рожь). Достоверные различия средних значений при P < 0.05 отмечены разными латинскими буквами над барами.

Активность КАТ

Данные по активности КАТ в листьях растений табака и озимой ржи при низкотемпературном закаливании представлены на рис. 7. До закаливания активность КАТ у озимой ржи более чем в 2 раза превышала активность этого фермента у табака. В ходе закаливания активность КАТ у озимой ржи не изменялась, а у табака – плавно увеличивалась, достигая максимума (~ на 30% больше контроля) к 5 суткам низкотемпературного закаливания.

Рис. 7.

Изменение активности КАТ в листьях растений табака и озимой ржи при низкотемпературном закаливании (1 – табак, 2 – озимая рожь). Достоверные различия средних значений при P < 0.05 отмечены разными латинскими буквами над барами.

ОБСУЖДЕНИЕ

Низкотемпературное закаливание – процесс формирования свойств холодо- и морозостойкости растений в соответствующих генотипу условиях. Закаливание является сложным, интегральным процессом, протекающим на всех уровнях структурной организации организма и затрагивающим практически все функции растения [17]. Антиоксидантная система растений является одним из элементов, участвующих в формировании устойчивости растений к гипотермии. Ферментативные и низкомолекулярные компоненты антиоксидантной системы обеспечивают поддержание баланса между генерацией и детоксикацией АФК и предотвращают окислительные повреждения клеточных структур [18].

Для исследования работы антиоксидантных ферментов в условиях низких температур важно правильно оценивать влияние температуры на растения. Одна и та же температура может быть закаливающей для одних видов растений и повреждающей для других [17]. Полученные нами данные по выходу электролитов показали, что оба вида исследуемых растений существенно повышали свою устойчивость к гипотермии в результате низкотемпературного закаливания. Растения озимой ржи ожидаемо продемонстрировали значительно более высокую эффективность закаливания по сравнению с табаком.

ПОЛ – одно из основных проявлений окислительного стресса, интенсивность которого наиболее часто определяют по содержанию конечного продукта реакции – МДА, который рассматривается как один из маркеров окислительного стресса [19]. Полученные в ходе нашей работы данные показали серьезные различия в интенсивности окислительного стресса у исследуемых видов растений. У морозостойкой озимой ржи содержание МДА в течение всего периода закаливания оставалось стабильным, что свидетельствует об отсутствии проявлений окислительного стресса при закаливающей температуре. Напротив, у теплолюбивого табака наблюдался существенный (~ в 1.5 раза) рост содержания МДА в 1 сутки закаливания. Поскольку в ходе дальнейшего закаливания содержание МДА в листьях табака постепенно снижалось до уровня контрольных значений и не препятствовало эффективному закаливанию, то можно предположить, что всплеск содержания МДА в начале периода закаливания носил не повреждающий, а сигнальный характер. Действительно, последнее время АФК и продукты ПОЛ все больше рассматриваются в качестве сигнальных молекул, вовлеченных в передачу внутриклеточных сигналов, регулирующих экспрессию генов и активность стресс-протекторных систем [20]. Сигнальная функция АФК и продуктов ПОЛ реализуется через регуляцию кальциевого статуса клеток путем влияния на поступление ионов Са²⁺ как вторичного мессенджера в цитозоль [21], МАП-киназную активность [22], а также сигнализацию с участием факторов транскрипции, регулирующих ответы растений на действие абиотических факторов среды [23].

В наших экспериментах растения табака демонстрировали устойчивый рост активности всех исследованных антиоксидантных ферментов, начиная с 3 суток периода закаливания. Это хорошо согласуется с гипотезой о сигнальном характере резкого увеличения содержания МДА в первые сутки закаливания. Можно предположить, что транзиторный рост продуктов ПОЛ вызывал активацию транскрипционных факторов, влияющих на экспрессию генов антиоксидантных ферментов. Синтез de novo белков СОД, АПО и КАТ приводил к повышению активности всех этих ферментов в клетках, что позволяло растениям табака избегать окислительных повреждений при низкотемпературном закаливании.

В отличие от табака, у озимой ржи активность СОД, АПО и КАТ на протяжении всего периода закаливания оставалась на уровне незакаленных растений. При этом растения озимой ржи демонстрировали отсутствие признаков окислительных повреждений и высокую эффективность закаливания к морозу. Такие результаты свидетельствуют в пользу наличия у озимой ржи других механизмов антиоксидантной защиты, не связанных с повышением активности основных антиоксидантных ферментов в процессе низкотемпературного закаливания. Известны эксперименты, показывающие, что озимая рожь отличается от других растений (в том числе и от других видов озимых злаков) повышенным уровнем конститутивной морозоустойчивости [24]. А также озимая рожь проявляет специфические особенности функционирования антиоксидантной системы, в частности, имеет высокий конститутивный уровень пролина и антоцианов в тканях, который существенно возрастает в процессе низкотемпературного закаливания [25]. Кроме этого показано, что озимая рожь превосходит другие озимые злаки по их способности в ходе закаливания накапливать сахара, которые рассматриваются в качестве низкомолекулярных антиоксидантов [17]. Поэтому можно предположить, что растения озимой ржи были способны избегать развития окислительного стресса при закаливании как за счет поддержания конститутивной активности СОД, АПО и КАТ, так и за счет накопления в клетках большого количества низкомолекулярных антиоксидантов.

Для понимания особенностей функционирования антиоксидантной системы растений важно иметь данные не только об активности антиоксидантных ферментов, но и об их локализации в клетке. Известно, что СОД представлена различными молекулярными формами, которые локализованы в хлоропластах, митохондриях, пероксисомах и цитоплазме [26]. АПО локализована в хлоропластах, цитоплазме, пероксисомах и митохондриях. АПО является основным ферментом, расщепляющим H₂O₂ в хлоропластах, где содержатся 2 изоформы АПО, одна из которых стромальная, а другая связана с тилакоидами со стороны стромы [27]. Основным местом локализации КАТ являются пероксисомы [28], хотя выявлены случаи присутствия КАТ в цитозоле и клеточной стенке [29].

В ходе нашей работы обнаружено по 2 изоформы АПО, локализованные исключительно в хлоропластах обоих видов исследуемых растений. В тоже время в хлоропластах табака и озимой ржи не было обнаружено активности КАТ, что сообщалось ранее [28]. Что касается СОД, то в клетках табака четыре изоформы СОД (90% активности) были локализованы в хлоропластах и лишь одна изоформа (10% активности) – за пределами хлоропластов. У озимой ржи в хлоропластах была локализована одна изоформа СОД, обеспечивающая 46% суммарной активности, тогда как в других клеточных структурах обнаруживались еще 2 изоформы (54% активности). По нашему мнению, такие особенности локализации СОД могли иметь существенное значение для антиоксидантной защиты клеток исследуемых видов растений. Известно, что в оптимальных условиях вегетации основным источником ${\text{O}}_{2}^{{\centerdot - }}$ является электрон-транспортная цепь хлоропластов, но в условиях стресса интенсивность генерации ${\text{O}}_{2}^{{\centerdot - }}$ в митохондриях, пероксисомах и цитозоле значительно возрастает, что может провоцировать развитие окислительного стресса [30]. Поэтому можно предположить, что концентрация большей части активности СОД в хлоропластах, по-видимому, ограничивала возможности клеток табака контролировать генерацию супероксидного анион-радикала, при гипотермии образующегося в больших количествах не только в хлоропластах, но и в других клеточных структурах. Это приводило к транзиторному росту содержания МДА в начале периода закаливания и последующей активации всех исследованных антиоксидантных ферментов. Напротив, в клетках озимой ржи активность СОД было распределена равномерно, что позволяло этому ферменту эффективно обезвреживать ${\text{O}}_{2}^{{\centerdot - }}$ не только в хлоропластах, но и в других клеточных компартментах.

Таким образом, на основе проведенных экспериментов и литературных данных можно констатировать, что растения табака и озимой ржи демонстрировали разные стратегии антиоксидантной защиты в условиях действия низких закаливающих температур. Растения табака обеспечивали поддержание баланса оксидантов/антиоксидантов в процессе низкотемпературного закаливания за счет повышения активности СОД, АПО и КАТ. Растения озимой ржи были способны избегать развития окислительного стресса при закаливании за счет равномерного распределения активности СОД в клетках, поддержания конститутивной активности всех исследованных антиоксидантных ферментов, а также, вероятно, за счет накопления низкомолекулярных антиоксидантов.

Работа выполнена при финансовой поддержке Министерства образования и науки РФ в рамках государственного задания (номер темы АААА-А19-119080690056-3).

Настоящая статья не содержит каких-либо исследований с участием людей и животных в качестве объектов. Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов.