Физиология растений, 2021, T. 68, № 4, стр. 430-438

ВВЕДЕНИЕ

Активные формы кислорода (АФК) образуются в процессе метаболизма растений и выполняют важные функции, участвуют в сигналинге, модулируют процессы жизнедеятельности, являются компонентами адаптивных реакций [1, 2]. Неблагоприятное воздействие факторов окружающей среды является основной причиной избыточного образования АФК, что может привести к окислительному повреждению важнейших биомолекул – белков, ДНК, липидов, торможению ростовых процессов и снижению продуктивности растений [2]. Поэтому поддержание окислительно-восстановительного баланса является важным условием сохранения структурно-функциональной целостности растительных клеток и тканей. Устойчивость растительных организмов к окислительному стрессу во многом зависит от состояния системы детоксикации АФК, включающей антиоксидантные ферменты и низкомолекулярные антиоксиданты. Однако функция антиоксидантной системы растений состоит не в полном устранении АФК, а в достижении надлежащего баланса между их производством и удалением, совместимого с процессами фотосинтеза и в то же время позволяющего эффективно передавать окислительно-восстановительные сигналы в ядро [3].

Эффективность и направленность работы антиоксидантной системы растений зависит от таксономического положения и фазы развития, а также типа, силы и продолжительности воздействия стресс-фактора [4–6]. Несмотря на множество исследований, функционирование про-/антиоксидантного метаболизма растений в природных условиях изучено слабо, а количество модельных видов весьма ограничено. Большой интерес в этом отношении представляют растения, отличающиеся по типу фотосинтетического метаболизма углерода и особенно растения, способные индуцировать переход с C₃ на CAM при стрессовых воздействиях [7]. Следует отметить, что CAM (Сrassulaceae Acid Metabolism) осуществляют преимущественно виды растений, обитающие в условиях, где экологические факторы (дефицит влаги, засоление, избыточная инсоляция, высокие температуры и др.) способствуют повышению генерации АФК.

Изучение видов с разным типом фотосинтетического метаболизма углерода показало, что листья CAM-растений накапливали в 2 раза больше Н₂О₂, чем листья C₃- и C₄-растений, которые не отличались существенно по этому показателю [4]. Некоторые авторы считают пероксид водорода ключевым метаболитом, участвующим в регуляции перехода с C₃ на CAM тип фотосинтеза [8, 9].

Очитник трехлистный (Hylotelephium triphyllum (Haw.) Holub) является одним из немногочисленных видов природной флоры таежной зоны, способных к индукции CAM-фотосинтеза. О переходе с C₃ на CAM свидетельствуют закономерные изменения кислотности клеточного сока, содержания малата и активности ФЕП-карбоксилазы. Нами установлено, что с началом генеративного развития в листьях H. triphyllum существенно повышалась кислотность клеточного сока, увеличивалось содержание малата, возрастал уровень активности ФЕП-карбоксилазы [10]. Наиболее выраженные суточные флуктуации этих показателей отмечали в фазу цветения, которая приходится на наиболее теплый период вегетации (июль). В этот период титруемая кислотность клеточного сока листьев очитника в утренние часы достигала 100 нмоль[H⁺]/г сырой массы и снижалась к полудню в 4–5 раз, тогда как в фазу вегетативного роста (май) величина данного показателя варьировала в течение суток в пределах 10–12 нмоль[H⁺]/г сырой массы. Суточные изменения кислотности коррелировали с содержанием малата. Уровень активности ФЕП-карбоксилазы повышался в 1.5 раза на фоне снижения пула органических кислот. Переход H. triphyllum на CAM в период генеративного развития способствует сохранению фотосинтетического аппарата и реализации репродуктивного потенциала растений, обитающих на легко теряющих влагу песчано-супесчаных почвах в условиях гумидного климата таежной зоны европейского Северо-Востока.

Цель работы – провести сравнительное изучение ключевых показателей про-/антиоксидантного статуса листьев Hylotelephium triphyllum и Plantago media и выявить особенности окислительного метаболизма C₃- и CAM-растений, обитающих в сходных природных условиях подзоны средней тайги европейского Северо-Востока России.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Очитник трехлистный (Hylotelephium triphyllum (Haw.) Holub) – многолетнее травянистое растение сем. Crassulaceae. Побеги монокарпические, плотно облиственные, неразветвленные; листья уплощенные, продолговато-яйцевидной формы с толстой кутикулой. Размножается семенами, частями стеблей и корневища. Вид обычен в лесной зоне. На территории Республики Коми встречается в пойме, на склонах, вырубках, бечевниках. Произрастает на глинистой, песчаной и супесчаной почве, известняках, сланцевых обнажениях и скалах. Суккулентные черты и способность осуществлять C₃-CAM переход отражают адаптацию этих растений к недостатку влаги [11].

Подорожник средний (Plantago media L.) – многолетнее травянистое растение сем. Plantaginaceae. Стебель прямостоячий, чаще восходящий. Листья широколанцетные или эллиптические, плоские, с 7 – 9 жилками, острые, опушенные. Размножается семенами и вегетативным путем. Бореальный евроазиатский вид. На территории Республики Коми встречается на пойменных лугах, по обочинам дорог, в разреженных лесах, бывает пионером на отмелях и обнажениях известняка. Типичный C₃-вид. Как и все виды рода, P. media проявляет высокую морфофизиологическую пластичность, способность формировать фенотипы, адаптированные к обитанию в разных экотопах [12].

Полевые исследования проведены в июне–августе 2017 и 2018 гг. в подзоне средней тайги Республики Коми (европейский Северо-Восток России). В работе использовали растения, произрастающие на слабо покрытом растительностью участке с дерново-слоистой песчано-супесчаной, хорошо дренируемой почвой в прирусловой части поймы левого берега р. Вымь (62°16′19.4′′ N 50°39′29.1′′ E). Участок расположен вблизи Лесоэкологического стационара Института биологии Коми НЦ УрО РАН.

Климат района умеренно континентальный. Средняя температура самого теплого месяца июля около +16°C, самого холодного месяца января −16°C. Средняя суточная температура воздуха выше 10°C наблюдается 90 дней в году. Среднегодовое количество осадков составляет 700 мм, половина приходится на вегетационный период (май–август) [13]. В целом, погодные условия в годы проведения исследований соответствовали среднемноголетним значениям регионального климата, но в отдельные периоды вегетации наблюдались отклонения в ту или иную сторону (табл. 1).

Микроклиматические условия (освещенность, температура и влажность воздуха) в местах обитания растений регистрировали во время отбора образцов с помощью портативной метеостанции LI-1400 (“LI-COR”, США) с набором датчиков. Определения показали, что в ясный солнечный день освещенность на уровне растений достигала 1400−1600 мкмоль квантов/м² с, а интенсивность УФ (А + Б)-радиации – 15 Вт/м². Относительная влажность воздуха варьировала в пределах от 30 до 80%. Температура поверхности листьев в полуденные часы превышала температуру воздуха в среднем на 2−3°С.

Для характеристики ключевых показателей состояния про-/антиоксидантной системы исследуемых растений использовали функционально зрелые листья. Образцы (по одному листу с 25−30 растений) отбирали в период генеративного развития растений (июнь−август) ранним утром (6 ч), днем (11−16 ч) и поздним вечером (21−22 ч). Высечки (1−1.5 см) средней части листовой пластинки массой около 500 мг помещали в сосуд с жидким азотом, транспортировали в лабораторию и хранили до проведения анализов при температуре −70°С. Содержание сухого вещества определяли в образцах, высушенных до постоянной массы при 105°C.

Активность перекисного окисления липидов оценивали по содержанию в листьях продуктов, реагирующих с тиобарбитуровой кислотой (ТБК-РП) [14]. Растительный материал гомогенизировали в 0.1 М Трис-HCl буфере, pH 7.6, содержащем 0.35 М NaCl. В гомогенат добавляли 0.5% ТБК в 20% трихлоруксусной кислоте. Пробы помещали в нагретую до 95–100°С водяную баню на 30 мин. Затем охлаждали и центрифугировали 10 мин при 10 000g. Оптическую плотность супернатанта измеряли при длине волны 532 и 600 нм. Здесь и далее использовали двухлучевой спектрофотометр Shimadzu UV-1700 (“Shimadzu”, Япония). Количество ТБК-РП рассчитывали с учетом коэффициента экстинкции (ε = 155 мМ^–1 см^–1) после вычитания неспецифического поглощения при 600 нм.

Содержание пероксида водорода (Н₂О₂) определяли с использованием ксиленолового оранжевого [15]. Образец растирали в жидком азоте, добавляя 4 мл дистиллированной воды. Гомогенат центрифугировали 15 мин при 12 000 g. Супернатант и реагент смешивали в соотношении 1 : 1. Состав реагента: 0.5 мМ Fe(NH₄)(SO₄)₂·6H₂O (соль Мора), 0.5% (v/v) H₂SO₄, 200 мкМ ксиленолового оранжевого (“Sigma”) и 200 мМ сорбитола. Смесь инкубировали 40 мин при комнатной температуре. Затем центрифугировали в течение 5 мин при 10 000 g. Оптическую плотность раствора измеряли при 560 нм. Содержание Н₂О₂ определяли по калибровочным зависимостям. Проверку на специфичность проводили по ингибированию образования Н₂О₂ при добавлении каталазы (активность 500 ед/мг белка, производитель “Sigma”).

Активность супероксиддисмутазы (SOD) определяли по ее способности подавлять фотохимическое восстановление нитросинего тетразолия (НСТ) [16]. Реакционную смесь готовили на 0.1 М Na-фосфатном буфере, рН 7.8. В состав реакционной среды входили: L-метионин 39 мкМ, НСТ 0.245 мкМ, Тритон Х-100 1% раствор и Na-ЭДТА 0.3 мкМ (все реактивы производства “Sigma”). К пробе добавляли 0.1 мл супернатанта, к контролю вместо супернатанта добавляли 0.1 мл Na-фосфатного буфера. Для запуска ферментативной реакции вносили водный раствор рибофлавина (117 мкМ). После смешивания содержимое проб освещали в течение 10 мин при 40 клк. Пробирка с белком, находившаяся в темноте, служила контрольной пробой. Оптическую плотность измеряли при 560 нм. Активность SOD выражали в ед/мг белка.

Содержание растворимого белка анализировали по методу Brаdford [17], используя в качестве стандарта бычий сывороточный альбумин.

Для индукции окислительного стресса в листьях H. triphyllum использовали метилвиологен (паракват). Отделенные листья экспонировали в растворе метилвиологена (10 мкМ) в течение 12 ч в темноте, затем выставляли на 2 ч на умеренный свет (интенсивность ФАР 600 мкмоль квантов/м² с). Контрольные листья помещали в воду, остальные манипуляции проводили, как и с опытными листьями. После завершения эксперимента образцы листьев фиксировали в жидком азоте.

Все анализы проводили в 3–5-кратной биологической и 2–3-кратной аналитической повторности. Для сравнения средних величин применяли дисперсионный анализ ANOVA (критерий Дункана). Расчеты осуществляли при заданном уровне значимости P ≤ 0.05. На рисунках и в таблицах представлены средние арифметические значения и их стандартные ошибки.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Интенсивность перекисного окисления липидов принято рассматривать как один из показателей уровня окислительного стресса. Мы оценивали активность липопероксидации по накоплению в листьях продуктов, реагирующих с тиобарбитуровой кислотой.

В период генеративного развития содержание ТБК-РП в листьях H. triphyllum варьировало в зависимости от времени суток и сроков определения от 300 до 500 нМ/г сухой массы (рис. 1). В полуденное и послеполуденное время количество ТБК-РП в листьях было в среднем на 15–25% больше, чем рано утром или поздно вечером. Суточная динамика изменения содержания ТБК-РП в листьях P. media не отличалась существенно от таковой в листьях H. triphyllum. Однако уровень накопления продуктов липопероксидации был заметно ниже. Максимальные значения содержания ТБК-РП немногим превышали 350 нМ/г сухой массы, а основная часть данных варьировала в пределах 230–280 нМ/г сухой массы.

Рис. 1.

Содержание продуктов липопероксидации (ТБК-РП) в листьях Hylotelephium triphyllum (а–в) и Plantago media (г, д) в период генеративного развития растений: а – начало бутонизации (20–21 июня 2017 г.), б – массовое цветение (19–20 июля 2017 г.), в – массовое цветение/начало плодоношения (30 июля–1 августа 2018 г.), г – бутонизация/начало цветения (2–3 июля 2018 г.), д – массовое цветение/начало плодоношения (1–2 августа 2018 г.). Разные латинские буквы над столбцами обозначают статистически значимые суточные изменения величины исследуемого показателя при P ≤ 0.05.

Листья H. triphyllum характеризовались сравнительно высоким накоплением пероксида водорода. Содержание Н₂О₂ в них варьировало в зависимости от времени суток и сроков определения в пределах 70–90 мкМ/г сухой массы (рис. 2). В суточной динамике проявлялась тенденция снижения концентрации Н₂О₂ в дневные часы. Содержание Н₂О₂ в листьях P. media не превышало 25 мкМ/г сухой массы, что в 3–4 раза меньше, чем в листьях H. triphyllum. В отличие от H. triphyllum, концентрация Н₂О₂ в листьях P. media повышалась в дневные часы, достигая максимальных значений к полудню, затем снижалась.

Рис. 2.

Содержание пероксида водорода в листьях Hylotelephium triphyllum (а–в) и Plantago media (г, д) в период генеративного развития растений: а – массовое цветение (19–20 июля 2017 г.), б – начало бутонизации (2–3 июля 2018 г.), в – массовое цветение/начало плодоношения (30 июля–1 августа 2018 г.), г – бутонизация/начало цветения (2–3 июля 2018 г.), д – массовое цветение/начало плодоношения (1–2 августа 2018 г.). Разные латинские буквы над столбцами обозначают статистически значимые суточные изменения величины исследуемого показателя при P ≤ 0.05.

Уровень активности супероксиддисмутазы в листьях P. media варьировал в зависимости от времени суток и сроков определения в пределах от 18 до 28 ед/мг белка (рис. 3). Активность SOD повышалась днем в среднем на 25% и достигала максимальных значений в полуденные и послеполуденные часы. Следует отметить, что активность SOD в листьях P. media в конце июля – начале августа была несколько выше, чем в начале июля.

Рис. 3.

Активность супероксиддисмутазы в листьях Hylotelephium triphyllum (а–г) и Plantago media (д, е) в период генеративного развития растений: а – начало бутонизации (20–21 июня 2017 г.), б – массовое цветение (19–20 июля 2017 г.), в – начало бутонизации (2–3 июля 2018 г.), г – массовое цветение/начало плодоношения (30 июля–1 августа 2018 г.), д – бутонизация/начало цветения (2–3 июля 2018 г.), е – массовое цветение/начало плодоношения (1–2 августа 2018 г.). Разные латинские буквы над столбцами обозначают статистически значимые суточные изменения величины исследуемого показателя при P ≤ 0.05.

По сравнению с P. media уровень активности SOD в листьях H. triphyllum был существенно выше, от 40 до 90 ед/мг белка (рис. 3). В начале июля (фаза бутонизации – начало цветения) активность SOD составляла в среднем 50 ед/мг белка, к концу июля – началу августа (фаза массового цветения – начала плодоношения) повышалась в 1.4 – 2.2 раза. Уровень активности SOD в течение суток либо достоверно не изменялся, либо снижался к ночи.

Для тестирования реакции про-/антиоксидантного метаболизма H. triphyllum на усиление окислительного стресса свежесобранные листья обрабатывали метилвиологеном. Воздействие метилвиологеном (10мкМ) в течение 12 ч в темноте с последующей 3 ч экспозицией на свету не оказало влияния на содержание Н₂О₂ в листьях (табл. 2). Обработанные листья накапливали меньше (в 1.2 раза) продуктов липопероксидации, чем контрольные. При этом уровень активности SOD в них был в 1.6 раза больше.

Таким образом, нами установлено, что в период генеративного развития растений листья факультативного CAM-вида H. triphyllum характеризовались более высоким про-/антиоксидантным статусом, чем листья обитающего в тех же условиях C₃-вида P. media.

ОБСУЖДЕНИЕ

Листья относятся к органам, характеризующимся наиболее высокой активностью энерго-пластического обмена. В клетках мезофилла функционируют основные источники генерации АФК – хлоропластные и митохондриальные ЭТЦ [1, 2]. Усиление образования АФК в условиях, когда не вся поглощенная энергия может быть использована при фотосинтезе, ведет к нарушению про-/антиоксидантного баланса и интенсификации окислительных процессов в тканях [3]. Хорошими индикаторами про-/антиоксидантного статуса растений, на наш взгляд, могут служить ключевые показатели про-/антиоксидантного метаболизма: накопление продуктов перекисного окисления липидов, содержание Н₂О₂ (наиболее стабильная форма АФК) и уровень активности основного фермента актиоксидантной защиты – супероксиддисмутазы. Уникальность SOD состоит в том, что этот фермент контролирует концентрацию ${\text{O}}_{2}^{{\centerdot - }}$ и Н₂О_2.

Нами установлено, что в период генеративного развития листья факультативного CAM- растения H. triphyllum характеризовались более высоким про-/антиоксидантным статусом, чем листья обитающего в тех же условиях C₃-вида P. media. В фазу массового цветения, когда признаки CAM у H. triphyllum были хорошо выражены [10], его листья накапливали около 400 нМ/г сухой массы продуктов перекисного окисления липидов, что в 1.2 раза больше, чем в листьях P. media. Содержание Н₂О₂ в листьях H. triphyllum достигало 90 мкМ/г сухой массы, тогда как у P. media не превышало 25 мкМ/ г сухой массы. Уровень активности SOD в листьях H. triphyllum в 3 раза выше, чем в листьях P. media. Сравнительные данные свидетельствуют об интенсивном про-/антиоксидантном метаболизме листьев факультативного CAM-растения H. triphyllum, что согласуется с имеющимися в литературе сведениями о содержании АФК в растениях с разным типом фотосинтетического метаболизма углерода [4].

Известно, что в индукции C₃-CAM перехода важную роль играют факторы внешней среды и, в первую очередь, водный дефицит. Считается, что воздействие стресс-факторов приводит к усилению генерации АФК и, как следствие, активации механизмов антиоксидантной защиты в клетках. Однако, вопрос о том, является ли CAM причиной или следствием окислительного стресса окончательно не решен [18]. Так, например, авторы исследования модельного растения Mesembryanthemum crystallinum пришли к выводу, что переход на CAM может снижать уровень образования АФК, поскольку способствует поддержанию фотосинтеза при закрытых устьицах [19]. Согласно нашим данным CAM не вносил существенного вклада в рост и накопление биомассы растений H. triphyllum [10].

До сих пор дискуссионным остается вопрос, как происходит детекция сигнала и что представляет собой каскад событий, ведущих к индукции CAM. В литературе обсуждается значение Н₂О₂ как одного из индукторов C₃-CAM перехода [8, 9]. Н₂О₂ является одной из самых распространенных и стабильных форм АФК, способных диффундировать через цитоплазматические и внутриклеточные мембраны по водным каналам – аквапоринам [20]. Н₂О₂ может влиять на проницаемость плазмодесм, регулируя тем самым транспорт веществ и воды. Показано также, что H₂O₂ участвует в индуцируемом АБК закрывании устьиц [21]. Увеличение содержания Н₂О₂ предшествовало переключению на CAM-тип метаболизма растений M. crystalinum при добавлении NaCl в корневую среду [22]. Добавление в корневую среду экзогенной Н₂О₂ (50, 100 и 200 мМ) приводило к увеличению амплитуды суточных изменений содержания малата [23]. По мнению авторов данной работы, повышение концентрации этого метаболита в ночное время до 400 мМ свидетельствовало об индукции перехода с С₃ на САМ-тип фотосинтетического метаболизма углерода. Интересно отметить, что C₃-CAM переход сопровождался снижением каталазной активности. Как известно, каталаза играет важную роль в регуляции содержания Н₂О₂ в клетках растений. Фермент осуществляет разложение двух молекул Н₂О₂ с выделением молекулярного кислорода и воды. Каталаза имеет высокую скорость оборота, но низкое сродство к H₂O₂, она начинает работать при концентрации Н₂О₂ выше 10^–6 М [24]. Нам не удалось получить достоверные данные о каталазе в листьях H. triphyllum, возможно из-за низкого уровня ее активности.

Супероксиддисмутаза является одним из основных ферментов антиоксидантной системы, нейтрализующих супероксид-радикал в реакции дисмутации до молекулярного кислорода и Н₂О₂ [25]. Другими словами, образование Н₂О₂ зависит от активности SOD. Как уже отмечалось, уровень активности SOD в листьях H. triphyllum был в 3 раза выше, чем у обитающего в тех же условиях типичного C₃-растения P. media. По-видимому, высокое содержание Н₂О₂ в листьях H. triphyllum, по крайней мере частично, обусловлено повышенной активностью SOD. Это согласуется с имеющимися в литературе данными. Так, например, активность SOD в листьях Guzmania monostachia (бромелиевые) увеличивалась при индукции CAM под действием высокой освещенности и водного дефицита [26]. Причем изменения активности SOD в апикальной части листа были выражены в большей степени, чем в базальной. Повышение активности SOD при водном дефиците было обнаружено у различных видов сем. Crassulaceae [27, 28]. Интересно отметить, что у типичного CAM-вида Sedum album изменения активности ферментов, контролирующих содержание пероксида водорода – супероксиддисмутазы и каталазы, были выражены сильнее по сравнению с CAM-cycling видом S. stoloniferum [28].

Известно, что существует три различных формы SOD, причем Cu/Zn-SOD, в отличие от Fe-SOD и Mn-SOD (соответственно хлоропластная и митохондриальная формы), присутствует в цитозоли, хлоропластах, пероксисомах, межмембранном пространстве митохондрий и апопласте [25]. Так как в данной работе мы не определяли изоформы фермента, то не имеем возможности оценить их вклад в общую активность. Однако тот факт, что уровень активности SOD в листьях H. triphyllum был не только существенно выше, но и более стабильным в течение суток позволяет предположить доминирование Cu/Zn-SOD, присутствующей практически во всех клеточных компартментах.

Поскольку содержание растворимого белка в листьях P. media варьировало в пределах 10–15 мг/г сухой массы, а у H. triphyllum его концентрация была вдвое меньше, мы пересчитали активность SOD на единицу содержания хлорофилла (данные не приводятся). Выявленные различия в уровне активности SOD в листьях двух исследованных видов сохранялись и не зависели от способа расчета.

Тот факт, что SOD вносит весомый вклад в защиту H. triphyllum от окислительного стресса и контролирует накопление пероксида водорода в период функционирования CAM, подтверждается результатами опыта с метилвиологеном. Обработка листьев индуктором окислительного стресса активировала данный фермент. В результате содержание Н₂О₂ в листьях оставалось стабильным. Видимо, сохранение стабильно высокого уровня Н₂О₂ играет важную роль в регуляции CAM.

Несмотря на многократную разницу в содержании Н₂О₂ и активности SOD, исследованные виды сопоставимы по накоплению продуктов перекисного окисления липидов в листьях (разница не превышала 20%). В связи с этим следует отметить, что произрастание P. media на открытых участках приводит к формированию светового фенотипа, характеризующегося меньшим габитусом растений и более высоким уровнем перекисного окисления липидов по сравнению с растениями, обитающими в затененных условиях [29, 30].

Таким образом, нами установлено, что в период генеративного развития листья факультативного САМ растения H. triphyllum накапливали в 4–5 раз больше пероксида водорода и отличались высокой активностью SOD по сравнению с листьями обитающего в тех же условиях типичного С₃ растения P. media. Обработка листьев H. triphyllum индуктором окислительного стресса – метилвиологеном (10 мкМ) – повышала уровень активности SOD, но не повлияла существенно на содержание Н₂О₂ и накопление продуктов перекисного окисления липидов. Наши результаты и имеющиеся в литературе сведения указывают на то, что высокий уровень про-/антиоксидантного метаболизма является общей характеристикой CAM-видов и обусловлен ограничением дневной ассимиляции углерода при адаптации к неблагоприятным условиям среды. Учитывая функции пероксида водорода и его стабильно высокое содержание в листьях H. triphyllum, логично предположить, что Н₂О₂ может участвовать в регуляции CAM. Изучение ключевых показателей, характеризующих про-/антиоксидантный статус растений в природных условиях, позволяет углубить понимание биохимических механизмов и путей их адаптации к условиям среды.

Работа выполнена в рамках темы госбюджетных научно-исследовательских и опытно-конструкторских работ “Физиология и стресс-устойчивость фотосинтеза растений и пойкилогидрических фотоавтотрофов в условиях Севера” (№ АААА-А17-117033010038-7).

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов. Настоящая статья не содержит каких-либо исследований с участием людей и животных в качестве объектов.