Физиология растений, 2021, T. 68, № 5, стр. 544-552

ВВЕДЕНИЕ

Растения являются одними из самых сложных по своему химическому составу организмов. Вариабельная часть этого состава определяется, прежде всего, образованием и накоплением веществ “специализированного” обмена (вторичных метаболитов), роль которых в жизнедеятельности растения является предметом многочисленных дискуссий. В настоящее время превалирующая точка зрения – участие вторичных метаболитов во взаимодействии растения с окружающей средой: формирование и регуляция связей в различных типах сосуществования растений с другими организмами (симбиотические, антагонистические и другие варианты отношений организмов), реакция растительного организма на изменения абиотических факторов среды и т.д. [1]. Одним из перспективных подходов к выяснению функциональной значимости вторичного метаболизма является его изучение в культуре клеток высших растений – уникальной биологической системе, в которой многие биохимические процессы (включая и вторичный метаболизм) реализуются отличным от интактных растений образом [1, 2]. Сопоставление закономерностей специализированного обмена в растительных клетках in vivo и in vitro при знании специфики и условий их жизнедеятельности позволяет делать обоснованные выводы о функциональной роли этого процесса [1].

В настоящее время фитохимическое изучение клеток растений in vitro в большинстве случаев осуществляется путем сопоставления хроматографических профилей экстрактов из биомассы культур клеток с хроматограммами стандартных образцов характерных для конкретного растения вторичных метаболитов (эту стратегию фитохимического изучения культур клеток растений условно можно обозначить как “классическую”) [2]. Такой подход не позволяет обнаружить весь спектр образуемых в культурах клеток соединений, что, по-видимому, лежит в основе широко распространенного мнения об ограниченности специализированного метаболизма в клетках растений in vitro [1–3]. В то же время, тщательное химическое изучение культур клеток растений с применением всего арсенала фитохимических методов (различные варианты тонкослойной хроматографии, препаративное выделение индивидуальных соединений и описание их структуры с помощью спектроскопии ЯМР и т.д.) свидетельствует о возможности образования в культивируемых клетках растений нехарактерных и/или “минорных” (встречающиеся редко и в исчезающе малых количествах) для интактных растений метаболитов, коммерческие стандартные образцы которых в подавляющем большинстве случаев отсутствуют [2, 4]. Таким образом, “классическая” стратегия фитохимического анализа не всегда предоставляет корректные сведения о разнообразии вторичных метаболитов в клетках растений in vitro.

Современный этап развития фитохимии характеризуется активным использованием при описании структурного разнообразия вторичных метаболитов в интактных растениях различных видов хромато-масс-спектрометрии [5]. В наиболее универсальном варианте этот экспериментальный подход основан на совместном применении жидкостной хроматографии (высоко- или ультраэффективной – ВЭЖХ или УЭЖХ соответственно) с квадрупольной-времяпролетной масс-спектрометрией при электрораспылительной ионизации. В англоязычной литературе этот экспериментальный подход именуется как LC-ESI-Q-TOF-MS (liquid chromatography electrospray ionization quadrupole time-of-flight mass spectrometry) [5]. Применение LC-ESI-Q-TOF-MS при фитохимическом анализе позволило существенно расширить представления о сложности химического состава растений. В одной из пионерских работ этого направления было показано, что LC-ESI-Q-TOF-MS позволяет обнаружить и структурно описать в различных образцах видов женьшеня (Panax spp.) более 600 тритерпеновых гликозидов (гинзенозидов) разной структуры [6]. При этом возможна надежная структурная идентификация метаболитов, содержание которых исчезающе мало – до 10^–4% от сухой массы растительных образцов, что было подтверждено с помощью “классических” методов фитохимии: препаративного выделения индивидуальных соединений и изучения их структуры с помощью спектроскопии ядерного магнитного резонанса (ЯМР) [6].

Однако если при исследовании интактных растений хромато-масс-спектрометрия (в том числе и LC-ESI-Q-TOF-MS) в настоящее время является уже рутинным методом, то для фитохимического анализа культивируемых in vitro клеток растений этот экспериментальный подход используется достаточно редко [7]. На основании изложенного можно предположить, что использование хромато-масс-спектрометрии, прежде всего LC-ESI-Q-TOF-MS, при изучении культур клеток растений позволит получить более объективную информацию о биохимических особенностях этой уникальной биологической системы, и поэтому подобные работы имеют несомненное фундаментальное и прикладное значение.

Мандрагора (Mandragora spp.) – род травянистых многолетних растений семейства Solanaceae. Является легендарным растением средневековой Европы, упоминается в Библии. В настоящее время установлено, что многие свойства мандрагоры обусловлены наличием тропановых алкалоидов – гиосциамина, атропина, скополамина и ряда других [8–10].

Эндемичный вид горных районов юго-запада Туркмении Mandragora turcomanica Mizgir. был описан в 1942 году и является, пожалуй, одним из наиболее редких лекарственных растений [8]. Природная популяция M. turcomanica насчитывает всего несколько сотен экземпляров растений. При этом особенности биологии этого растения затрудняют интродукцию вида (например, в условиях ботанических садов) и/или плантационное выращивание [8–10]. Эти обстоятельства предопределяют актуальность работ по получению и подробному изучению культур клеток M. turcomanica in vitro.

В 1981 году в ИФР РАН Р.Г. Бутенко и Н.А. Мясоедовым из листа интактного растения M. turcomanica была получена культура клеток, которая поддерживается в растущем состоянии методом пересева по настоящее время.

Целью настоящей работы было фитохимическое изучение с помощью ультраэффективной жидкостной хроматографии, совмещенной с масс-спектрометрией высокого разрешения при ионизации электрораспылением (УЭЖХ-ИЭР-МС, один из вариантов LC-ESI-Q-TOF-MS), биомассы суспензионной культуры клеток M. turcomanica, поддерживаемой в культуре in vitro более 30 лет.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Объект исследования. В качестве объекта исследования использовали гетеротрофную суспензионную культуру клеток мандрагоры туркменской (Mandragora turcomanica Mizgir.), которая поддерживается в активно растущем состоянии с 1981 г. во Всероссийской коллекции культур клеток высших растений ИФР РАН под № 31 [11].

Условия выращивания культуры клеток. Культуру клеток M. turcomanica выращивали (в соответствии с коллекционным паспортом) на модифицированной питательной среде с минеральной основой по Мурасиге-Скугу [12] с добавлением глюкозы (4%), тиамина (1 мг/л), α-НУК (3 мг/л) и БАП (0.5 мг/л) [13]. Культивирование проводили в темноте, при 26°С, на качалке (90 об./мин), в колбах объемом 250 мл с укупоркой двойным слоем алюминиевой фольги и слоем офсетной бумаги (30–40 мл суспензии в колбе). Цикл субкультивирования составлял две недели. Для химического анализа использовали биомассу на 10 сут после пересева (экспоненциальная фаза роста культуры).

Подготовка проб для УЭЖХ-ИЭР-МС анализа. Навеску воздушно-сухого растительного материала (31 мг) экстрагировали 3 раза по 1 мл 70% (по объему) водного этилового спирта в течение 30 минут под действием ультразвука (УЗВ-12, Сапфир, Россия), после чего центрифугировали при 10 000 об./мин в течение 10 минут (Микроцентрифуга МЦФ, Россия) и отбирали супернатант в грушевидную колбу. Объединенные спиртовые экстракты упаривали под вакуумом (при температуре 55°С). Полученный экстракт суспендировали в 1 мл дистиллированной воды и наносили на патрон для твердофазной экстракции Supelclean ENVI-18 (Supelco, США). Патрон промывали 3 мл дистиллированной воды, аналиты смывали 3 мл этанола. Полученный раствор упаривали под вакуумом при 55°С. Перед анализом экстракты растворяли в 1 мл смеси ацетонитрил-вода (1 : 1, по объему).

УЭЖХ-ИЭР-МС. Анализ проводили на хроматографе Waters Acquity UPLC (Waters, США), оснащенном гибридным квадрупольным времяпролетным масс-спектрометром XEVO QTOF (Waters, США). Пробу в объеме 1 мкл наносили на колонку ACQUITY UPLC BEH Phenyl (50 × 2.1 мм, 1.7 мкм; Waters, Ирландия). Температура колонки составляла 40°С, объемная скорость потока подвижной фазы – 0.4 мл/мин. В качестве подвижной фазы использовали 0.1% (по объему) раствор муравьиной кислоты в воде (растворитель А) и 0.1% (по объему) раствор муравьиной кислоты в ацетонитриле (растворитель Б). Хроматографическое разделение проводили в режиме градиентного элюирования. В процессе анализа состав подвижной фазы менялся следующим образом (Б, % по объему): 0–1 мин – 15%, 1–5 мин – от 15 до 30%, 5 – 15 мин – от 30 до 38%, 15 – 15.5 мин – от 38 до 45%, 15.5 – 23 мин – 45%, 23 – 23.5 мин – от 45 до 95%. Анализ осуществляли в режиме детектирования положительных и отрицательных ионов (диапазон m/z 100–2000). Параметры источника ионизации: температура источника ионизации 120°С, температура десольвации 250°С, напряжение на капилляре 3.0 кВ, напряжение на конусе ввода пробы 30 В, скорость подачи азота (десольвационный газ) 600 л/час. Обработку полученных результатов производили с помощью программы MassLynx (Waters, США).

РЕЗУЛЬТАТЫ

На первом этапе работы был проведен УЭЖХ-ЭР-МС анализ спиртового экстракта из биомассы суспензионной культуры клеток M. turcomanica в режиме детектирования положительно-заряженных ионов. Выбор этого режима обусловлен тем фактом, что при ионизации электрораспылением для положительно-заряженных ионов (прежде всего, протонированных молекул ([M + H]⁺) многих природных соединений наблюдается фрагментация (с образованием характеристических осколочных ионов) уже в источнике ионизации [14, 15]. Анализ полученных таким образом масс-спектров позволяет провести достаточно быструю первичную структурную идентификацию соединений без осуществления дополнительных тандемных масс-спектрометрических экспериментов [15]. Для хроматографического разделения использовали градиентную программу элюирования, разработанную ранее для анализа природных соединений широкого диапазона полярности на хроматографических колонках с обращенной фазой [15].

Полученная УЭЖХ-ЭР-МС хроматограмма (полный ионный ток) представлена на рисунке 1. В общей сложности в экстракте из биомассы суспензионной культуры клеток M. turcomanica было обнаружено 9 хроматографических пиков соединений (элюируются с хроматографической колонки в пределах 0.5–4.0 мин), которые в порядке увеличения времени удерживания на хроматографической колонке были обозначены номерами от 1 до 9.

Рис. 1.

УЭЖХ ЭР МС хроматограмма (записана в режиме полного ионного тока при регистрации положительных ионов) экстракта из биомассы суспензионной культуры клеток M. turcomanica (линия 31, 10 сут выращивания). Номера 1–9 – пики идентифицированных соединений (табл. 1 и 2).

Для структурной идентификации обнаруженных соединений использовали следующую информацию: расшифровка результатов масс-спектрометрии (фрагментации протонированных молекул соединений в источнике ионизации), определение (на основании сравнения расчетного и экспериментально-измеренного значений точной моноизотопной молекулярной массы) элементарного состава соединений [16] и сравнение масс-спектрометрического и относительного хроматографического поведения соединений с данными литературы [17–22]. Данные масс-спектров и результаты идентификации обнаруженных соединений представлены в табл. 1.

Общий анализ масс-спектров положительных ионов обнаруженных соединений (табл. 1) позволяет предположить, что все они относятся к группе амидов гидроксикоричных кислот [17]. На основании структурных особенностей эти метаболиты можно разделить на четыре группы: метаболиты 1–3 – производные алифатического диамина путресцина, ацилированные остатками гидроксикоричных кислот; метаболит 9 – амид феруловой кислоты с ароматическим моноамином тирамином; метаболиты 5–8 – гексозиды амидов феруловой кислоты с тирамином (метаболиты 5–7) и метокситирамином (метаболит 8); метаболит 4 – гексозид амида феруловой кислоты с ароматическим моноамином октопамином (содержит гидроксильную группу в алифатической части моноамина). Для масс-спектров положительных ионов каждой из этих групп соединений отмечаются определенные особенности.

В масс-спектрах положительных ионов метаболитов 1–3 присутствуют три интенсивных сигнала: ион протонированной молекулы [M + H]⁺ (справедливость идентификации этого иона подтверждается наличием иона аддукта [M + Na]⁺) и два осколочных иона, образующихся в результате нейтральной потери 17 Да (отщепление концевой аминогруппы (в виде NH₃, ион [M + H – 17]⁺) остатка путресцина) и 88 Да (отщепление целого остатка путресцина, C₄H₁₂N₂, ион [M + H – 88]⁺). Характеристический ион [M + H – 88]⁺ соответствует остатку гидроксикоричной кислоты, ацилирующей одну из аминогрупп путресцина: для соединений 1 и 2 этот ион имеет значение m/z 163 (характеристический ион остатка кофейной кислоты, C₉H₇${\text{O}}_{3}^{ + }$); для соединения 3 – m/z 177 (характеристический ион остатка феруловой кислоты, C₁₀H₉${\text{O}}_{3}^{ + }$). Таким образом, метаболиты 1, 2 и 3, по всей видимости, имеют структуру путресцина, ацилированного остатками кофейной (метаболиты 1 и 2) и феруловой (метаболит 3) кислот. Описанные закономерности фрагментации в источнике ионизации [M + H]⁺ данных соединений вполне согласуются с данными литературы [17, 21].

В масс-спектре соединения 9 присутствуют два интенсивных сигнала: [M + H]⁺ и осколочный характеристический ион (m/z 177), соответствующий остатку феруловой кислоты. Разница между значениями m/z этих ионов соответствует нейтральной потере остатка тирамина (нейтральная потеря 137 Да, C₈H₁₁NO) [17, 18, 22]. На основании этих результатов соединение 9 идентифицировано как амид феруловой кислоты и тирамина.

Фрагментация в источнике ионизации протонированных молекул [M + H]⁺ соединений 5–8 сопровождается образованием серии осколочных ионов, соответствующих последовательному отщеплению одного или двух остатков дегидратированной гексозы (нейтральная потеря 162 Да, C₆H₁₀O₅). В масс-спектрах положительных ионов соединений 5–8 присутствует характеристический ион с m/z 177. Анализ закономерностей фрагментации этих метаболитов также позволяет заключить, что в качестве “амино-компоненты” у соединений 5–7 выступает тирамин (нейтральная потеря 137 Да), а у соединения 8 – метокситирамин (нейтральная потеря 167 Да, C₉H₁₃NO₂). Таким образом, на основании изложенных результатов можно предположить, что соединения 5–8 соответствуют гликозидам (точнее – гексозидам) амидов феруловой кислоты с тирамином/метокситирамином. На основании данных только масс-спектрометрии невозможно установить, каким в точности моносахаридам соответствуют остатки гексоз, обнаруженных в составе соединений 5–8 [17, 22]. У растений встречаются гексозиды ферулоилтирамина с глюкопиранозой, галактопиранозой или аллопиранозой [17, 20, 22, 23]. Кроме того, на основании полученных масс-спектров нельзя делать выводы о позиции гликозилирования – гидроксильная группа гидроксикоричной кислоты или моноамина (у растений встречаются оба варианта присоединения углеводных цепочек к молекулам фенилэтиламидов феруловой кислоты) [17, 24, 25]. Остается также нерешенным вопрос о конфигурации двойной связи (в природе встречаются как цис-, так и транс-изомеры) остатка феруловой кислоты [17, 24]. Для уточнения этих элементов структуры соединений 5–8 требуются дополнительные исследования.

Особенностью масс-спектра положительных ионов соединения 4 (по сравнению с масс-спектрами соединений 5–8) является наличие интенсивного иона – продукта отщепления остатка воды (нейтральная потеря 18 Да) непосредственно от протонированной молекулы [M + H]⁺. В масс-спектре также присутствуют осколочные ионы, образующиеся в результате нейтральной потери остатка гексозы и характеристический ион с m/z 177. В совокупности изложенные результаты позволяют предположить, что соединение 4 соответствует гексозиду амида феруловой кислоты с моноамином октопамином (содержит гидроксильную группу в алифатической части молекулы моноамина; наличие двух нейтральных потерь 18 Да и 135 Да (H₂O и C₈H₉NO соответственно)) [18].

Справедливость проведенной интерпретации масс-спектров положительных ионов соединений 1–9 подтверждается результатами УЭЖХ-ЭР-МС анализа спиртового экстракта из биомассы суспензионной культуры клеток M. turcomanica в режиме детектирования отрицательно-заряженных ионов (табл. 2).

ОБСУЖДЕНИЕ

Идентифицированные в биомассе суспензионной культуры клеток M. turcomanica амиды гидроксикоричных кислот с путресцином (компоненты 1–3) довольно широко распространены у растений и в настоящее время рассматриваются как запасные формы, участвующие в регуляции гомеостаза этого диамина в растительных клетках [26, 27]. Ферулоилтирамин (компонент 9) относится к небольшой группе широко распространенных у растений фенилэтиламидов гидроксикоричных кислот – индуцибельных метаболитов, участвующих в биохимических реакциях растений на воздействие стресс-факторов различной природы, а также предшественников обширного класса лигнанамидов [26]. В то же время, обнаруженные в культивируемых in vitro клетках M. turcomanica гликозиды фенилэтиламидов феруловой кислоты (компоненты 4 – 8; рис. 2) относятся к одной из самых редких групп вторичных метаболитов растений. Действительно, если закономерности распространения и биосинтеза фенилэтиламидов гидроксикоричных кислот изучены достаточно подробно и с завидной частотой обобщаются в обзорных статьях [26, 27], то структурное разнообразие их конъюгатов с остатками сахаров изучено значительно хуже. В настоящее время из растений выделено около 10 моногексозидов (глюкозидов, галактозидов и аллозидов) фенилэтиламидов гидроксикоричных кислот, а для дигексозидов этих соединений (подобный метаболит идентифицирован в настоящей работе (соединение 5)) описана лишь единственная структура [20, 23–25, 28]. Гликозиды фенилэтиламидов гидроксикоричных кислот распространены в растительном мире спорадически (зафиксировано их присутствие в представителях семейств Amaranthaceae/ Chenopodiaceae, Aristolochiaceae, Menispermaceae, Papaveraceae, Ranunculaceae и Solanaceae) и накапливаются в растительных тканях в следовых количествах (содержание этих метаболитов в листьях, стеблях, корнях и корневищах растений редко превышает 0.0008% от сухой массы) [20, 23–25, 28, 29]. Имеющиеся в литературе данные позволяют выдвинуть предположение о запасной и/или транспортной функции гликозидов фенилэтиламидов гидроксикоричных кислот в клетках растений [29, 30].

Рис. 2.

Структурные формулы идентифицированных (на основании результатов УЭЖХ ЭР МС) в биомассе суспензионной культуры клеток M. turcomanica гликозидов фенилэтиламидов феруловой кислоты. Обозначения: R – H или Hex. Hex – остаток гексозы.

Следует подчеркнуть, что все описанные в настоящей работе соединения обнаружены для вида M. turcomanica впервые, однако для их более точной структурной идентификации требуются дополнительные исследования.

Важно, что в результате проведенного анализа не удалось обнаружить в биомассе суспензионной культуры клеток M. turcomanica характерных для растений рода Mandragora spp. (и многих других представителей семейства Solanaceae) вторичных метаболитов – тропановых алкалоидов, кумаринов и/или витанолидов [10].

Таким образом, в настоящей работе впервые проведено подробное хромато-масс-спектрометрическое изучение вторичных метаболитов в биомассе суспензионной культуры клеток M. turcomanica. При этом идентифицированы как широко распространенные у растений соединения (амиды гидроксикоричных кислот с путресцином и ферулоилтирамин), так и весьма редкие метаболиты (гликозиды фенилэтиламидов гидроксикоричных кислот). Важно, что значительное структурное разнообразие гликозилированных фенилэтиламидов гидроксикоричных кислот обнаружено в биомассе суспензионной культуры клеток M. turcomanica, которая поддерживается в активно растущем состоянии более 30 лет [11]. Этот результат свидетельствует о сохранении в длительно культивируемых in vitro клетках растений способности к образованию весьма сложного набора вторичных метаболитов и противоречит сложившимся представлениям [3] о закономерностях специализированного метаболизма в культурах растительных клеток.

Работа по анализу биохимического состава культуры клеток выполнена при финансовой поддержке гранта Российского фонда фундаментальных исследований 18-54-06021 Аз_а.

Работы по выращиванию культуры клеток проводили с использованием оборудования “Научно-производственного комплекса на основе разработки природосберегающей Hi-Tech биотехнологии получения высококачественного сырья фармацевтического и пищевого назначения с использованием культивируемых клеток и органов высших растений или микроводорослей”, включая оборудование Уникальных научных установок “Всероссийская коллекция культур клеток высших растений” и “Опытный биотехнологический комплекс” Института физиологии растений им. К.А. Тимирязева Российской академии наук (УНУ ОБК ИФР РАН и УНУ ВРККК ВР ИФР РАН) при финансовой поддержке Мегагранта Правительства Российской Федерации (Соглашение № 075-15-2019-1882).

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов. Настоящая статья не содержит каких-либо исследований с участием людей и животных в качестве объектов.