Физиология растений, 2022, T. 69, № 3, стр. 317-326

ВВЕДЕНИЕ

Фуростаноловые гликозиды (ФГ) являются высокоактивными соединениями, способными усиливать адаптивные реакции растительных клеток при воздействии абиотических стрессовых факторов. В предыдущих работах нами было показано, что предварительная обработка клеток in vitro ФГ, выделенными из культуры клеток Dioscorea deltoidea Wall., приводила к изменению ряда их физиолого-биохимических характеристик, имеющих адаптогенную направленность в условиях абиотического стресса [1–5]. В частности, экзогенное действие ФГ способствовало образованию АФК, генератором которых являлась НАДФ·Н-оксидаза плазмалеммы, и индукции ферментов антиоксидантной защиты. Активация НАДФ·Н-оксидазы приводила к изменению соотношения НАДФ⁺/НАДФ·Н, что может выполнять роль редокс-сигнала, который регулирует активность ключевых ферментов пентозофосфатного пути и ферментов метаболизма глутатиона.

Механизмы, лежащие в основе защиты клеток при действии разных видов стрессоров, могут иметь специфичные особенности. Известно, что при действии гипотермии основными негативными последствиями являются снижение текучести мембран и окислительный стресс, связанный в первую очередь с нарушением транспорта электронов в электрон-транспортных цепях. Воздействие низкой температуры может приводить к быстрому повышению содержания Са²⁺ в цитозоле, связанном с активацией НАДФ·Н-оксидазы [6]. В результате происходит формирование внутриклеточных АФК, при этом их продукция и активация антиоксидантных ферментов является результатом быстрых сигнальных реакций [7]. Активация антиоксидантной системы, наряду с повышением ненасыщенности ЖК в составе липидов мембран играет ключевую роль в формировании устойчивости к гипотермии [8]. В защиту от токсичного действия АФК вовлечены такие ключевые ферменты, как аскорбатпероксидазы (АПО) и супероксиддисмутазы (СОД), а также глутатионпероксидазы (ГПО) и фенол-зависимые пероксидазы. Поскольку пероксидаза (ПО) имеет различные функции (оксидазную и пероксидазную), она может выступать как фактор, участвующий в элиминировании Н₂О₂, а в других ситуациях – как источник кислородных радикалов. Учитывая такую двойственность, пероксидазная ферментная система представляется одним из наиболее вероятных участников клеточного сигналинга. Уровень активности фенол-зависимой ПО в клетках растений часто используют для характеристики их функционального состояния в ответ на действие экстремальных факторов среды [9]. Эффективность антиоксидантных ферментов, которые защищают разные компартменты клетки в условиях абиотического стресса, может зависеть не только от их индуцированной, но и конститутивной активности.

При другом виде стресса – гиперосмотическом, при котором существенную роль играют механические свойства мембран [10], компенсаторные изменения, противостоящие повреждающим эффектам, включают в себя осмопротекторные механизмы, связанные с повышением уровня осмолитов, предупреждающих пороговое обезвоживание. Кроме того, регуляция активности антиоксидантных ферментов, замедляющих интенсивность липопероксидации, а также активация альдегидутилизирующих ферментов, защитное действие которых проявляется как за счет метаболизма токсичных альдегидов, так и в результате образования осмолитов [5], способствуют сопротивлению клеток гиперосмотическому стрессу.

Для выяснения механизмов адаптогенного действия ФГ на растительные клетки in vitro эффективным подходом является использование объектов со специфичными свойствами. Суспензионная культура клеток люцерны (Medicago sativa L.), восстановленная после 27 лет криогенного хранения в жидком азоте, обладает рядом функциональных особенностей – в частности, активность гваякол-ПО в ней на несколько порядков выше, чем в других исследуемых растительных объектах in vitro [4]. После длительного криогенного хранения популяция клеток люцерны возобновила рост, несмотря на низкий уровень выживаемости, что свидетельствует о высоком адаптивном потенциале клеток возобновленной культуры. Основным повреждающим фактором в результате процедуры замораживания-оттаивания является гиперосмотический стресс, к которому клетки люцерны были довольно чувствительны (погибало около 80% преимущественно полиплоидных клеток) [11]. Наряду с действием гиперосмотического стресса в процессе замораживания-оттаивания клетки подвергались также действию низкой положительной температуры.

В связи с этим цель настоящей работы заключалась в изучении механизмов, лежащих в основе защитного действия ФГ на клетки возобновленной после криогенного хранения суспензионной культуры Medicago sativa, при действии гипотермии и гиперосмотического стресса.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Исследования проведены на восстановленной после 27 лет хранения в жидком азоте суспензионной культуре клеток люцерны (Medicago sativa L.) в условиях выращивания, описанных в работе Волковой с соавт. [11]. Для определения оптимальной интенсивности стрессовых факторов была также использована хорошо охарактеризованная нами ранее суспензионная культура клеток Dioscorea deltoidea Wall, штамм ИФР ДМ-0.5 [3].

Для изучения влияния ФГ на клетки люцерны использовали препарат фуростаноловых гликозидов, выделенный из водного экстракта лиофильно высушенной культуры клеток Dioscorea deltoidea Wall, штамм ИФР ДМ-0.5 [3]. Препарат представляет собой смесь двух гликозидов – дельтозида и протодиосцина, в соотношении 2 : 3 с чистотой 85%. Для изучения действия ФГ клетки отбирали в течение цикла роста в определенные сутки культивирования (на 2, 7, 14 сут; либо на 7 и 14 сут), которые соответствовали разным фазам ростового цикла (2 сут – лаг фаза, 7 сут – фаза экспоненциального роста, 14 сут – фаза замедления роста) и проводили 60-минутную экспозицию с ФГ в концентрации 10^–5 М. Контролем служили клетки без воздействия. Подробная методика изложена ранее [5].

Жизнеспособность суспензионных культур определяли с помощью окрашивания клеток 0.1% раствором феносафранина, как описано в работах [3]. При микроскопировании (световой микроскоп PZO, Польша) учитывали процент неокрашенных (живых) клеток не менее чем в 200 клеточных агрегатах.

Условия гиперосмотического стресса создавали, воздействуя на клетки через каждые 5 мин раствором маннита с постепенно повышающейся концентрацией (0.3; 0.6; 0.8 и 1.1 М). При концентрации 1.1 М клетки выдерживали в течение 1 ч. Затем клетки в течение 20 мин ступенчато деплазмолизировали, после чего определяли их жизнеспособность (выживаемость).

Гипотермическое воздействие состояло в том, что колбы с культурами клеток люцерны и диоскореи помещали в холодильную камеру на 60 мин при периодическом помешивании. При этом экспозицию клеток люцерны осуществляли при 4°С, а диоскореи – при 7°С.

Определение активности редокс-ферментов. После гомогенизации осажденных клеток суспензии (150−200 мг) в 0.1 М Трис-HCI буфере (рН 7.5) и последующего центрифугирования гомогената при 10 000 g в течение 10 мин (центрифуга Eppendorf 5414) в супернатантах определяли активность ферментов.

Активность гваякол-зависимой формы пероксидазы (КФ 1.11.1.7) определяли по изменению оптической плотности реакционной смеси в 0.1 М калий-фосфатном буфере (рН 5.5) при 470 нм [12]. Снижение активности гваякол-зависимой ПО, вызванное присутствием в реакционной среде второго субстрата – НАД·Н, определяли по методу, описанному в работе [4]. Определение пероксидазной активности производили, как описано выше [12]. Для сравнения разных вариантов величину снижения активности гваякол-зависимой ПО (А, %) вычисляли по формуле: А (%) = = 100 × (1 – А1/А2), где А1 – активность фермента (ммоль/(мг белка мин)) после внесения НАД·Н, А2 – исходная активность фермента, без НАД·Н.

Общую активность супероксиддисмутазы (СОД, КФ 1.15.1.11) определяли с использованием нитросинего тетразолия, конкурирующего с СОД за супероксид-анионы, образующиеся в результате взаимодействия метионина и рибофлавина при освещении в течение 30 мин, по методу Beauchamp и Fridovich [13]. Оптическую плотность реакционной смеси измеряли при 560 нм. Полученные данные по активности фермента выражали в относительных единицах на мг белка. За единицу активности СОД принимали 50% ингибирование образования формазана, образуемого при восстановлении нитросинего тетразолия.

Активность глутатионпероксидазы (ГПО, КФ 1.11.1.9) определяли по скорости уменьшения оптической плотности реакционной смеси при 340 нм в результате окисления НАДФ·Н с помощью двух сопряженных ферментативных реакций: генерации окисленного глутатиона (GSSG) под действием глутатионредуктазы и его последующего восстановления ГПО с использованием НАДФ·Н в качестве кофермента [14]. Снятие показаний осуществляли ежеминутно в течение 5 мин. Реакционная среда имела следующий состав: 50 мМ Трис-НСl буфер (рН 7.4), содержавший 1 мМ ЭДТА, 0.12 мМ НАДФ·Н, 0.85 мМ восстановленного глутатиона (GSН), 0.37 мМ Н₂О₂, 1 ед/мл глутатионредуктазы. В контрольной пробе отсутствовал GSН. Активность ГПО рассчитывали c учетом коэффициента экстинкции (ε = 6.22 мМ^–1 см^–1) и выражали в мкмоль/(мг белка мин).

Активность аскорбатпероксидазы (АПО, КФ 1.11.1.11) определяли по уменьшению оптической плотности при 298 нм в результате окисления аскорбиновой кислоты перекисью водорода (ε = 0.80 М^–1 см^–1) [15]. Для каждого определения проводили также контрольное измерение неспецифического окисления аскорбата. Активность АПО выражали в ммоль окисленного аскорбата/(мг белка мин).

Активность НАД-малатдегидрогеназы (НАД-МДГ, КФ 1.1.1.37) определяли по скорости восстановления НАД в среде следующего состава: 80 мМ Трис-НС1 буфер (рН 8.0), 2 мМ малат, 5 мМ MgSO₄, 0.2 мМ НАД. Активность НАД-МДГ рассчитывали, используя среднюю скорость светопоглощения при 340 нм за первые 3 мин после начала реакции.

Активность НАД·Н-малатдегидрогеназы (НАД·Н-МДГ, КФ 1.1.1.37) определяли по скорости расходования НАД·Н в среде следующего состава: 80 мМ Трис-НС1 буфер (рН 8.0), 2 мМ оксалоацетат, 5 мМ MgSO₄, 0.2 мМ НАД·Н. Активность НАД·Н-МДГ рассчитывали, используя среднюю скорость светопоглощения при 340 нм за первые 3 мин после начала реакции.

Скорость генерации супероксид-аниона (${\text{O}}_{2}^{{\centerdot - }}$) регистрировали по методу, основанному на способности ${\text{O}}_{2}^{{\centerdot - }}$ восстанавливать нитросиний тетразолий до нерастворимого формазана [16]. Количественное определение формазана проводили по методу, описанному нами ранее [3]. Контрольные и обработанные ФГ клетки инкубировали 60 мин в 0.3% растворе нитросинего тетразолия в фосфатном буфере (рН 7.0), при этом восстановление нитросинего тетразолия в клетках было спонтанным, без использования источника ${\text{O}}_{2}^{{\centerdot - }}$. После центрифугирования при 10 000 g в течение 10 мин клетки дважды экстрагировали 96% этанолом для извлечения формазана. В объединенном экстракте определяли количество формазана при длине волны 510 нм (ε = 3.0 мМ^–1 см^–1) и выражали в мкмоль/мг белка.

Содержание вторичных продуктов перекисного окисления липидов (ПОЛ) оценивали по ТБК-тесту [17], основанному на взаимодействии этих продуктов (преимущественно МДА) с тиобарбитуровой кислотой и образовании окрашенных комплексов, при наличии высокой температуры и кислой среды. Содержание ТБК-АП рассчитывали с использованием коэффициента экстинкции МДА, равного 155 мМ^–1 см^–1 и выражали в нмоль/мг белка.

Определение общего количества белка проводили по методу Lowry с соавт. [18].

Статистическую обработку данных проводили по общепринятым методикам с использованием программы Microsoft Excel 2007. Все эксперименты проводили в трехкратной повторности. Бары на диаграммах означают стандартную ошибку. Достоверность различий оценивали по критерию Стьюдента при уровне значимости P ≤ 0.05.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Жизнеспособность клеток люцерны при действии ФГ в условиях гипотермии и гиперосмотического стресса

Для определения оптимальной интенсивности стрессовых факторов была использована хорошо охарактеризованная суспензионная культура клеток D. deltoidea Wall. Гиперосмотический стресс (выдерживание клеток в 1.1 М растворе маннита в течение 1 ч, см. Материалы и методы) и гипотермический стресс (1 ч при 4°С) вызывали практически одинаковое снижение жизнеспособности клеток – с 90% в контроле до 41% при гиперосмотическом стрессе и до 46% при гипотермии (рис. 1а), что может свидетельствовать об оптимальном уровне выбранных режимов воздействий и их “эквивалентности” для клеток диоскореи in vitro.

Рис. 1.

Жизнеспособность клеток диоскореи (а) и люцерны (б) в условиях гипотермии и гиперосмотического стресса: 1 – контроль; 2 – стресс; 3 – ФГ. Звездочками (*) обозначены статистически достоверные различия относительно контроля при Р ≤ 0.05.

В отличие от клеток диоскореи, воздействие на суспензионные культуры клеток люцерны абиотических стрессоров разной природы привело к различному эффекту (рис. 1б). Гипотермия практически не оказала влияние на жизнеспособность клеток люцерны in vitro, тогда как гиперосмотический стресс вызвал более существенное по сравнению с клетками диоскореи (почти 4-кратное) снижение жизнеспособности – с 93% (контроль) до 25%.

В условиях гиперосмотического стресса предобработка клеток люцерны ФГ повышала выживаемость с 25% (в варианте без ФГ) до 73%. В условиях действия низкой температуры жизнеспособность клеток люцерны in vitro во всех вариантах (контроль, гипотермия, гипотермия + ФГ) практически не изменялась и находилась на уровне 85 ± 3%.

Скорость генерации супероксид-аниона при действии ФГ в условиях гипотермии

Гипотермия и обработка клеток люцерны ФГ на 7 или 14 сут культивирования стимулировали образование ${\text{O}}_{2}^{{\centerdot - }}$ (рис. 2). Превышение контроля при действии только гипотермии составило 39% на 7 сут выращивания и 36% – на 14 сут, а воздействие ФГ в контрольных условиях (при нормальной температуре) – 20 и 24%, соответственно. Воздействие на клетки ФГ в условиях холодового стресса также приводило к повышению уровня образования в них ${\text{O}}_{2}^{{\centerdot - }}$, но в меньшей степени, чем воздействие только стрессового фактора. По сравнению с контролем степень превышения скорости образования ${\text{O}}_{2}^{{\centerdot - }}$ при воздействии ФГ на 7 сут составляла 17%, на 14 сут – 19%, что в среднем на 20% ниже уровня его генерации при действии только гипотермии.

Рис. 2.

Скорость генерации супероксид-аниона при экспозиции фуростаноловых гликозидов (ФГ) с клетками люцерны в условиях гипотермии: 1 – контроль; 2 – гипотермия; 3 – ФГ + гипотермия; 4 – ФГ. Звездочками (*) обозначены статистически достоверные различия относительно контроля при Р ≤ 0.05.

Пероксидазно-оксидазная активность пероксидазы (ПО) при действии ФГ в условиях гипотермии

Активность ПО в клетках люцерны измеряли как в окислительном цикле (с использованием НАД·Н в качестве субстрата), так и пероксидазном (с использованием фенолов в качестве субстрата). Присутствие в реакционной среде наряду с гваяколом сильного восстановителя НАДФ·Н приводило к снижению пероксидазной активности в контрольном варианте (в результате переключения на оксидазную активность) на 7 сут цикла выращивания на 37%, а на 14 сут – на 29% (рис. 3). При действии гипотермии пероксидазная активность увеличивалась на 24 и 29% (на 7 и 14 сут, соответственно), а оксидазная активность ПО либо не изменялась (7 сут), либо незначительно (недостоверно) снижалась (14 сут). Предкультивирование клеток люцерны с ФГ способствовало увеличению пероксидазной активности (на 7 сут на 17%, на 14 сут – на 19%), однако в условиях гипотермии эффект ФГ не наблюдался.

Рис. 3.

Пероксидазно-оксидазная активность пероксидазы в клетках люцерны при действии фуростаноловых гликозидов (ФГ) в условиях гипотермии: 1 – контроль; 2 – НАД‧Н; 3 – гипотермия; 4 – НАД‧Н + + гипотермия; 5 – ФГ; 6 – ФГ + гипотермия. Звездочками (*) обозначены статистически достоверные различия относительно контроля при Р ≤ 0.05.

Активность антиоксидантных ферментов при действии ФГ

Исследование функционирования антиоксидантных ферментов в клетках люцерны показало высокий уровень их конститутивной активности, имеющий циклический характер. При этом в начале цикла выращивания (2 сут) их активность была максимальной, в период интенсивного роста клеток (7 сут) она снижалась, но к завершению цикла (14 сут) опять возрастала. Активность СОД на 2 сут культивирования составляла 7.0, на 7 сут – 0.9 и на 14 сут – 2.9 отн. ед/мг белка. Активность аскорбат ПО – соответственно 2.0, 0.65 и 1.9 ммоль окисленного аскорбата/мг белка в мин; активность глютатион ПО – 800, 280 и 470 мкмоль GSSG/мг белка в мин. Зафиксированное повышение активности антиоксидантных ферментов в лаг-фазе цикла (2 сут) выращивания культур клеток фиксируется достаточно часто и может быть обусловлено активацией митохондриального дыхания после пересадки клеток на свежую питательную среду.

Изучение динамики активности антиоксидантных ферментов при воздействии ФГ показало (рис. 4), что предварительная инкубация клеток люцерны с ФГ приводила к повышению активности СОД на 21–36% по сравнению с контролем в зависимости от фазы ростового цикла культуры, что свидетельствует об увеличении образования ${\text{O}}_{2}^{{\centerdot - }}$. Аналогичное повышение активности было зафиксировано и для АПО: на 21–43% от уровня активности в контроле, тогда как изменений активности ГПО при действии ФГ в цикле выращивания клеток обнаружено не было – ее активность оставалась на уровне конститутивных значений контрольного варианта.

Рис. 4.

Активность антиоксидантных ферментов в клетках люцерны при действии фуростаноловых гликозидов: 1 – СОД; 2 – АПО; 3 – ГПО. Звездочками (*) обозначены статистически достоверные различия относительно контроля при Р ≤ 0.05.

Уровень перекисного окисления липидов (ПОЛ) при действии ФГ

Динамика интенсивности ПОЛ в цикле выращивания клеток люцерны оказалась схожей с динамикой активности антиоксидантных ферментов – более высокие значения были отмечены в начале и конце цикла культивирования (рис. 5). Воздействие ФГ на клетки приводило к уменьшению количества в них ТБК-АП на 19–22% по сравнению с контрольным вариантом независимо от фазы ростового цикла, в котором происходила обработка ФГ.

Рис. 5.

Количество ТБК-АП в клетках люцерны при действии фуростаноловых гликозидов (ФГ): 1 – контроль; 2 – ФГ. Звездочками (*) обозначены статистически достоверные различия относительно контроля при Р ≤ 0.05.

Активность ферментов малатдегидрогеназного комплекса

Анализ динамики активности НАД·Н-МДГ (рис. 6а), катализирующей восстановление оксалоацетата в малат, показал, что действие ФГ способствовало увеличению ее активности по сравнению с контролем на 18–30% в зависимости от фазы ростового цикла. В отличие от НАД·Н-МДГ, обработка клеток люцерны ФГ приводила к существенному (на 23%) повышению активности НАД-МДГ, катализирующей окисление малата в оксалоацетат лишь в начале выращивания (на 2 сут) (рис. 6б). Влияние ФГ на активность этого фермента в остальные фазы ростового цикла либо отсутствовало (обработка на 7 сут), либо было незначительным (обработка на 14 сут).

Рис. 6.

Активность ферментов малатдегидрогеназного (МДГ) комплекса (а – НАД‧Н-МДГ, б – НАД-МДГ) в клетках люцерны при действии фуростаноловых гликозидов (ФГ): 1 – контроль; 2 – ФГ. Звездочками (*) обозначены статистически достоверные различия относительно контроля при Р ≤ 0.05.

Уровень пероксидазной активности при действии ФГ в условиях гиперосмотического стресса

Обработка ФГ клеток люцерны в нормальных условиях культивирования приводила к достоверному (на 20–25%) повышению уровня пероксидазной активности по сравнению с контролем (рис. 7). Условия гиперосмотического стресса вызывали существенное (в зависимости от фазы ростового цикла – в 3–4 раза по сравнению с контролем) снижение уровня этой активности. Воздействие ФГ в условиях гиперосмотического стресса приводило к “нормализации” пероксидазной активности в клетках: она оказывалась в 1.7–1.8 раза ниже по сравнению с контрольным уровнем, но в 1.8–2.4 раза выше, чем в стрессовых условиях без воздействия ФГ.

Рис. 7.

Активность пероксидазы (ПО) в клетках люцерны при действии фуростаноловых гликозидов (ФГ) в условиях гиперосмотического стресса: 1 – контроль; 2 – ФГ; 3 – стресс; 4 – ФГ + стресс. Звездочками (*) обозначены статистически достоверные различия относительно контроля при Р ≤ 0.05.

ОБСУЖДЕНИЕ

Чтобы противостоять гипотермии и гиперосмотическому воздействию в растительных клетках имеются механизмы, позволяющие посредством сложного пути передачи сигнала включать соответствующие адаптивные физиологические реакции. Известно, что холодовой стресс характеризуется активацией окислительных процессов в клетке [19]. Ограничение процессов ПОЛ и поддержание структурно-функционального состояния мембранных липидов осуществляется за счет работы антиоксидантной системы защиты, ключевую роль в которой играют специализированные ферменты [19], среди которых ПО одной из первых реагирует на любые внешние воздействия [20]. В нашем исследовании, в отличие от культивируемых клеток диоскореи (рис. 1а), холодовое воздействие (4°С, 60 мин) не влияло на жизнеспособность клеток люцерны (рис. 1б), оставаясь на уровне контроля (86%), но наблюдались изменения на биохимическом уровне. Так, определение активности ПО при действии гипотермии показало ее увеличение в цикле роста на 24–29%, при этом, не было зарегистрировано достоверного влияния на уровень оксидазной (прооксидантной) активности (рис. 3). Увеличение активности ПО при совместном действии гипотермии и ФГ может быть связано с повышением уровня Н₂О₂ вследствие усиления образования ${\text{O}}_{2}^{{\centerdot - }}$ (рис. 2) и активности СОД (рис. 4), которая дисмутирует ${\text{O}}_{2}^{{\centerdot - }}$ в Н₂О₂ и молекулярный кислород. Известно, что СОД (в частности, Cu/Zn-СОД) может быть основным источником Н₂О₂ в апопластном компартменте [21]. Стоит заметить, что при гипотермии уровень ${\text{O}}_{2}^{{\centerdot - }}$ в контрольном варианте был выше на 12−19%, по сравнению с действием ФГ в обычных условиях, что свидетельствует о нестрессовом характере проявления эффекта ФГ (рис. 2). Высокий уровень жизнеспособности клеток люцерны при действии гипотермии (рис. 1б) свидетельствует о том, что образовавшиеся АФК не вызывали повреждений липидных структур и макромолекул (ДНК, РНК, белки) в клетках, поэтому не приводили к развитию окислительного стресса, следствием которого могло быть образование существенных повреждений, нарушающих барьерные свойства мембран. Наряду с СОД предкультивирование клеток люцерны с ФГ вызывало также увеличение активности АПО (рис. 4), являющейся составной частью аскорбат-глутатионового цикла, механизм которого заключается в восстановлении H₂O₂ до воды с участием аскорбата и АПО. Участвуя в аскорбат-глутатионовом цикле, АПО снижает содержание H₂O₂, поддерживает окислительно-восстановительный баланс клетки, а также уровень глутатиона и аскорбиновой кислоты [22]. В отношении ГПО заметного изменения активности фермента при действии ФГ (рис. 4) не выявлено, что может быть связано с более низкой чувствительностью ГПО к увеличению концентрации Н₂О₂. Следует обратить внимание на высокие конститутивные значения активностей исследуемых ферментов, особенно ПО – более 15 ммоль/(мг белка мин) на 14 сут культивирования (рис. 3), которая выявляется как доминирующий фермент в цикле роста. Пероксидазная (антиоксидантная) активность ПО, наряду с другими антиоксидантными ферментами, контролирует уровень АФК, тем самым осуществляя редокс-регуляцию в растительной клетке.

При действии низких температур выявляется множество зависимых эффектов, среди которых значительно выделяются видовые особенности, соответствующие генотипу растений. Например, культура клеток диоскореи, полученная из корневища D. deltoidea Wall., была чувствительна к гипотермии уже при 7°С (рис. 1б), их жизнеспособность снижалась на 50%. Виды рода Dioscorea L. произрастают преимущественно в тропиках, реже в субтропиках и в умеренном климате и являются теплолюбивыми растениями, в отличие от люцерны, которая относится к холодостойким видам. В связи с этим устойчивость к гипотермии культуры клеток люцерны может быть генетически детерминирована и связана, в том числе, с высокой конститутивной активностью антиоксидантных ферментов, по уровню активности которых можно судить о компенсаторном потенциале клеток [23]. На этом фоне, несмотря на повышение исходного уровня активности антиоксидантных ферментов при действии ФГ, эффект последних в условиях гипотермии не наблюдался (рис. 4).

Исследуемые антиоксидантные ферменты различались чувствительностью к концентрации Н₂О₂. Известно, что АПО обладает высоким сродством к Н₂О₂ и нейтрализует ее даже в очень низких концентрациях [24], тогда как ГПО не обладает высоким сродством к Н₂О₂ [25], а гваяколпероксидаза, вероятно, занимает промежуточное положение. Опосредованная способность ФГ повышать активность антиоксидантных ферментов, обладающих высоким сродством к Н₂О₂ (в частности АПО), может свидетельствовать об участии ФГ в сигнальных механизмах АФК-индуцируемых защитных реакций в качестве фактора, обеспечивающего необходимый уровень АФК [5, 26].

Изменение проницаемости плазмалеммы тесно связано с состоянием барьера ионной проницаемости, что является важнейшим показателем, от которого зависит нормальное функционирование клетки. Полярные липиды являются структурными компонентами клеточных мембран, участвующими в формировании барьера ионной проницаемости клеток, который может нарушаться при активации ПОЛ [27]. В результате формируются сквозные полярные каналы, вследствие чего увеличивается пассивная проницаемость мембран для ионов и снижается их электрическая стабильность. Уровень ПОЛ является одним из важных повреждающих факторов, вызывающих пробой в липидной части мембраны, приводящий к ее разрыву и, в конечном итоге, к гибели клетки [28]. Нами показано, что воздействие ФГ приводило к уменьшению количества ТБК-АП в течение цикла роста на 19–22% (рис. 5), что в условиях гиперосмотического стресса отразилось на жизнеспособности клеток люцерны, которая возросла с 25% (в контроле) до 73%.

При гиперосмотическом воздействии протопласт теряет воду, уменьшается в размерах и отделяется от клеточной стенки. Сохранению водного гомеостаза при стрессе могут способствовать органические кислоты, образуемые в реакциях ферментов МДГ комплекса. Органические кислоты имеют свойства осмолитов, благодаря чему увеличивают количество связанной воды, тем самым предотвращают критическое обезвоживание клетки. Образуемые в реакциях НАД/НАД·Н-МДГ малат и оксалоацетат могут запасаться в вакуолях, выполняющих важную буферную роль [29]. Кроме того, эти молекулы участвуют в реакциях переаминирования с образованием аспарагина и аланина. Аминокислоты, образуемые в результате этих реакций, также играют значительную роль в осморегуляции клеток. Анализ динамики активности оксидоредуктазных НАД·Н-МДГ (рис. 6а) и НАД-МДГ (рис. 6б) показал, что ФГ способствовали увеличению активности ферментов МДГ комплекса. Ранее в клетках люцерны нами было показано усиление активности альдегидутилизирующих ферментов при действии ФГ [5]. Продуктами реакций этих ферментов являются карбоновые кислоты, которые могут выступать в качестве осмолитов.

На увеличение образования осмолитов при воздействии ФГ может указывать разная концентрация маннита, вызывающая начальную степень плазмолиза. Следует заметить, что клетки диоскореи по сравнению с люцерной были более устойчивые к действию осмотика − только у 50% клеток был отмечен начальный плазмолиз при концентрации маннита 0.3 М [30].

При действии гиперосмотического стресса происходит повреждение белков мембран клетки как в липидной фазе, так и проявляющих свою активность в водных растворах [27]. Уровень ПОЛ влияет на степень нарушения липидного бислоя мембран, ослабляя липид-белковые взаимодействия интегральных белков. Последние выходят из мембраны во внеклеточное пространство, тем самым усиливая неселективную проницаемость мембран [29, 31]. При гиперосмотическом стрессе уменьшается растворимость гидрофильных белков, изменяются форма и размеры их молекул, теряется ферментативная активность. Изменения происходят вследствие разрыва водородных и ионных связей, стабилизирующих пространственные структуры [32]. На примере ПО нами показано, что в результате действия гиперосмотического стресса активность фермента была ингибирована почти на 80% (рис. 7). Предварительная экспозиция клеток с ФГ способствовала бóльшему сохранению (на 30%) функциональной активности ПО по сравнению с вариантом без ФГ. Видимо, это связано с повышением активности ферментов МДГ комплекса, продукты которых имеют свойства осмолитов, а также вследствие снижения уровня ПОЛ. Таким образом, наблюдаемый эффект ФГ в условиях гиперосмотического стресса свидетельствует о запуске цитопротекторных механизмов и связанных с ними регуляторных путей, показанных нами ранее [5, 26].

Работа выполнена при поддержке гранта Российского научного фонда № 19-14-00387.

Настоящая статья не содержит каких-либо исследований с участием людей и животных в качестве объектов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.