Физиология растений, 2020, T. 67, № 6, стр. 616-624

ВВЕДЕНИЕ

Старение представляет собой разновидность возрастной программируемой клеточной смерти, которая происходит на клеточном, тканевом, органном и организменном уровнях и приводит к отмиранию растения [1]. Несмотря на деструктивную направленность, старение – динамичный и генетически строго регулируемый физиологический процесс [2]. Его особой формой является старение листьев, в ходе которого происходит мобилизация и рециркуляция питательных веществ в развивающиеся семена или в другие части растений [2]. Важная роль в контроле старения листьев отводится фитогормонам, которые могут ингибировать этот процесс (цитокинины и частично ауксины) или выступают его позитивными регуляторами (салициловая, абсцизовая, жасмоновая кислоты и этилен).

Существование механизмов взаимной регуляции цитокининов (ЦК) и ауксинов не вызывает сомнений. Множественные связи между системами синтеза, рецепции и транспорта этих двух растительных гормонов предоставляют широкий спектр возможностей для их взаимного усиления или сдерживания [3]. Известно, например, что синергизм ЦК и ауксина в контроле деления клеток может трансформироваться в антагонизм при регуляции дифференцировки клеток и тканей [4], однако взаимодействие двух гормонов в контроле старения изучено недостаточно.

Система восприятия сигнала ауксина включает семейство транскрипционных репрессоров Aux/ IAA, два транскрипционные фактора ARF и TIR1/ AFB1-AFB5 F-box компоненты комплекса SCF. В присутствие ауксина белки Aux/IAA формируют комплекс с TIR1/AFB1-AFB5, при этом IAA действует как молекулярный “клей”, удерживающий вместе компоненты этого ко-рецепторного комплекса. Формирование комплекса вызывает убиквитинирование белков репрессоров транскрипции Aux/IAA и их последующую деградацию 26S протеосомами с высвобождением ARF. Активированные ARF модулируют экспрессию многочисленных ауксин-зависимых генов. При этом большое число генов ко-рецепторов и транскрипционных факторов (IAA – 23, ARF – 23 и TIR – 5) обеспечивают широкое разнообразие возможных ответов на действие гормона [5].

Цитокинин реализует свое действие в растительной клетке и регулирует экспрессию ядерных генов по принципу транскрипционных каскадов при помощи двухкомпонентной сигнальной системы [6]. У растения Arabidopsis thaliana открыты три рецепторных сенсорных гистидинкиназы, кодируемые генами CRE1/WOL/AHK4, AHK3 и AHK2, функции которых значительно перекрываются [7, 8]. Вместе с тем в контроле некоторых цитокинин-зависимых ответов выявлены AHK-специфичные реакции, которые, вероятно, говорят о способности индивидуальных рецепторов определять экспрессию набора генов, вовлеченных в конкретные цитокинин-зависимые процессы. У A. thaliana доминирующим рецептором цитокининов в листьях является AHK3, тогда как рецепторный белок AHK2 выполняет вспомогательную функцию [9, 10]. Цитокинин-опосредованный контроль продолжительности жизни листьев осуществляется рецептором AHK3 через фосфорилирование транскрипционного фактора ARR2 [11].

Ранее мы сообщали о пролонгированном онтогенезе двойного мутанта A. thaliana ahk2ahk3, листья которого характеризовались замедленным распадом хлорофилла и поддержанием повышенного уровня фотосинтетической функции [12]. На первый взгляд эти данные противоречат традиционным представлениям об омолаживающем действии цитокининов, тем более что одинарные мутанты ahk3 с инактивированным геном AHK3 отличались ускоренным старением. Для объяснения этого кажущегося противоречия и выявления молекулярных механизмов задержки естественного старения цитокининами нами был проведен сравнительный анализ транскриптомов, выделенных из стареющих листьев растений с инактивированными генами рецепторов ЦК.

Цель работы – выяснение возможных генных мишеней, изменение экспрессии которых лежит в основе пролонгированного онтогенеза мутантного растения A. thaliana ahk2ahk3.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Объектом исследования были растения Arabidopsis thaliana Heynh. (L.), экотип Columbia-0, и полученные на его основе двойные нокаут-мутанты ahk2-2ahk3-3 (далее в тексте ahk2ahk3) и ahk2cre1-12 (далее ahk2ahk4), а также одинарный мутант ahk2-2 (далее ahk2), впервые описанные в работе Higuchi с соавт. [8]. Растения выращивали в почве при температуре 22°С, 16-часовом фотопериоде и освещенности 100 мкмоль/(м² с). Для экспериментов использовали шестой лист 7-недельных растений. Экстракцию и определение суммарного хлорофилла проводили по методу Лихтенталлера [13].

Библиотеки мРНК для RNA-seq анализа получали на основе тотальной РНК, выделенной из листьев с помощью реагента Trizol (“Invitrogen”, США). Перед подготовкой библиотек качество РНК проверяли с помощью капиллярного электрофореза на приборе Bioanalyzer2100 (“Agilent”, США). Для подготовки библиотек использовали РНК с показателем целостности RIN не менее 7. Библиотеки готовили набором NEBNext Ultra II RNA Library Prep, с использованием NEBNext Poly(A) mRNA Magnetic Isolation Module (“New England Biolabs”, США) согласно инструкциям производителя. Количественные измерения РНК и ДНК проводили на флуориметре Qubit 1.0 (“Thermo Fisher Scientific”, США). Секвенирование проводили с использованием платформы Illumina HiSeq4000 (“Illumina Inc.”, США) с получением не менее 25 миллионов одноконцевых чтений длиной 50 нуклеотидов. Дальнейшая обработка чтений проводилась с помощью программы CLC Genomics Workbench 7.0.3 (“Qiagen”, Нидерланды). Полученные чтения были отфильтрованы по качеству с удержанием только тех позиций, которые имели качество больше 20, и чтений с длиной более 25 и картированы на референсный геном A. thaliana (TAIR10) cо следующими установками: доля выравненного участка – 100%, порог по уровню сходства – 94%, штраф за несовпадение – 2, штраф за индель – 3, допускаются только уникальные картирования. В результате было получено в среднем 22.5 миллионов высококачественных уникально картированных чтений для каждого образца. Для учета влияния размера библиотеки на уровень экспрессии гена суммарное число чтений, картированных на ген, было нормализовано с помощью метода медианы [https://genomebiology. biomedcentral.com/articles/10.1186/s13059-014-0550-8]. Анализ дифференциальной экспрессии проводился с помощью пакета “DESeq2” статистической среды R [https://genomebiology.biomedcentral.com/ articles/10.1186/s13059-014-0550-8]. В качестве порога статистической значимости использовалось p-значение с поправкой на множественное тестирование FDR меньше 0.05 и уровень изменения экспрессии (fold сhange) более 2.

Для последующего подтверждения данных RNA-seq анализа относительный уровень транскриптов оценивали методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени после обратной транскрипции (ОТ ПЦР РВ) на приборе LigthCyclerR96 (“Roche”, Швейцария) согласно протоколу, описанному ранее [12]. Специфичные пары праймеров к исследуемым генам подбирали с помощью программы Vector NTI11 (табл. 1). В качестве референсного гена использовали ген UBQ10.

Статистический анализ. Все эксперименты проводили в трех биологических повторностях. На рисунках приведены средние значения и стандартные ошибки средних. Достоверность различий между опытными и контрольными образцами оценивали с помощью критерия Стьюдента. Данные RNA-seq представлены в виде средних значений двух биологических повторностей.

РЕЗУЛЬТАТЫ

В качестве материла для исследования был выбран закончивший рост шестой лист 7-недельных растений, который у растений дикого типа характеризовался в этом возрасте развитием пожелтения края листовой пластинки. Этот симптом, являющийся выраженным проявлением старения листа, сопровождался существенным снижением содержания хлорофилла по сравнению с мутантными растениями. При этом повышенное содержание суммарного хлорофилла (a + b) в листьях мутантов ahk2 (на 31%), ahk2ahk3 (на 24%) и ahk2ahk4 (на 13%) (рис. 1) примерно соответствовало увеличенным значениям максимального квантового выхода ФСII Fv/Fm [12].

Рис. 1.

Содержание суммарного хлорофилла в шестом листе 7-недельных растений дикого типа и ahk мутантов A. thaliana. Содержание суммарного хлорофилла в листьях дикого типа были приняты за 100%. Данные представлены в виде средних значений трех биологических повторностей и ошибки среднего. Достоверность различий оценивалась по критерию Стьюдента. * P ≤ 0.05.

Известно, что естественное старение листьев Arabidopsis может зависеть от инициации развития репродуктивных тканей и органов. Согласно литературным данным [14] и результатам наших предшествующих исследований [12], время выброса цветоноса нокаут-линий по рецепторам цитокининов могло отличаться от времени появления цветоносов у растений Arabidopsis дикого типа. Действительно, в использованных нами экспериментальных условиях растения с инактивированным рецептором АНК2 обнаружили пролонгированный период вегетации по сравнению с растениями дикого типа, что сопровождалось появлением достоверно большего количества настоящих розеточных листьев к моменту начала цветения (рис. 2а) и удлинением периода цветения (рис. 2б).

Рис. 2.

Физиологические особенности растений дикого типа и ahk мутантов A. thaliana, связанные с цветением. Количество настоящих розеточных листьев на момент начала цветения (а) и дни окончания цветения (б) ahk мутантов Arabidopsis. Данные представлены в виде средних значений трех биологических повторностей и ошибки среднего. Достоверность различий оценивалась по критерию Стьюдента. * P ≤ 0.05.

Измененным физиологическим характеристикам соответствовало кратное снижение уровня транскриптов гена SAG12 (senescence-associated gene 12), молекулярного маркера старения, а также повышенное накопление матриц ядерных генов фотосинтетических белков CAB2 и LHCB2.4 (табл. 2).

В общей сложности сравнение транскриптома листьев двойного мутанта ahk2ahk3 и контрольного генотипа (дикий тип) выявило измененную экспрессию 1755 генов, причем 775 были подавлены, а 980 активированы. Оба списка генов ранжировали по количественному изменению транскрипции, при этом значимым результат считали при условии изменения экспрессии генов более чем в два раза.

Прежде всего, мы обратили особое внимание на гены сигналинга и метаболизма ЦК, экспрессия которых по литературным данным [15, 16] изменялась в ходе старения. Среди генов, ассоциированных с синтезом ЦК, более высокий уровень экспрессии у мутанта ahk2ahk3 был выявлен для гена IPT3 (At3g63110), тогда как два других гена этого семейства (At2g36800 и At1g22400) были ингибированы (табл. S1 ). При естественном старении все эти гены экспрессировались слабо [15]. У мутанта ahk2ahk3 были подавлены гены ЦК-оксидаз, связанные со специфичной деградацией ЦК и активируемые при естественном старении, а также гены пуринпермеаз (табл. S1 ), ответственные за транспорт ЦК [17]. Кроме того, был снижен уровень транскриптов генов гликозилтрансфераз At2g36800 и At1g22400 (табл. S1 ), обеспечивающих превращение цитокининов в неактивные гликозилированные формы [18]. Напротив, экспрессия генов регуляторов ответа на ЦК типа А ARR6, 7, 9, которая снижалась при естественном старении, была существенно повышена, как и экспрессия гена быстрого ответа на ЦК At2g18300, кодирующего транскрипционный фактор семейства bHLH (табл. S1 ) [6]. Подобная регуляция ЦК-зависимых генов, контролируемых программами старения, свидетельствует о замедлении возрастных изменений у ahk2ahk3 на молекулярном уровне и о непосредственном участии системы рецепции гормонального сигнала в этом процессе.

Пул ЦК-зависимых генов составлял лишь часть генов со специфичными изменениями экспрессии в транскрипционном профиле мутанта. В верхней части ранжированного списка транскриптов генов с активированной экспрессией у мутанта ahk2ahk3 наше внимание привлек ген SSPP (senescence-suppressed protein phosphatase), уровень экспрессии которого был повышен в 137 раз (табл. 2). Этот ген кодирует серин-треониновую протеинфосфатазу типа 2С, которая негативно регулирует естественное старение листьев у Arabidopsis [19]. RNA-seq анализ также показал, что аналогичный ген в транскриптоме листьев одинарного нокаут-мутанта ahk2 экспрессировался в 27 раз выше по сравнению с диким типом, тогда как у мутанта ahk2ahk4 отличий от дикого типа выявлено не было (табл. 2). Согласно данным сайта http://bar.utoronto.ca/interactions2/, SSPP взаимодействует с белками различной локализации. Интересно, что у мутанта ahk2/3 более чем вдвое была повышена экспрессия гена фосфоглюкомутазы ATPGMP, кодирующего пластидную изоформу фосфоглюкомутазы, которая связана с образованием амилопластов и оттоком углерода. Анализ транскриптома листьев мутанта ahk2ahk3 обнаружил среди генов с активированной экспрессией также 13 генов семейства SAUR (SMALL AUXIN UP RNAs). У Arabidopsis семейство генов SAUR насчитывает в общей сложности 81 представителя, которые кодируют близкородственные РНК и белки, вовлеченные в быстрый ответ на ауксины [20]. Регуляторная роль этих белков может различаться в зависимости от физиологического состояния, типа ткани, а также воздействия различных фитогормонов [21]. У мутанта ahk2ahk3 активация экспрессии 13 выделенных генов SAUR варьировала от 4 до 281 раза (табл. 2), при этом только один ген из семейства – SAUR36 – обнаружил снижение уровня транскриптов. Интересно, что у мутанта ahk2 был повышен уровень экспрессии только двух генов семейства, SAUR29 и SAUR51, а у двойного мутанта ahk2ahk4 какие-либо изменения в экспрессии генов SAUR отсутствовали (табл. 2). Таким образом, анализ транскриптома позволяет предположить, что пролонгированный онтогенез мутантов ahk2 и ahk2ahk3 может быть связан с повышенной экспрессией ряда ауксин-индуцируемых генов семейства SAUR, возможной мишенью которых является SSPP, а также ген с подавленной экспрессией SAUR36.

Чтобы понять молекулярные механизмы, лежащие в основе регуляции генов семейства SAUR, мы проанализировали также профили экспрессии ряда генов сигналинга и метаболизма ауксинов. Известно, что при естественном старении гены метаболизма ауксина преимущественно активируются, а гены транскрипционных репрессоров Aux/IAA и транспортеров подавляются [15]. У мутанта ahk2ahk3 картина была несколько иной. Гены метаболизма nitrilase 1 (At3g44310) и aldehyde oxidase 1 (At5g20960) оказались ингибированы (табл. S2 ). Помимо них уменьшалось накопление транскриптов трех генов семейства GH3 – At4g37390, At4g27260 и At2g23170, кодирующих фермент IAA-амидосинтазу, который регулируют активность ауксинов (табл. S2 ). Вместе с тем мы выявили повышенную экспрессию генов сигналинга и транспорта ауксина Aux/IAA29 (At4g32280), ARF8 (At5g37020) и PIN7 (At1g23080) (табл. S2 ). Значимые количественные изменения были отмечены также для транскриптов членов семейства B ABC-транспортеров ABCB1/Pgp1 (At3g28860), ABCB2/Pgp2 (At4g25960) и ABCB19/Pgp19 (At2g36910), обеспечивающих полярный транспорт ауксинов как непосредственно, так и при участии PIN белков [22]. Все это позволяет предположить их участие в передаче сигнала ИУК к генам семейства SAUR, которые могут быть непосредственными мишенями этого пути. Однако для выяснения деталей функционирования этого пути необходимы дополнительные исследования.

Для подтверждения полученных с помощью RNA-seq данных мы применили независимый ОТ ПЦР РВ анализ экспрессии ряда генов. Количественный ПЦР подтвердил результаты транскриптомного анализа и выявил значительную активацию генов SSPP и CAB2 в листьях мутантов ahk2 и ahk2ahk3 на фоне снижения экспрессии гена SAG12 (рис. 3). При этом у мутанта ahk2ahk4 на фоне повышенной экспрессии генов фотосинтетических белков активации гена SSPP обнаружено не было (рис. 3).

Рис. 3.

Уровень транскриптов генов SAG12 (а), CAB2 (б) и SSPP (в) в шестом листе 7-недельных растений дикого типа и ahk мутантов A. thaliana. Данные представлены в виде средних значений трех биологических повторностей и ошибки среднего. Достоверность различий оценивалась по критерию Стьюдента. * P ≤ 0.05.

ОБСУЖДЕНИЕ

В последние годы в изучении механизмов восприятия и передачи эндогенных сигналов и выявлении генных модулей, ответственных за инициацию естественного или индуцированного старения листьев, достигнут большой прогресс, который стал возможен благодаря интенсивному развитию методов геномики. Однако, несмотря на значительные успехи и понимание роли рецепторов цитокинина в контроле процесса естественного старения листьев A. thaliana, конкретные молекулярные мишени действия ЦК остаются неизвестными.

В данном исследовании, используя данные секвенирования транскриптомов и их последующую оценку методом ПЦР в режиме реального времени мы показали, что пролонгированный онтогенез у мутанта ahk2ahk3 сопровождался снижением экспрессии SAUR36, позитивного регулятора старения, и резким повышением экспрессии гена SSPP (AT5G02760), негативно регулирующего естественное старение листьев у Arabidopsis, а также 13 генов из семейства SAUR, кодирующих белки ответа на ауксины.

Из литературы известно, что уровень транскриптов гена SSPP значительно снижается как при естественном, так и при индуцированном внешними факторами старении [19]. Особенностью продукта гена SSPP является его способность непосредственно взаимодействовать с цитоплазматическим доменом серин-треониновой рецепторной киназы SARK (receptor-like kinase) и дефосфорилировать его, задерживая тем самым старение листьев [19]. Ранее было показано, что ген SARK (At4g30520), кодирующий рецепторную киназу с лейциновыми повторами (LRR), положительно регулирует старение листьев у Arabidopsis и относится к группе SAG генов [23]. Однако профилирование транскриптомов ahk мутантов не выявило изменений в экспрессии гена SARK.

Известно, что в задержку старения, индуцированного SSPP, вовлечен сигналинг цитокинина, в частности рецептор АНК3 [24]. Такой вывод был сделан на основании фенотипического анализа двойного мутанта ahk3-3/SSPPox, который утрачивал способность к задержке старения листьев при инактивации гена AHK3. Трансгенное растение Arabidopsis 35S:SSPP характеризовалось гиперчувствительностью к экзогенным цитокининам, которая исчезала при дополнении нокаутированным геном AHK3. Тем не менее, согласно результатам ДНК-микрочипирования, доступным на Arabidopsis e-FP Browser (http://bar.utoronto.ca/efp/cgi-bin/efpWeb.cgi), экспрессия гена SSPP не регулируется цитокинином, но в значительной степени активируется индолилуксусной кислотой.

Механизм регуляции гена SSPP ауксинами подробно изучался в работе Wen с соавт. [25]. Как оказалось, белок SAUR49 способен непосредственно взаимодействовать с SSPP и подавлять его активность, тем самым ускоряя старение листьев Arabidopsis через SARK-зависимый сигнальный путь. При этом оверэкспрессия гена SAUR49 значительно ускоряла как естественное старение, так и старение листьев Arabidopsis, индуцированное темнотой. Согласно результатам двугибридного анализа, помимо SAUR49, с SSPP взаимодействовали еще 4 представителя семейства SAUR белков: SAUR30, 39, 41, 72. Вероятно, эти представители семейства SAUR являются интеграторами положительной регуляции старения листьев Arabidopsis [25]. К их числу относится также ауксин-активируемый SAUR36, экспрессия которого возрастала по мере развития симптомов старения [26].

Следует, однако, заметить, что среди 13 генов SAUR, активированных у мутанта ahk2ahk3, отсутствовали гены, продукты которых взаимодействовали бы с SSPP. Более того, избирательная активация генов SAUR сопровождалась усилением экспрессии гена SSPP (табл. 2) и пролонгированным онтогенезом мутантов ahk2 и ahk2/3. При этом почти все выделенные нами гены SAUR относились к числу активируемых ИУК, тогда как гены белков, взаимодействовавших с SSPP, могли не отвечать на ауксины (SAUR30, 39, 49) или даже ингибировались ими (SAUR72) [27]. Таким образом, различные представители семейства SAUR действовали как антагонисты, что характерно также и для членов семейств ARF и ARR [27]. Интересно, что помимо реакции на ауксины почти все гены SAUR, обнаружившие повышенную экспрессию у мутанта ahk2ahk3, активировались гиббереллинами и частично брассиностероидами, то есть гормонами, стимулирующими рост [27]. Это отличало их от генов SAUR – положительных регуляторов старения. Более того, представители последней группы активировались АБК в отличие от выделенных нами SAUR генов, замедлявших старение, которые ингибировались этим гормоном или не отвечали на его воздействие. Все это позволяет заключить, что система SAUR-зависимой регуляции старения является композитной, причем различные представители семейства способны обеспечить положительную или негативную регуляцию старения листьев в зависимости от генетической среды и внешних стимулов.

Как отмечалось выше, цитокинин-зависимый контроль продолжительности жизни листьев осуществляется рецептором AHK3 через фосфорилирование транскрипционного фактора ARR2. Инактивация гена AHK3 ускоряет старение листьев, тогда как gain-of-function мутации ore12-1 и rock3, обеспечивающие усиление функции этого гена, приводят к замедлению старения [11, 28]. Одновременная инактивация двух рецепторов ЦК у мутанта ahk2ahk3 оказывает плейотропный эффект на физиологическое состояние растения, включая появление полукарликового фенотипа, повышенное содержание эндогенных цитокининов зеатинового ряда, задержку цветения, и пролонгированный онтогенез [7, 12]. Мы предполагаем, что задержка старения листьев и пролонгированный онтогенез мутанта ahk2ahk3, а также одинарного мутанта ahk2 обусловлены измененной экспрессией набора ауксин-чувствительных генов, негативно регулирующих старение листьев. Помимо выявленных нами SAUR генов, в состав этого модуля, возможно, входят гены транспорта и сигналинга ауксина PIN7 (At1g23080), Aux/IAA29 (At4g32280) и ARF8 (At5g37020), однако для доказательства их прямого участия необходимы дополнительные тесты.

Полученные результаты наводят на мысль, что при частичном подавлении сигналинга ЦК основная роль в контроле естественного старения растения и его листьев переходит к ауксиновому сигналингу, одной из мишеней которого является ген SSPP. Таким образом, мы приходим к парадоксальным результатам, когда при подавлении сигналинга ЦК наблюдается замедление старения. Как известно, любая биологическая функция реализуется несколькими независимыми механизмами [29] и именно с таким параллелизмом, повышающим вероятность выполнения функции (и весьма эффективно), мы сталкиваемся при анализе особенностей старения мутанта ahk2ahk3. Появление подобных компенсаторных механизмов заставляет с известной сдержанностью относиться к результатам, полученным методами обратной генетики, так как в основе видимых эффектов может лежать не прямое нарушение функции исследуемого гена, а возникновение альтернативных путей ее реализации. О возможном включении компенсаторных механизмов при деэтиоляции тройного мутанта по регуляторам ответа на ЦК arr1arr10arr12 сообщали Cortleven с соавт. [30]. Увеличенный синтез хлорофилла у мутанта с инактивированным сигналингом ЦК авторы связывали с экспрессией транскрипционных факторов, принадлежащих к альтернативным системам регуляции формирования хлоропластов, напрямую не связанных с ЦК.

В пользу множественности путей реализации программ старения свидетельствует и транскриптомный профиль нокаут-мутанта ahk2ahk4 с пролонгированным периодом вегетации. Замедление скорости старения листьев этого мутанта не было связано с изменением экспрессии модуля SSPP-SAUR и, очевидно, определялось активацией АНК3-зависимых мишеней.

Таким образом, анализ транскриптома мутанта ahk2ahk3 позволяет заключить, что в основе задержки естественного старения листьев растений могут лежать антагонистические взаимоотношения цитокинина и ауксина. При этом инактивация индивидуальных рецепторов цитокинина (прежде всего, АНК2 и АНК3) способствует перепрограммированию экспрессии генома и включению компенсаторных механизмов, связанных с активацией ауксин-зависимых генов.

Работа выполнена при финансовой поддержке Российского научного фонда, грант № 18-74-00135. Секвенирование и биоинформатический анализ данных секвенирования проводились в ЦКП геномики Сколковского института науки и технологии.

Авторы выражают благодарность руководителю ЦКП геномики Сколковского института науки и технологии к.б.н. Логачевой М.Д. за оказанную помощь при проведении данного исследования.

Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов. Настоящая статья не содержит каких-либо исследований с участием людей и животных в качестве объектов исследований.