Физиология растений, 2022, T. 69, № 6, стр. 589-596

ВЛИЯНИЕ СВЕТА НА ДЫХАТЕЛЬНЫЙ МЕТАБОЛИЗМ РАСТЕНИЙ

Влияние света на скорость дыхательного метаболизма растений является установленным фактом, что показано для некоторых ферментативных систем, таких как сукцинатдегидрогеназа (СДГ), комплекс I митохондриальной электрон-транспортной цепи (ЭТЦ), НАД-фосфоглицеральдегид дегидрогеназа [1–4]. Важное значение в контроле окислительного метаболизма клетки играют ферментные системы, в частности, локализованные в митохондриях. Показано, что светозависимость характерна для аконитатгидратазы (АГ), фумаратгидратазы (ФГ), цитратсинтазы (ЦС), малатдегидрогеназы (МДГ) [4–7]. Данные энзимы негативно регулируются светом, что проявляется в снижении их активности более чем в 2 раза по сравнению с условиями темноты. Снижение активности СДГ, МДГ, АГ, ФГ, ЦС на свету вызывает изменение скорости функционирования ЦТК как основного поставщика энергетических эквивалентов в клетки при дыхательном метаболизме. Это находит отражение и в изменении работы ЭТЦ митохондрий, поскольку свет тормозит работу комплекса I [1]. Однако в растительной клетке существуют системы, обеспечивающие несопряженное с запасанием энергии свободное окисление субстратов, такие как альтернативная цианидрезистентная оксидаза и ротенон-резистентные НАД(Ф)·Н-дегидрогеназы, позволяющее митохондриям эффективно регулировать энергетический статус клетки в условиях интенсивного фотосинтеза [8, 9].

В условиях функционирования фотосинтеза цикл Кребса не является основным источником энергии, а обеспечивает поставку углеродных скелетов и выступает в качестве регулятора окислительно-восстановительного гомеостаза клетки. Для ряда энзимов ЦТК характерно наличие генетически детерминированных изоферментов, имеющих внемитохондриальную локализацию в клетке растений. Регуляция их активности носит светозависимый характер [3, 7]. Увеличение каталитической активности цитоплазматических изоферментов ЦС и АГ на свету, вероятно, необходимо для активации работы фотосинтетического метаболизма, что обусловлено необходимостью увеличения скорости работы цикла Кальвина [3] за счет мобилизации пула запасных органических кислот клетки (в первую очередь цитрата, так как малат может мобилизовываться при помощи системы малик-энзимов), обеспечивая субстратами анаболические процессы. Очевидно, на свету ЦТК может функционировать не замкнуто и поставлять углеродные скелеты для биосинтетических процессов [10, 11]. Было высказано предположение, что цитрат является основным экспортируемым продуктом цикла Кребса в условиях фотосинтеза [12].

Активность ферментов ЦТК в условиях света значительно снижается по сравнению с таковыми показателями в темноте. При этом, уменьшение скорости функционирования характерно как для маркерного фермента цикла Кребса (СДГ) [4, 13], так и для митохондриальных изоферментов ЦС, АГ, ФГ [8, 14].

Изменение активности изоферментов СДГ, ЦС и АГ в листьях кукурузы при изменении светового режима растений свидетельствует об их светозависимости. Установлено, что в регуляции митохондриальных и внемитохондриальных изоферментов СДГ, ЦС, ФГ и АГ принимают участие фоторецепторные системы. Одним из способов такой регуляции является контроль уровня транскриптов генов в клетке [15].

ФИТОХРОМНАЯ РЕГУЛЯЦИЯ МИТОХОНДРИАЛЬНЫХ ФЕРМЕНТОВ

Фитохромная система может регулировать митохондриальное дыхание как посредством регуляции активности уже синтезированных ферментов, так и посредством модификации экспрессии их генов [3, 16]. Многие ферменты сопряженного митохондриального дыхания, а также первый комплекс ЭТЦ митохондрий снижают скорость своего функционирования в присутствии активной формы фитохрома в клетке [4, 13, 14], в то время как ферменты альтернативных путей электронного транспорта увеличивают свою активность [8, 9].

В реализации фитохромного сигнала чаще всего задействованы внутриклеточные и внутриядерные переносчики сигналов [17, 18]. Поскольку фитохром А имеет в большей степени цитозольную локализацию [19], а сигнал передается в ядро на молекулу ДНК, то возникает необходимость задействования клеточных интермедиатов в реализации фитохромного сигнала в пределах клетки. Один короткий импульс красного света индуцирует импорт фитохрома А в ядро, который происходит очень быстро (в течение нескольких минут), тогда как перенос фитохрома В в ядро относительно медленный и занимает часы [19]. При этом, в клетке имеется сигнальный механизм передачи фитохромного сигнала, где внутриклеточными посредниками являются Ca²⁺ и цАМФ [20–22].

Активная форма фитохрома вызывает увеличение содержания свободных катионов кальция в ядрах клеток, что наблюдается при облучении растений красным светом с длиной волны 660 нм. Изменение концентрации свободных ионов кальция в ядрах листьев кукурузы зависит от состояния фитохромной системы и может быть обусловлено его перераспределением между компартментами клетки [23, 24] или высвобождением из кальциевых депо [25].

Результаты исследований с применением специфического ингибитора кальциевых каналов (рутений красный) и комплексона (ЭГТА) свидетельствуют, что изменение содержания свободного кальция в ядрах клеток листьев кукурузы связано с его перераспределением между компартментами клетки, в частности, с переносом ионов Са²⁺ из цитоплазмы в ядро [26]. Увеличение концентрации кальция в ядрах в ответ на облучение растений КС, приводит к запуску каскадных механизмов фитохром-зависимой регуляции экспрессии генов посредством внутриядерных трансдукторов сигнала.

Установлено, что изменение уровня транскриптов генов СДГ [26–28], ФГ [29] и колебания концентрации катионов кальция в ядрах растений в условиях освещения светом разного спектрального состава находятся в определенной корреляционной зависимости. Вероятно, катионы кальция играют значительную роль в трансдукции фитохромного сигнала, модулируя различные механизмы регуляции экспрессии генетического материала клетки.

Фитохром-зависимое внутриклеточное перераспределение свободных катионов кальция вызывает изменения в функционировании Ca²⁺-зависимых протеинкиназы и фосфатазы, осуществляющих контроль взаимодействия ДНК и транскрипционных факторов и регулирующих экспрессию генов [26, 30].

Кальмодулины могут обеспечивать реализацию кальциевого и фосфатного путей передачи сигнала, а также участвуют в фосфорилировании [31]. Кроме того, кальмодулины проявляют свое действие через непосредственное воздействие на белковые молекулы [32].

Фитохром-зависимое увеличение концентрации кальция в ядерной фракции приводит к активации кальмодулина 7, проявляющего киназную реакцию и способного модулировать работу транскрипционных факторов. Активная форма фитохрома вызывает увеличение количества мРНК гена белка кальмодулина 7, в частности calm7-4, локализованного в 3 хромосоме. Посредником во внутриядерной передаче фитохромного сигнала является транскрипционный фактор PIF3, инактивация которого за счет фосфорилирования наблюдается в ответ на накопление активной формы фитохрома А в клетке (рис. 1).

Рис. 1.

Гипотетическая схема трансдукции фитохромного сигнала и механизма кальций-зависимой регуляции экспрессии генов при участии кальмодулина и транcкрипционного фактора PIF3, обеспечивающего изменения сродства РНК-полимеразы к промоторам генов, в листьях растений. Фк – фитохром красный, Фдк – фитохром дальний красный, Ф – фосфатная группа, PIF3 – фитохром-индуцируемый транскрипционный фактор.

Наличие активной формы фитохрома в клетке способствует уменьшению экспрессии генов ФГ и СДГ в листьях кукурузы при их облучении красным светом (660 нм) [6, 33]. Кроме того, известно, что фитохром А играет доминирующую роль в регуляции деградации PIF1 на свету, в то время как фитохромы В и D также влияют на разрушение PIF1, но проявляют свое действие в условиях более длительного освещения [34].

В отличие от PIF3, транскрипционный фактор PIF1 не взаимодействует непосредственно с фитохромами А и В, однако имеет важное значение в регуляции метаболизма в темноте. Эти данные свидетельствуют о том, что регуляция световых процессов в клетках растений может осуществляться путем удаления негативных регуляторов (например, PIF) путем светозависимого протеолиза [35].

Важное значение в PIF-зависимой регуляции генов играют особенности структуры промоторов генов, в частности, специфических участков связывания (G- и Е-участки) для транскрипционного фактора семейства PIF [36–38]. Наличие данного участка в составе промотора исследуемых генов указывает на возможность регуляции их транскрипции на уровне изменения сродства РНК-полимеразы к промоторам генов (рис. 1) [39].

ФИТОХРОМ-ЗАВИСИМОЕ МЕТИЛИРОВАНИЕ ПРОМОТОРОВ ГЕНОВ МИТОХОНДРИАЛЬНЫХ ФЕРМЕНТОВ

Не все гены имеют в составе нуклеотидной последовательности промоторов CpG-островки, однако, они подвергаются фитохром-зависимой регуляции, следовательно, контроль за их экспрессией может осуществляться иными способами, в том числе эпигенетическим за счет изменения метильного статуса ДНК. Метилирование ДНК – один из факторов, влияющих на экспрессию генов. Изменение метильного статуса цитозина в растительных организмах в большей степени характерно для промоторных областей генов [40]. Ингибирование скорости транскрипции генов является результатом изменения состояния хроматина (увеличения его конденсации при увеличении метильного статуса), что препятствует присоединению транскрипционных факторов к соответствующему гену. При этом, изменение статуса метилирования одного нуклеотида практически не влияет на процесс присоединения транскрипционного фактора к промотору гена [41].

Значительные отличия в регуляции генов наблюдаются при отсутствии в составе промотора CpG-островка. Изменение метильного статуса отдельных цитозинов промотора данных генов оказывает значительное влияние на уровень его экспрессии. Подобный эффект был обнаружен для транскрипционного фактора AP-2 [42], участвующего в регуляции роста и развития растений, созревании плодов, защитной реакции и метаболизме [43].

Применение метода метилспецифичной ПЦР позволило установить роль метильного статуса промоторов генов ЦС и АГ, 2ОГДГ, СДГ, ФГ и МДГ в их регуляции. Как правило, метильный статус меняется в регуляторных областях генов (промоторах) или в транскрибируемых областях. При этом метильный статус отдельных нуклеотидов коррелирует с уровнем транскрипции соответствующих генов [44, 45]. Для генов флавопротеина CДГ [46], а также генов митохондриальных изоферментов АГ [7], ФГ и ЦС [14] показано, что увеличение метильного статуса их промоторов в условиях наличия активной формы фитохрома в клетке соотносится с уменьшением количества транскриптов. Невысокий метильный статус CG-динуклеотидов промоторов генов sdh1-2, aco1, fum1 и csy1 в растениях, формируемый в клетках растений в темноте и при действии ДКС, способствует увеличению содержания мРНК генов исследуемых изоферментов метаболизма ди- и трикарбоновых кислот и их каталитической активности (рис. 2). Противоположное действие вызывает красный свет, что приводит к увеличению статуса метилирования промоторов генов исследуемых изоферментов и угнетению их каталитической активности.

Рис. 2.

Схема внутриклеточной трансдукции фитохромного сигнала в растительной клетке и регуляции экспрессии генов митохондриальных изоферментов ЦТК. Фк – фитохром красный, Фдк – фитохром дальний красный, Ф – фосфатная группа, PIF3 – фитохром-индуцируемый транскрипционный фактор, СаМ – кальмодулин.

Для генов sdh1-2, aco1, fum1 и csy1 изоферментов СДГ, ЦС, ФГ и АГ показано наличие в составе их промоторов CpG-островков (табл. 1), что является необходимым условием их регуляции посредством изменения метильного статуса ДНК [47–49]. Отсутствие CpG-островков в промоторах генов sdh2-3, ogdh1 и ogdh2 митохондриальных изоферментов кукурузы свидетельствует об ином механизме контроля их экспрессии, не связанного с изменением метильного статуса регуляторной области соответствующих генов [39].

Изменение метильного статуса промоторов генов митохондриальных изоферментов играет важную роль в их фитохром-зависимой регуляции. Для генов изоферментов СДГ, АГ, ФГ и ЦС показано, что увеличение метильного статуса их промоторов соотносится с низким содержанием транскриптов (рис. 3). Невысокая степень метилирования CG-динуклеотидов промоторов генов sdh1-2, aco1 и csy1 в растениях, экспонируемых на свету и после облучения красным светом, совпадала с высоким уровнем экспрессии исследуемых генов и, как следствие, высокой каталитической активностью энзимов [7, 14, 45]. Стоит отметить, что регуляция экспрессии характерна для генов изоферментов ЦТК, в промоторе которых присутствует CpG-островок. Обратная ситуация наблюдается в темноте и при облучении растений дальним красным светом и последовательным облучением красным и дальним красным светом. В данных вариантах опыта наблюдается увеличение величины метильного статуса CG-динуклеотидов промоторов генов исследуемых ферментов, что приводит к снижению скорости их функционирования.

Рис. 3.

Гипотетическая схема эпигенетической регуляции экспрессии генов изоферментов ЦТК фитохромной системой, осуществляемая посредством кальций-зависимой регуляции активности ДНК-метилтрансферазы. Фк – фитохром красный, Фдк – фитохром дальний красный, Ф – фосфатная группа, СаМ – кальмодулин, SAM – S-аденозилметионин, SAH – S-аденозилгомоцистеин.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Регуляция функционирования цикла трикарбоновых кислот в листьях растений в условиях светового режима обусловлена наличием в клетке митохондриальных и цитоплазматических изоферментов. Светозависимость активности 2-ОГДГ, АГ, ФГ, СДГ, ЦС и МДГ обусловлена длиной волны света, воздействующего на растения, и имеет дифференциальный характер по отношению к митохондриальным и цитоплазматическим изоферментам. Активная форма фитохрома А осуществляет основную, а фитохром В вспомогательную роль в регуляции функционирования изоферментов цикла Кребса, приводя к уменьшению уровня транскриптов митохондриальных форм ферментов и их активности и увеличению данных показателей для цитоплазматических изозимов. Активация фитохрома способствует увеличению содержания свободных катионов кальция в ядре посредством мембранных кальциевых каналов, обеспечивая, таким образом, трансдукцию сигнала в ядро клетки [50]. Кальциевая сигнализация опосредуется кальмодулинами, которые принимают непосредственное участие в световой регуляции клеточного метаболизма [51], обеспечивая реализацию фоторецепторного сигнала на уровне функционирования ферментов ЦТК. Факторы семейства PIF являются посредниками во внутриядерной передаче фитохромного сигнала, где особая роль отводится транскрипционному фактору PIF3, что соотносится с увеличением уровня экспрессии его гена на свету [26].

Важное значение в регуляции экспрессии генов отводится изменению метильного статуса ДНК за счет функционирования ДНК-метилтрансфераз [52, 53]. Активация кальмодулинов фитохромом А может способствовать увеличению активности ДНК-метилтрансфераз при их фосфорилировании, что напрямую отражается на величине метильного статуса ДНК. Для генов СДГ, ЦС, ФГ и АГ, содержащих в промоторах CpG-островки, установлена четкая зависимость между уровнем транскриптов и величиной статуса метилирования отдельных CG-динуклеотидов. Высокий метильный уровень промоторов генов митохондриальных форм исследуемых ферментов приводит к снижению содержания их транскриптов в растениях на свету и при облучении красным светом. При этом, для промоторов генов цитоплазматических изоферментов АГ и ЦС показана обратная зависимость.

Работа выполнена при поддержке Российского фонда фундаментальных исследований, проект № 20-04-00296.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов. Настоящая работа не содержит каких-либо исследований с участием людей и животных в качестве объектов исследования.