Физиология растений, 2021, T. 68, № 1, стр. 85-92

ВВЕДЕНИЕ

Поскольку жирнокислотный состав (ЖКС) мембранных и запасных липидов клеточных структур растений определяет их функциональную активность, его изучению посвящено большое количество работ. Из лиственных древесных растений исследования проведены преимущественно на растениях рода Betula L., включающего много ценных видов и форм, широко распространенных в различных широтах и представляющих большой научный и практический интерес [2–8]. При изучении сезонной динамики содержания липидов в почках различных видов березы было показано, что максимум их накопления приходится на осенне-зимний период [4]. Весной количество липидов в почках снижается, что объясняется использованием их на ростовые процессы. Проведенные нами исследования показали, что по фазам распускания почек березы отмечаются значительные изменения в содержании суммарных липидов (СЛ), их фракций и ЖКС СЛ [7]. Полученные данные позволяют заключить, что в период распускания почек при формировании ассимиляционного аппарата происходят значительные преобразования компонентов мембран, в частности входящих в их состав полярных липидов – гликолипидов (ГЛ) и фосфолипидов (ФЛ), а также неполярных липидов – нейтральных липидов (НЛ). Динамика ЖКС фракций липидов по фазам распускания почек березы остается не исследованной. Имеются сведения о ЖКС фракций СЛ в распускающихся почках березы повислой и березы пушистой без учета фаз распускания [3]. Для выявления закономерностей изменения липидного состава в почках лиственных древесных растений в период перехода их к активной вегетации необходимо исследование ЖКС фракций СЛ по фазам распускания почек, в частности у растений рода Betula L.

При исследовании состава липидов по фазам распускания почек растений рода Betula L. нами были выявлены заметные отличия в динамике содержания СЛ, их фракций и ЖКС СЛ у березы пушистой, березы повислой и карельской березы [7]. Для понимания общих закономерностей и видовых особенностей изменения ЖКС фракций СЛ по фазам распускания почек растений рода Betula L. необходимо было провести исследование на различных видах березы. Актуальной остается и проблема идентификации одного из представителей рода Betula L., характеризующегося ценной древесиной, – карельской березы, которую по морфологическим показателям не всегда можно определить на протяжении всего онтогенетического цикла [5].

Целью настоящей работы было исследование у различных представителей растений рода Betula L. ЖКС фракций суммарных липидов почек по фазам распускания.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Исследовали вегетативные почки 30-летних растений рода Betula L. с характерными морфологическими признаками березы пушистой (Betula pubescens Ehrh,) березы повислой (Betula pendula Roth) и карельской березы (Betula pendula Roth var. carelica (Mercklin) Hämet-Ahti), произраставших на опытных участках агробиологической станции Карельского научного центра РАН, в окрестностях города Петрозаводска. Для проведения эксперимента была проведена идентификация исследуемых берез по морфологическим признакам, по которым отнесли исследуемые растения к двум видам и подвиду [4, 5]. Береза повислая характеризовалась прямым стройным стволом, была высотой 13–15 м, имела ажурную крону и свисающие вниз ветви, однолетние побеги были красновато-бурые со смолистыми железками – “бородавками”, поверхность листа – матовая. Береза пушистая характеризовалась также прямым стройным стволом, была высотой 10–12 м, имела плотную крону с распростертыми вверх ветвями, ауксибласты были красновато-бурого цвета, покрыты густым опушением, листья также характеризовались ярко выраженным опушением. Карельская береза была прямоствольной, высотой 5–7 м, на стволе отмечалось наличие характерных вздутий, неровностей и бугорчатых выпуклостей, была выявлена высокая степень узорчатости текстуры древесины. Для исследований использовали по три растения с типичными для двух видов и подвида морфологическими признаками.

Исследования проводили с 29 апреля по 20 мая 2008 г. Почки со всех исследованных берез одновременно отбирали в утренние часы (10–11 ч) с боковых побегов средней части кроны, южной экспозиции в соответствии с фенофазами распускания почек: I фаза – набухание почек (почки заметно увеличиваются в размерах, конец апреля); II фаза – разверзание почек (в верхней части почек появляется конус молодых листьев, начало мая); III фаза – раскрытие вегетативных почек (молодые листья сложены в трубочку, вторая декада мая); IV фаза – молодые листья размером до 10 мм (обособление молодых листьев, поверхность листьев складчатая, видны черешки, третья декада мая) [9]. Фазы распускания почек у исследуемых растений прослеживали визуально, в год проведения эксперимента они совпадали по срокам.

Экстракцию из тканей СЛ и их очистку проводили по общепринятым методам [1]. СЛ извлекали системой растворителей – хлороформ : метанол (2 : 1, v/v). Разделение липидов на фракции выполняли методом колоночной хроматографии, где в качестве неподвижной фазы использовали силикагель Davisil Silica gel (mesh) 100–200, а в качестве подвижной фазы – систему последовательных растворителей: хлороформ, ацетон, метанол для экстракции НЛ, ГЛ и ФЛ соответственно. Система растворителей хлороформ : метанол позволяет экстрагировать углеводороды, спирты, альдегиды, кетоны и хиноны, нормальные насыщенные кислоты, воски, эфиры стеринов и спиртов, витаминов A, D, E, простые эфиры глицерина, фосфолипиды, гликолипиды. Дальнейшее разделение липидной смеси элюентами с разной степенью полярности приводит к делению СЛ на следующие фракции: НЛ (неполярные компоненты) – углеводороды, каротиноиды и хлорофилл, воски, жирные кислоты (ЖК), альдегиды, кетоны; ГЛ (слабо полярные компоненты) – моно- и дигалактозилдиглицериды, цереброзиды, гликозиды стеринов, сульфолипиды кардиолипина и фосфатидовой кислоты, следовые количества НЛ; ФЛ (сильно полярные компоненты) представляют собой ФЛ и следы ГЛ [1]. Поэтому представленное в нашей работе обозначение фракций базировалось на общепринятой методике и обосновывалось преобладанием в них определенных фракций липидов. Объем растворителя, необходимый для полного извлечения каждой фракции, контролировали методом сжигания липидов в концентрированной серной кислоте при 200°С (в электрическом блоке 15 минут) с последующим измерением растворов на спектрофотометре при 375 нм.

Жирные кислоты СЛ исследовали в виде метиловых эфиров, которые получали переэтерификацией липидов метанолом в присутствии ацетилхлорида. Разделение смеси ЖК на составляющие компоненты осуществляли на газожидкостном хроматографе “Хроматэк–Кристалл 5000.1” (Йошкар-Ола, Россия) с использованием капиллярной колонки Zebron ZB-FFAP (50 м × 0.32 мм). Анализ проводили в изотермическом режиме: температура колонки составляла 190°С, испарителя – 240°С, пламенно-ионизационного детектора – 260°С. В качестве газа-носителя использовали азот. Скорость пропускания через колонку азота, водорода, воздуха составляла 50, 40, 400 мл/мин соответственно. ЖК идентифицировали с помощью сравнения со стандартным набором ЖК (Supelko, 37 компонентов, США), а также сопоставлением эквивалентной длины цепи с табличными данными [10]. Концентрацию ЖК рассчитывали методом процентной нормализации по площадям пиков [11]. ЖК были выделены в группы, отличающиеся по числу двойных связей в углеродной цепи: ненасыщенные (моно-, ди- и триеновые) жирные кислоты (ННЖК) и насыщенные (без двойных связей) жирные кислоты (НЖК). Для сравнительного анализа фракций липидов почек у разных берез были использованы главные ЖК: пальмитиновая (С_16:0), стеариновая (С_18:0), олеиновая (С_18:1), линолевая (С_18:2), линоленовая (С_18:3).

Индекс двойной связи (ИДС), характеризующий степень ненасыщенности жирных кислот рассчитывали согласно методу Lyons с соавт. [12] по формуле:

где М – моноеновые, Д – диеновые, Тр – триеновые, Тетр – тетраеновые кислоты, % от суммы жирных кислот.

Коэффициент ненасыщенности (К) жирных кислот определяли по формуле:

Математическую обработку данных проводили с помощью пакета программ Microsoft Excel. Результаты представлены в виде средних значений 3–6 биологических повторностей и их стандартных ошибок.

РЕЗУЛЬТАТЫ

ОБСУЖДЕНИЕ

Ранее мы исследовали динамику содержания СЛ, их фракций и ЖКС СЛ в почках растений рода Betula L. (березы пушистой, березы повислой и карельской березы) по фазам распускания [7]. Содержание СЛ варьировало от 27 до 45% от абсолютно сухой массы (а.с.м.). В составе СЛ преобладали НЛ (до 42% от а.с.м.). НЛ – это эфиры глицерина и ЖК, они служат формой хранения углерода в растениях и используются в основном как источник энергии и запасных соединений для роста побегов и листьев [8]. Отмечалось снижение уровня НЛ в почках берез на первых этапах распускания, что могло быть следствием интенсивного использования их на ростовые процессы, когда еще не происходит в достаточном количестве пополнения энергетического материала в клетках растений за счет фотосинтеза и поступления элементов питания из почвы.

Фракции ГЛ и ФЛ не превышали 13 и 8% от а.с.м. соответственно [7]. Однонаправленного для всех берез изменения содержания ГЛ в процессе распускания почек не наблюдалось. ГЛ – сложные липиды, включающие углеводную группу. Они являются основными компонентами тилакоидных мембран хлоропластов. ФЛ составляют основу всех мембран клетки. Уровень этой фракции липидов у трех берез повышался в фазу раскрытия почек. Очевидно, в этот период, в III фазу распускания почек, когда почки раскрываются и появляются молодые листья, ФЛ в них активно синтезируются и принимают участие в формировании клеточных структур. Проведенное ранее сравнительное исследование липидного состава распускающихся почек (без учета фаз развития) и молодых листьев у березы повислой и березы пушистой показало, что при распускании почек существенно повышается содержание ФЛ в связи с активным образованием мембран клетки [3]. Позже мы установили, что этот процесс происходит в III фазу распускания почек [7]. Также перед появлением хвои в меристемах почек хвойных растений содержание ГЛ и ФЛ в мембранах значительно возрастает, что объясняют увеличением размеров клеток и формированием их фотосинтетического аппарата [13, 14].

В СЛ почек разных видов березы преобладали диеновые и триеновые кислоты, в СЛ листьев – триеновые [2, 3]. Предполагается, что при формировании листьев происходит десатурация ЖК с образованием новых двойных связей. ННЖК СЛ почек берез по фазам распускания составляли до 85% от суммы ЖК [7]. Преобладание ННЖК в липидах почек позволяет сохранять текучесть мембран их тканей на физиологически активном уровне, обеспечивающем интенсивные процессы формирования фотоассимиляционного аппарата в распускающихся почках и устойчивость их к возможным неблагоприятным климатическим условиям в весенний период, прежде всего, к понижению температуры. У растений, синтезирующих ННЖК, проявляются типичные обратные отношения между температурой среды и накоплением ННЖК в составе мембранных липидов [15, 16].

Основной вклад в группу ННЖК СЛ почек исследованных видов берез вносят линолевая и линоленовая ЖК (до 44 и 39% от суммы ЖК соответственно), в группу НЖК – пальмитиновая ЖК (до 32%) [7]. Содержание линолевой кислоты снижается в СЛ почек берез в процессе их распускания, что может быть обусловлено ее использованием в метаболических процессах, направленных на формирование структур молодого листа. Во время дальнейшего роста листа содержание линоленовой кислоты продолжает снижаться, при этом накапливаются триеновые кислоты, преимущественно линоленовая, активно участвующая в процессе фотосинтеза [17].

Выявленный в данном исследовании высокий уровень ННЖК во всех фракциях липидов по фазам распускания почек исследованных берез свидетельствует о высокой степени жидкостности мембран клеток развивающихся почек, что, очевидно, является необходимым условием для активно протекающих в этот период метаболических процессов и обеспечивает защитные функции растений от возможных неблагоприятных климатических условий в весенний период. Также в мужских соцветиях Betula pendula Roth в период весеннего их развития в начальную фазу цветения в условиях относительно низких температур сумма ННЖК превышала сумму насыщенных во всех фракциях СЛ, особенно во фракциях мембранных липидов, в которых количество ННЖК было вдвое больше, чем насыщенных [18]. По мере повышения температуры среды, к фазе разрыхления тычиночных соцветий, происходило накопление НЖК в НЛ (до 70% и выше от суммы жирных кислот) и в ГЛ (до 50% и выше от суммы ЖК). При этом в ФЛ отмечалось устойчивое преобладание ННЖК, и в большей степени – линолевой кислоты (до 65% и выше от суммы ЖК), независимо от фазы развития мужских соцветий. Высокая степень ненасыщенности ЖК мембранных липидов определяет физическое состояние биологических мембран, что важно для поддержания текучести липидного окружения мембранных белков, особенно ферментов, и обеспечения пропускной способности мембран для ионов и молекул, а это, в свою очередь, определяет характер и интенсивность метаболизма в клетках [19].

Согласно результатам нашего исследования, группу ННЖК всех фракций СЛ почек трех берез составляли преимущественно линоленовая (С_18:3) и линолевая (С_18:2) кислоты, которые могут синтезироваться в растениях, в отличие от животных, и именно они в основном определяют состояние мембран [14, 20]. Значительное, повышающееся по фазам распускания почек количество линоленовой кислоты во фракциях СЛ обеспечивает активные метаболические процессы, связанные с формированием фотоассимиляционного аппарата, при переходе растения из состояния вынужденного покоя к активной вегетации. Полученные данные по снижению уровня линолевой кислоты при повышении содержания линоленовой во фракциях СЛ, особенно во фракции ГЛ, по фазам распускания почек согласуются с литературными данными. В работе Ветчинниковой с соавт. [2] также наблюдалось повышенное содержание триеновых кислот (главным образом линоленовой) за счет пониженного уровня диеновых (преимущественно линолевой) в СЛ листьев по сравнению с почками у березы повислой и березы пушистой. Рост листовой пластинки у березы повислой и березы пушистой сопровождался снижением относительного содержания линолевой кислоты и повышением – линоленовой, что было наиболее выражено в ГЛ листьев [3]. Увеличение степени ненасыщенности ЖК в процессе развития листа связывают с биогенезом хлоропластов, мембраны тилакоидов которых отличаются высоким содержанием ННЖК (до 85–90% от суммы жирных кислот) [21]. Также при исследовании динамики ЖКС СЛ хвои ели сибирской (Picea obovata L.) в течение первой половины вегетационного периода (март–июль) было показано, что весенний максимум содержания линоленовой кислоты совпадал с максимумом содержания хлорофиллов в светособирающих комплексах фотосинтетических единиц и началом нетто-ассимиляции СО₂, летний – с самым высоким за исследуемый период содержанием хлорофиллов [22].

Триеновые ЖК обладают значительно более низкой, по сравнению с насыщенными, моно- и диеновыми ЖК температурой плавления, что крайне важно для сохранения мембранами жидкокристаллического состояния, обеспечивающего активное протекание метаболических процессов в клетке. Преимущественное накопление линоленовой кислоты именно в тилакоидных мембранах хлоропластов обусловлено той важной ролью, которую она играет в процессе фотосинтеза. Она способна принимать спиральную конформацию, что позволяет включающим ее липидам образовывать комплексы с мембранными белками и пигментами при построении фотосинтетических субъединиц и обеспечивает возможность переноса электронов по электрон-транспортной цепи хлоропластов [17].

Сравнительный анализ показал, что максимальное содержание ННЖК в почках растений рода Betula и в органах хвойных растений зафиксировано в зимний период, что обеспечивает поддержание жидкого фазового состояния мембран [4, 13, 23]. При переходе лиственных и хвойных древесных растений от зимнего к весеннему периоду повышается скорость гидрогенизации двойных связей ННЖК липидов почек и, как следствие, происходит снижение их доли в ЖКС липидов. Также, как при росте молодого листа березы, при формировании фотосинтетического аппарата в клетках молодой хвои Larix sibirica Ledeb., Picea obovata Ledeb. и Pinus sylvestris L. в составе ННЖК ГЛ почти вдвое возрастала доля триеновых ЖК [13]. Следует отметить, что у Pinus sylvestris L. повышение относительного содержания линоленовой кислоты в липидах хлоропластных мембран хвои происходило и при ингибировании фотосинтетического аппарата в результате их реорганизации в условиях понижения температуры и освещенности в осенний период, что объясняется ее ролью в адаптации растительного организма к неблагоприятным условиям среды [16]. Изменения в ЖКС лиственных и хвойных древесных растений свидетельствуют о наличии у них определенной аналогии в перестройке клеточного метаболизма в сезонных циклах их развития.