Физиология растений, 2021, T. 68, № 6, стр. 600-611

ВВЕДЕНИЕ

Лишайники – устойчивая ассоциация гетеротрофного организма (микобионта) и фотосинтезирующего организма (фотобионта). Присутствие фотобионта (зеленые водоросли и/или цианобактерии) превращает лишайник в автотрофную систему. Зеленые водоросли поставляют клеткам микобионта сахароспирты, цианобактерии – глюкозу и продукты биологической азотфиксации [1]. Большой вклад в развитие представлений о симбиотической природе лишайников внес выдающийся русский ботаник, один из основоположников отечественной физиологии растений А.С. Фаминцын [2]. Он фактически положил начало физиологическим исследованиям этих уникальных фототрофных организмов и получил ценный материал для понимания их биологии.

Лишайники вызывают большой интерес своей устойчивостью к обезвоживанию, гипо- и гипертермии, ионизирующему излучению и действию других неблагоприятных факторов [3]. Они доминируют в крайних местообитаниях (Арктика, Антарктида, пустыни, высокогорья), но наиболее благоприятны для обитания лишайников леса, о чем свидетельствует высокое биологическое разнообразие лихенобиоты в бореальной зоне [4]. Полагают, что в основе устойчивости лишайников лежат конститутивные механизмы поддержания структурно-функциональной целостности и индуцибельные процессы, обеспечивающие репарацию повреждений, возникающих при воздействии стресса или выходе из него [5]. Однако наши знания о физиологических механизмах устойчивости лишайников как целостной системы – микобионта, на долю которого приходится свыше 90% биомассы, и фотобионта, обеспечивающего всю ассоциацию восстановленным углеродом, все еще остаются неполными.

Lobaria pulmonaria (L.) Hoffm. (лобария легочная) – эпифитный крупнолистоватый лишайник. Вид распространен в бореальных, умеренных, горных и океанических районах северного полушария и тропических лесах Восточной и Южной Африки. Охраняется в большинстве стран северной и центральной Европы [6]. Основным фотобионтом лобарии является зеленая водоросль Symbiochloris reticulata. В цефалодиях внутри таллома заключены цианобактерии рода Nostoc, осуществляющие азотфиксацию. Водоросли образуют хорошо выраженный альгальный слой, который располагается под верхним коровым, состоящим из плотно прилегающих друг к другу грибных гиф. По нашим данным, толщина альгального слоя у зрелых талломов составляет 45–50 мкм, а клетки зеленой водоросли имеют диаметр около 5 мкм [7]. Под слоем водоросли рыхло расположены грибные гифы, формирующие сердцевину, которая определяет толщину всего таллома. Нижний коровый слой сложен плотно упакованными гифами и имеет выросты (ризины), обеспечивающие прикрепление таллома к субстрату.

Цель работы – выявление сезонных изменений функциональной активности процессов фотосинтеза и дыхания Lobaria pulmonaria, связанных с энерго-пластическим метаболизмом и устойчивостью лишайника к внешним воздействиям.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

Исследования проводили в 2012–2017 гг. Талломы (слоевища) лишайника Lobaria pulmonaria отбирали вблизи г. Сыктывкара (61°34′ с.ш., 50°33′ в.д.) в старовозрастном осиннике с примесью ели и пихты. Сбор слоевищ осуществляли со стволов деревьев на высоте 1–3 м от земли. Район исследований характеризуется умеренно-континентальным климатом, со среднегодовой температурой воздуха около +1°С. Среднесуточная температура самого теплого месяца (июля) около 17°С, самого холодного (января) – около –16°С. Годовое количество осадков составляет 600–700 мм. Наибольшее их количество выпадает летом и осенью, 60–80 мм за месяц; зимой и весной месячная норма осадков в 1.5–2 раза меньше. Переход средней суточной температуры через 0°С весной происходит во второй декаде апреля, осенью – в начале октября. Длительность безморозного периода составляет 180–190 дней, а продолжительность периода со среднесуточной температурой >5°С около 160 дней [8].

Во время отбора талломов измеряли освещенность, температуру и относительную влажность воздуха в местообитании лишайника с помощью регистрирующего устройства LI-1400 (“LI-COR”, США) с набором метеорологических датчиков. Микроклиматические параметры среды изменялись в широких пределах в зависимости от погодных условий и времени года (табл. 1). В весенне-летний период интенсивность ФАР составляла в среднем 250–300 мкмоль квантов/м² с, но при наличии солнечных бликов и “окон” в древесном пологе достигала 1000 и более мкмоль квантов/м² с. Осенью и зимой освещенность была существенно ниже. Средние значения относительной влажности воздуха (ОВВ) варьировали в зависимости от сезона года в пределах 50–70%.

Фотосинтетические пигменты экстрагировали из периферийной части свежесобранных талломов смесью ацетона с диметилсульфоксидом в соотношении 1 : 2 [9]. Содержание пигментов определяли спектрофотометрически на приборе UV–1700 (“Shimadzu”, Япония) при длинах волн 662, 644 нм (хлорофиллы а и b) и 478 нм (каротиноиды). Для анализа состава каротиноидов использовали зафиксированные в жидком азоте и лиофильно высушенные образцы. Разделение индивидуальных каротиноидов (Кар) проводили с помощью обращенно-фазовой ВЭЖХ на хроматографической системе серии Smartline (“Knauer”, Германия) с использованием колонки Диасфер-110-С18-NT (“БиоХимМак СТ”, Россия). Для построения градуировочных зависимостей использовали стандарты пигментов (“Sigma” и “Fluka”, США). Уровень деэпоксидации пигментов (DEPS) виолаксантофиллового цикла (ВКЦ) характеризовали по соотношению (Зеа + 0.5 Ант)/(Вио + + Ант + Зеа), где: Зеа – зеаксантин, Ант – антераксантин и Вио – виолаксантин. Определение содержания и состава фотосинтетических пигментов проводили в 4–6-кратной биологической повторности.

Спектры низкотемпературной флуоресценции хлорофилла а изучали у собранных в январе и хранящихся до конца апреля при температуре –18°С и свежесобранных в апреле талломов. Измерения проводили на спектрофлуориметре Hitachi-850 (“Hitachi”, Япония) при 77K (–196ºC). Для возбуждения флуоресценции применяли излучение с длиной волны 435 нм. Спектры флуоресценции регистрировали в области 650–780 нм и нормировали по интенсивности флуоресценции при λ = 735 нм.

Показатели индуцированной флуоресценции хлорофилла а ФСII измеряли с помощью флуориметра РАМ-2100 (“Walz”, Германия) после гидратации и кратковременной акклимации талломов в лабораторных условиях (температура около 22°С, интенсивность ФАР 20–30 мкмоль квантов/м² с, продолжительность 1.5–2 ч). Уровень минимальной (F₀) и максимальной (F_m) флуоресценции измеряли после выдерживания талломов 30–40 мин в темноте. Затем в течение 10–15 мин адаптировали таллом к актиничному свету различной интенсивности в диапазоне от 0 до 2000 мкмоль квантов/м² с и измеряли величины стационарного (F_t), фонового ($F_{0}^{'}$) и максимального ($F_{{\text{m}}}^{'}$) уровней флуоресценции. В качестве источника света использовали встроенную галогеновую лампу флуориметра. При оценке динамики восстановления функциональных параметров фотобионта талломов, отобранных в зимний период, слоевища после отбора в природе хранили одни сутки при –16°С, измерения проводили при температуре 22°С через определенные промежутки времени.

Потенциальный квантовый выход ФСII рассчитывали согласно [10]:

Реальный квантовый выход ФСII (Ф_PSII) у адаптированных к действующему свету талломов рассчитывали по формуле:

Значения коэффициента нефотохимического тушения флуоресценции хлорофилла а ФСII (NPQ) определяли по формуле:

Относительную скорость транспорта электронов через ФСII рассчитывали как:

где PPFD – плотность потока квантов ФАР. Для описания зависимости ETR от уровня PPFD применяли экспоненциальную функцию:

и рассчитывали величину максимальной скорости транспорта электронов (ETR_max) и величину PPFD_sat, при которой ETR равна 90% от ETR_max [11]. Определения параметров индуцированной флуоресценции хлорофилла проводили в 5–10-кратной биологической повторности.

СО₂/Н₂О-газообмен измеряли с помощью портативной системы ADC LCPro⁺ (“ADC BioScientific Ltd”, Англия) при температуре 20°С. Перед проведением измерений талломы адаптировали в условиях, аналогичных примененным при измерении показателей индуцированной флуоресценции хлорофилла. Лопасть таллома площадью 3–4 см² заключали в листовую камеру-прищепку, выдерживали в течение 2 мин и проводили серию измерений газообмена с интервалом записи данных 1 мин. Зависимость скорости нетто-поглощения СО₂ (Ф_н) талломов от освещенности определяли в диапазоне ФАР от 0 до 2000 мкмоль квантов/м² с при концентрации СО₂ около 0.04%. Для получения световой кривой использовали от 10 до 30 талломов. Квантовый выход фотосинтеза (ϕ) и световой компенсационный пункт (СКП) СО₂-газообмена таллома находили по результатам регрессионного анализа начального участка световой кривой в диапазоне ФАР от 0 до 200 мкмоль квантов/м² с.

Скорость дыхания талломов определяли по поглощению О₂ при 20°С полярографически с использованием электрода Кларка на системе Oxytherm (“Hansatech Inst.”, Англия) и выражали в нмоль О₂/г сухой массы мин. Высечки из краевых функционально активных участков талломов общей массой 15–20 мг помещали в реакционный сосуд объемом 4 мл, содержащий 1.5 мл буфера HEPES (“Helicon”, Россия), в концентрации 50 мM, величина pH 7.2. Измерения проводили при постоянном перемешивании образцов.

Активность дыхательных путей оценивали при помощи специфических ингибиторов [12]. Скорость поглощения кислорода выражали как сумму отдельных компонент:

где V_t – общее дыхание; V_alt – альтернативное дыхание, подавляемое ингибитором альтернативной оксидазы, V_cyt – цианидчувствительное (цитохромное) дыхание; V_res – остаточное дыхание, регистрируемое в присутствии ингибиторов альтернативного и цитохромного дыхательных путей.

В качестве ингибитора альтернативной оксидазы использовали 6 мМ раствор салицилгидроксамовой кислоты (“Lancaster”, Англия). Активность цитохромоксидазы подавляли 2 мМ раствором KCN (“Sigma”, США). Оптимальные концентрации ингибиторов митохондриальных оксидаз были подобраны в предварительных экспериментах.

Скорость метаболического тепловыделения измеряли на изотермическом микрокалориметре Биотест-2 (Институт биологического приборостроения Российской академии наук, г. Пущино, Россия) при 20°С. Краевые участки талломов массой около 100 мг помещали в контейнеры, герметично закрывали крышкой и устанавливали в рабочие ячейки. Для выравнивания различий тепловых потоков в ячейку сравнения устанавливали пустой контейнер. Интенсивность тепловыделения (Q, мкВт/мг сухой массы) рассчитывали по уравнению:

где q₁ – метаболическое тепловыделение от образца; q_н1 и q_н2 – нулевое значение теплового потока перед и после измерения тепловыделения объекта (отн. ед.); 0.22 – калибровочный коэффициент калориметра, мкВт, m – сухая масса образца, мг.

Статистическию обработку данных осуществляли с использованием программы Statistica 10 (StatSoft Inc., США). Значимость различий между средними значениями измеряемых показателей оценивали с применением однофакторного дисперсионного анализа ANOVA (критерий Дункана). Нормальность распределения данных оценивали с помощью критерия Шапиро–Уилкса. Расчеты осуществляли при заданном уровне значимости P ≤ ≤ 0.05. В таблицах и на рисунках приведены средние арифметические значения со стандартной ошибкой.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Содержание фотосинтетических пигментов и уровень конверсии пигментов виолаксантинового цикла. В талломе лишайников фотосинтетические пигменты являются маркерами фотобионта. Согласно полученным данным, пигментный фонд L. pulmonaria подвергался сезонным изменениям (табл. 2). Наименьшее содержание зеленых пигментов было отмечено весной (апрель). К осени (сентябрь–октябрь) фонд хлорофиллов заметно возрастал. На долю Хл а приходилось в среднем 75% суммы всех зеленых пигментов. Содержание каротиноидов (Кар) было в 3–4 раза меньше, чем хлорофиллов.

Пул Кар был представлен в основном ксантофиллами (табл. 3). Лютеин составлял около 50%, тогда как на долю неоксантина приходилось 10−12%. Пигменты виолаксантинового цикла (ВКЦ) – виолаксантин, зеаксантин и антераксантин – в сумме составляли 20−25% фонда Кар, большая их часть приходилась на виолаксантин. Уровень конверсии пигментов ВКЦ летом составлял в среднем 15%, зимой и весной повышался в 1.5–2 раза.

Анализ спектров низкотемпературной флуоресценции хлорофилла выявил, что у отобранных весной талломов соотношение интенсивностей интегрального сигнала флуоресценции при 735 и 685 нм, соответствующих максимумам флуоресценции светособирающих комплексов ФСI и ФСII, составляло 1.27 (рис. 1а). Длительное (с января по апрель) хранение талломов при –18°С приводило к повышению соотношения F₇₃₅/F₆₈₅ до 1.98 (рис. 1б). После гидратации и 30-часовой акклимации этих же талломов при температуре 22°С отмечали снижение соотношения F₇₃₅/F₆₈₅ до значений, близких к зарегистрированным у собранных в весенний период талломов.

Рис. 1.

Спектры излучения флуоресценции хлорофилла а фотобионта Lobaria pulmonaria. λ_(возб.) = 435 нм, T = 77 K. Спектры нормированы по интенсивности флуоресценции при 735 нм. Измерения проводили на собранных в апреле талломах (а), талломах, содержащихся в течение 5 месяцев при –18°С (б), и этих же талломах спустя 30 ч акклимации в условиях лаборатории (в).

Показатели индуцированной флуоресценции хлорофилла а ФСII и СО₂ – газообмен талломов. Отобранные в зимний период образцы лишайника проявляли фотохимическую активность практически сразу же после их гидратации и акклимации при 22°С. В лабораторных условиях максимальный квантовый выход ФСII (F_v/F_m) возрастал в течение первого часа с 0.54 до 0.68 отн. ед. и в дальнейшем практически не изменялся (табл. 4). Динамика изменения величины реального квантового выхода (Ф_PSII) имела сходный характер, однако временной период, необходимый для достижения стационарного уровня, был несколько больше. При умеренной освещенности (200 мкмоль квантов/м² с) величина Ф_PSII после 4 ч акклимации талломов в лабораторных условиях составила около 0.4 отн. ед. Величина коэффициента нефотохимического тушения флуоресценции хлорофилла а ФСII (NPQ), характеризующего уровень тепловой диссипации поглощенной энергии светового потока, практически не изменялась во времени и варьировала в пределах 0.8–1.2 отн. ед., проявляя тенденцию к снижению после 4 ч акклимации. Скорость фотохимического транспорта электронов через ФСII (ETR) в процессе акклимации талломов изменялась незначительно. Зарегистрированная в первые минуты после перенесения талломов в контролируемые условия величина ETR была всего на 25% меньше, чем спустя 20 ч акклимации. По сравнению с показателями ФСА, характеризующими фотохимическую активность, изменения процессов, связанных с ассимиляцией СО₂, были более выражены. Скорость нетто-поглощения СО₂ (Ф_н) неуклонно возрастала, и спустя 20 ч с начала акклимации талломов превысила 4 мкмоль CO₂/м² с.

Чтобы выявить влияние сезонных изменений факторов среды на состояние фотосинтетического аппарата, сравнивали функциональные показатели у отобранных в разные периоды года талломов. Талломы предварительно гидратировали и акклимировали в течение 1.5 ч при 22°С.

Величина F_v/F_m в течение года варьировала незначительно, в пределах 0.6–0.7 отн. ед. Показатели, характеризующие реальный квантовый выход, нефотохимическое тушение и скорость потока электронов через фотосистемы, сильно зависели от освещенности, но мало изменялись в зависимости от сезона года (рис. 2, 3). В то же время можно отметить тенденцию к снижению величины Ф_PSII и повышению NPQ у талломов, отобранных в зимне-весенний период. На сильном свету величина NPQ, отражающая активность процессов тепловой диссипации энергии, у “зимних” талломов достигала 4–5 отн. ед., а у “летних” и “осенних” не превышала 3 отн. ед.

Рис. 2.

Зависимость реального квантового выхода ФСII (а) и коэффициента нефотохимического тушения флуоресценции хлорофилла а (б) от плотности потока фотонов у талломов Lobaria pulmonaria, отобранных в разные месяцы года: 1 – апрель, 2 – июнь, 3 – октябрь, 4 – январь. Представлены средние арифметические значения и стандартные ошибки измеряемых показателей. Измерения проводились в течение 2012–2014 гг. (n = 5–7 для каждого уровня PPFD в каждый год исследований).

Рис. 3.

Зависимость скорости транспорта электронов через ФСII от плотности потока фотонов у талломов Lobaria pulmonaria, отобранных в разные месяцы года: 1 – апрель, 2 – июнь, 3 – октябрь, 4 – январь. Маркерами представлены средние арифметические значения и стандартные ошибки ETR для талломов L. pulmonaria, отобранных в разные месяцы в течение 2012–2014 гг. (n = 5–7 для каждого уровня PPFD в каждый год исследований). Сплошные кривые отражают результаты моделирования зависимости ETR от PPFD с помощью экспоненциальной функции f (x) = a(1 – e^–bx) [11]. Значения независимых параметров a (Р ≤ 0.001) и b (Р ≤ 0.001) были статистически значимы для выбранной функции.

Показатель ETR зависит от реального квантового выхода и плотности светового потока. В диапазоне PPFD от 0 до 400 мкмоль/м² с скорость переноса электронов через ФСII увеличивалась линейно (N = 85, F(1.83) = 445, P < 0.001, R² = 0.84). Как следует из данных табл. 5, более высокие величины ETR_max (88–95 мкмоль/м² с), были зарегистрированы у талломов в теплое время года. В зимний период отмечено достоверное (t_st = 3.3, P ≤ 0.05) снижение значений ETR_max на 30%. Для талломов, собранных в апреле–июне, насыщение скорости транспорта электронов через ФСII происходило при PPFD 600–700 мкмоль квантов/м² с (рис. 3, табл. 5). Осенью и зимой световое насыщение фотохимических реакций ФСII достигалось при более низкой освещенности, величина PPFD_sat составляла менее 500 мкмоль квантов/м² с.

Определения СО₂-газообмена показали, что скорость выделения СО₂ в темноте составляла 1–2 мкмоль CO₂/м² с, причем отмечали тенденцию к увеличению дыхания талломов, отобранных в холодное время года (рис. 4, табл. 6). Переход талломов от выделения к нетто-поглощению СО₂ наблюдался при сравнительно высокой PPFD (20–70 мкмоль квантов/м² с). Скорость нетто-поглощения СО₂ талломов возрастала с повышением уровня освещенности. В области светового насыщения скорость Ф_н “летних” талломов была почти вдвое ниже, чем у талломов, отобранных весной, осенью и даже зимой.

Рис. 4.

Зависимость скорости нетто-поглощения СО₂ от плотности потока фотонов в талломах Lobaria pulmonaria, отобранных в разные месяцы года: 1 – апрель, 2 – июнь, 3 – октябрь, 4 – январь. Маркерами представлены средние арифметические значения и стандартные ошибки для талломов L. pulmonaria, отобранных в разные месяцы в течение 2012–2014 гг. (n = 5–7 для каждого уровня PPFD в каждый год исследований).

Активность и соотношение дыхательных путей в талломах лишайника. Талломы L. pulmonaria характеризовались довольно высокой дыхательной способностью во все сезоны года (табл. 7). Скорость поглощения О₂ при 20°С варьировала в пределах 700–900 нмоль/г сухой массы мин. Более высокие значения данного показателя были зарегистрированы весной и осенью, чем летом и зимой. Однако различия были статистически незначимы. Интенсивность общего поглощения О₂ была обусловлена митохондриальным дыханием, доля остаточного (не связанного с митохондриями) дыхания составляла не более 15%. Активность дыхательных путей и их вклад в общее дыхание изменялись в течение года. Доля цитохромного пути (ЦП) варьировала от 30 (октябрь) до 56% (июнь), а на дыхание по альтернативному пути (АП) приходилось от 29 (июнь) до 56% (октябрь). В среднем за год вклад ЦП и АП в общее поглощение О₂ составил 45 и 40%, соответственно. Величина соотношения активности цитохромного и альтернативного путей дыхания (V_cyt/V_alt) изменялась от 0.5 (октябрь) до 1.9 (июнь).

Интенсивность тепловыделения (Q), отражающая общую метаболическую активность, изменялась в пределах 1.7–4.4 мкВт/мг сухой массы, более высокие значения данного показателя регистрировали весной и осенью. Следует отметить сходство сезонных изменений величины Q и активности альтернативного дыхания.

ОБСУЖДЕНИЕ

Лишайники являются пойкилогидрическими организмами, неспособными удерживать воду. Наиболее благоприятными для роста L. pulmonaria считаются весенний и осенний периоды с умеренной температурой и высокой влажностью [13]. Летом талломы часто подсыхают и становятся физиологически неактивными. Проведенные нами ранее исследования показали, что при потере влаги площадь талломов лобарии уменьшалась, края их скручивались, а сложенный грибными гифами верхний коровый слой уплотнялся и плохо пропускал свет к водорослям [7]. Поэтому для получения сопоставимых данных, характеризующих сезонные изменения фотосинтетической и дыхательной активности, свежесобранные талломы L. pulmonaria предварительно гидратировали и акклимировали в стандартных условиях в течение 1.5–2 ч. Целесообразность такой подготовки талломов была отмечена и другими авторами [10].

Нами установлено, что фотобионт зимующих талломов лишайника способен достаточно быстро восстанавливать функциональную активность ФСА в лабораторных условиях (табл. 4). Одночасовой адаптации гидратированных талломов при 22°С было достаточно для достижения величины F_v/F_m, близкой к максимальной для хлоробионтных лишайников [10]. Величины Ф_PSII и NPQ талломов L. pulmonaria в зимний период были сопоставимы с типичными для лета значениями этих показателей уже после 4-часовой акклимации. При этом скорость нетто-поглощения СО₂ у акклимированных в течение 2–4 ч в лабораторных условиях талломов составила около 3 мкмоль/м² с.

Эти результаты свидетельствует о сохранности структуры ФСА фотобионта при перезимовке лишайника, что подтверждается также данными, полученными при измерении спектров низкотемпературной флуоресценции хлорофилла а (рис. 1). Их анализ показал, что длительное воздействие низкой отрицательной температуры не приводило к деградации пигмент-белковых комплексов ФСА фотобионта. У талломов, длительное время хранившихся при отрицательной температуре, отмечали небольшое изменение соотношения F₇₃₅/F₆₈₅ по сравнению с образцами, отобранными весной, а после 30-часовой акклимации этих талломов в условиях лаборатории разница практически нивелировалась. Подобные закономерности наблюдали у L. pulmonaria при десикации и в условиях осмотического стресса [14]. Вероятно, быстрое перераспределение потока энергии между ФСII и ФСI может способствовать сохранению целостности пигмент-белковых комплексов фотосистем в периоды с частыми изменениями условий влагообеспеченности или в условиях повторяющихся переходов температуры воздуха через 0°С, сопровождающихся изменением состояния воды в талломах.

В опытах с листоватым лишайником Umbilicaria aprina было показано наличие в талломах трех фракций воды: слабо, сильно и очень сильно связанной [15]. При постепенном охлаждении слоевищ до –20°С слабо связанная вода диффундировала из клеток на поверхность гиф и в межклетники медуллярного и альгального слоев [16]. В результате образующийся в межклетниках лед не повреждал таллом. При оттаивании таллома клетки водоросли и гриба поглощали талую воду из межклетников и вновь становились тургесцентными. Ранее с использованием метода биологической калориметрии нами было показано, что фазовый переход вода–лед в талломах L. pulmonaria зимой происходит при температуре –10 °С, при этом замерзает около 30% содержащейся в них воды [7].

Несмотря на устойчивость ФСА лишайника к действию неблагоприятных факторов среды в зимнее время, весной отмечали двукратное сокращение фонда хлорофиллов (табл. 2). Уменьшение содержания зеленых пигментов можно считать адаптивной реакцией, так как это снижает поглощение световой энергии в период, когда температуры ограничивают ее использование для ассимиляции СО₂, а избыточная инсоляция может привести к фотодеструкции ФСА. Некоторые авторы связывают изменение пигментного фонда лишайников в течение вегетационного периода с изменением количества клеток фотобионта [17]. Видимо, сезонная регуляция численности клеток фотобионта позволяет лишайникам адаптироваться к изменению условий освещения и обеспечивать поступление необходимого количества органического углерода к микобионту в течение вегетации.

Основным механизмом, предотвращающим фотодеструкцию ФСА, является зеаксантин-зависимое тушение избыточной энергии в ФСII зеленой водоросли. Светозависимая конверсия виолаксантина с образованием зеаксантина осуществляется ксантофилловым циклом [18], но, в отличие от высших растений, регуляторным белком здесь служит LHCSR [19], а не PSBS. У L. pulmonaria более высокие значения DEPS (24–34%) были зарегистрированы в зимне-весенний период (табл. 3). Летом уровень DEPS составлял около 15%. Повышение DEPS зимой согласуется с наблюдаемым в этот период увеличением параметра нефотохимического тушения, связанного с тепловой диссипацией энергии (рис. 2б) и тенденцией к снижению реального квантового выхода ФСII (рис. 2а). Ранее сходные сезонные изменения в активности фотопротекторных механизмов были показаны для талломов L. pulmonaria в условиях листопадных лесов [20] и эпилитного лишайника Xanthoria parietina при изучении механизмов адаптации ФСА к световым условиям среды [21].

Анализ динамики сезонных изменений зависимости ETR от PPFD указывает на сохранение высокой эффективности фотохимических процессов ФСII фотобионта в широком диапазоне освещенности в течение всего года. Более высокие значения ETR_max отмечены для талломов летом, а в весенний и осенний периоды величина ETR_max снижалась незначительно (табл. 5). Световое насыщение ETR наблюдалось при PPFD от 470 до 680 мкмоль/м² с, в несколько раз превышающей средний уровень освещенности в естественных условиях обитания лишайника. По всей видимости, сезонные изменения фотохимической активности ФСА не ограничивают интенсивность фотосинтеза, а реализация способности ассимилировать СО₂ определяется на уровне темновых стадий связывания углерода и зависит от условий среды и состояния самого лишайника.

Принято относить лишайники к фототрофным организмам с низкой фотосинтетической активностью. Судя по полученным нами данным, гидратированные талломы крупнолистоватого лишайника L. pulmonaria при насыщающей интенсивности света способны ассимилировать СО₂ со скоростью до 5 мкмоль/м² с (рис. 4, табл. 6). Снижение скорости Ф_н, увеличение СКП и уменьшение квантового выхода в июне, скорее всего, были обусловлены сильной потерей влаги талломами. Установлено, что в природных условиях летом при высокой температуре и низкой влажности воздуха талломы L. pulmonaria быстро теряли влагу, и в дневные часы у них наблюдалось выделение СО₂ [7]. Положительный газообмен регистрировали только рано утром, когда талломы частично гидратировались за счет поглощения атмосферной влаги. В результате большую часть суток углеродный баланс лишайника был отрицательным. Наши результаты подтверждают мнение ряда авторов [13, 17] о том, что наиболее благоприятными для лишайников лесной зоны являются переходные (весенний и осенний) периоды с умеренно теплой и влажной погодой, когда складывается положительный углеродный баланс и активируется рост талломов.

С другой стороны, CO₂-газообмен L. pulmonaria в летний период может зависеть от количества рибулезобифосфаткарбоксилазы/оксигеназы (Рубиско). По имеющимся в литературе данным [22], снижение освещенности в древостое с доминированием листопадных видов летом приводило к уменьшению содержания в талломах L. pulmonaria большой субъединицы Рубиско. Увеличение количества субъединиц Рубиско в осенне-зимний период авторы связывали с адаптацией лишайника к ожидаемому предстоящей весной повышению уровня освещенности в пологе. Это отчасти может объяснить наблюдаемую нами высокую потенциальную активность фотосинтеза талломов в зимний период. Важно отметить, что насыщение нетто-фотосинтеза L. pulmonaria световой энергией наблюдалось при PPFD не менее 500 мкмоль квантов/м² с (рис. 4), тогда как большую часть времени освещенность в природных условиях была существенно (в 2–5 раз) ниже (табл. 1).

В листьях растений темновое дыхание не превышает 15–20% видимого фотосинтеза. Превалирование гетеротрофного микобионта в биомассе лишайника сказывается на соотношении поглощения и выделения CO₂ в талломах (табл. 6). По данным литературы [23], в природных условиях дыхание лишайников повышается в летне-осенний период и сильнее реагирует на изменение температуры, чем зимой. Мы не выявили значимых сезонных изменений дыхательной способности гидратированных талломов L. pulmonaria, измеренной при температуре 20°С по скорости темнового выделения CO₂ и поглощения O₂ (табл. 6, 7). При этом весной и осенью наблюдали активацию дыхания через цианидустойчивую альтернативную оксидазу (AOX), что приводило к изменению соотношения дыхательных путей. Известно, что АОХ присутствует в митохондриальной ЭТЦ клеток растений, водорослей, грибов, а транспорт электронов через АОХ при дыхании клеток не сопряжен с образованием энергии и приводит к ее тепловой диссипации [24]. До последнего времени сведения о функционировании дыхательных путей у лишайников практически отсутствовали. У L. pulmonaria способность к дыханию по основному энергетически эффективному цитохромному пути (ЦП) значимо не изменялась в течение сезона. Индукция альтернативного пути (АП) дыхания у растений рассматривается как один из основных физиологических маркеров стресса [25]. Ранее нами было отмечено повышение активности АП в талломах лишайников при действии УФ-B облучения и кратковременном действии высокой температуры [26, 27]. Возможно, что активация АП дыхания в талломах лишайника весной и осенью направлена на предотвращение перевосстановления пула убихинона и, следовательно, избыточного образования АФК. Роль АП дыхания как компонента антиоксидантной системы показана для высших растений и нелихенизированных грибов [28, 29]. С другой стороны, весна и осень – наиболее благоприятное время для роста лишайников. Высокая скорость транспорта электронов по АП могла способствовать интенсивному обороту цикла ди- и трикарбоновых кислот и поддержанию стабильной активности энергетически эффективного ЦП дыхания без перевосстановления митохондриальной ЭТЦ. В этом случае АП может служить индикатором повышения уровня метаболизма лишайников.

О повышении активности метаболизма в талломах L. pulmonaria весной и осенью свидетельствует также усиление метаболического тепловыделения (табл. 7). Причем увеличение Q совпадало с активацией АП. По мнению авторов работы [30], причиной наблюдаемого существенного повышения скорости тепловыделения в талломах Peltigera polydactylon после регидратации было увеличение интенсивности дыхания по АП. Однако прямых определений дыхания лишайника в данной работе не проводили.

Итак, многолетние исследования функциональных показателей крупнолистоватого лишайника L. pulmonaria выявили, что в оптимальных свето-температурных условиях гидратированные талломы способны ассимилировать СО₂ со скоростью 3–5 мкмоль/м² с в течение всего годичного цикла. Во время перезимовки фотобионт лишайника проявляет фотохимическую активность и способность ассимилировать СО₂ сразу же после перенесения из природы в лабораторные условия, что свидетельствует о поддержании структурно-функциональной целостности ФСА. В сохранении метаболической активности участвует комплекс адаптивных физиологических механизмов. На уровне фотобионта происходят сезонные изменения содержания и соотношения пигментов, наблюдаются сезонные модуляции уровня конверсии пигментов ВКЦ, активности фотохимических процессов и энергодиссипации в ФСII. Микобионт доминирует в биомассе и дыхании лишайника, регулирует метаболизм вовлечением энергетически мало эффективного АП дыхания и поддержанием конститутивного уровня активности основного цитохромного дыхательного пути в течение годичного цикла. Адаптивные механизмы активизируются в наиболее благоприятные для роста весенний и осенний периоды.

Работа выполнена в рамках темы госбюджетных НИОКТР “Физиология и стресс-устойчивость фотосинтеза растений и пойкилогидрических фотоавтотрофов в условиях Севера” (№ AAAA-A17-117033010038-7).

Авторы выражают благодарность к.б.н. М.С. Христину (Институт фундаментальных проблем биологии РАН, Пущино) за помощь при измерении спектров низкотемпературной флуоресценции талломов L. pulmonaria.

Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов. Настоящая статья не содержит каких-либо исследований с участием людей и животных в качестве объектов исследований.