Физиология растений, 2023, T. 70, № 1, стр. 80-90

ВВЕДЕНИЕ

Межорганельные взаимодействия имеют большое значение для любой эукариотический клетки и координируют все основные процессы ее жизнедеятельности. Обмен информацией между органеллами клетки идет в двух направлениях. Во-первых, ядро направляет в органеллы большое количество регуляторных белков, которые в основном и определяют биогенез и функционирование органелл (антероградный сигнал). С другой стороны, хлоропласты и митохондрии посылают в ядро свои сигналы. В ответ на них может изменяться экспрессия ядерных генов, имеющих отношение к органеллам (ретроградный сигнал). Среди транс-факторов, участвующих в регуляции пластидной транскрипции Arabidopsis, наибольшей известностью пользуются шесть сигма-факторов, которые взаимодействуют с мультисубъединичной РНК-полимеразой бактериального типа (PEP) и определяют специфичность транскрипции пластидных генов. Необходимо, однако, отметить, что по своему происхождению сигма-факторы являются продуктами эволюции прокариотических генов, перенесенных в ядро и перенаправляемых в хлоропласты. Наряду с ними в регуляцию экспрессии органелл могут быть вовлечены дополнительные эукариотические белки, которые должны иметь консервативные домены, характерные для транс-факторов, и сигнальные пептиды, направляющие эти белки в органеллы. По данным биоинформатических исследований к кандидатам в регуляторы пластидной транскрипции могут относиться более 40 (возможно до 100) транс-факторов эукариотического происхождения из полутора десятков различных семейств [1, 2]. Однако действительно ли они связываются с промоторами генов пластид, определяя их экспрессию, как правило, не установлено, как и внутриклеточной локализации самих транс-факторов.

Среди пластидных белков, содержащих мотивы ядерных транскрипционных факторов, особое внимание исследователей привлекал белок PTF1/ТСР13 (Plastid Transcription Factor 1/(Teosinte Branched1/Cycloidea/PCF) Arabidopsis thaliana, содержащий мотив bHLH (basic helix-loop-helix) из семейства ТСР. Согласно исследованиям Baba с соавт. [3], PTF1/TCP13 регулировал экспрессию хлоропластного гена psbD, кодирующего D2 белок ФС II, связываясь с мотивом ACC свето-регулируемого промотора BLRP (Blue Light Responsive Promoter). Инсерционный мутант ptf1 имел сниженную активность psbD-BLRP при непрерывном освещении и ряд фенотипических нарушений в условиях короткого дня, таких как ускоренное снижение содержания хлорофилла в семядолях, позднее цветение и карликовость. Однако Kodama [4] отрицал участие PTF1/TCP13 белка в регуляции транскрипции psbD с промотора BLRP. Более того, PTF1/TCP13, согласно результатам с GFP мечением, репрессировал транскрипцию ядерных генов и был локализован в ядре, а не в пластидах [5]. Таким образом, выводы в отношении биологических функций PTF1/TCP13 требуют дополнительных исследований.

Известно, что ген PTF1/TCP13 активируется АБК [6], то есть PTF1/TCP13 может принадлежать к числу транс-факторов, способных модулировать ядерный сигнал в ответ на действие фитогормона и прямо или косвенно изменять экспрессию пластидного генома. В частности, PTF1/TCP13 представляет мишень для ряда патогенов и участвует в подавлении образования АФК, что является одним из прямых механизмов снижения иммунитета растений [7]. В основе этого механизма лежит индуцируемое патогенами увеличение содержания АБК и ингибирование активности генов ФС II, что приводит к дестабилизации электронного транспорта и предотвращению “взрыва” АФК. Таким способом патогены переключают работу генов хозяина в свою пользу. PTF1/TCP13 также может связываться с промотором гена ATHB12 (Arabidopsis thaliana homeobox12), отвечающего за растяжение клеток и повышение уровня плоидности, и ингибировать развитие листа [8]. Помимо этого, PTF1/TCP13, индуцируемый дегидратационным стрессом, действует как ключевой регулятор роста листьев и корней растений в условиях обезвоживания [9].

Цель работы – анализ АБК- и стресс-зависимой регуляции экспрессии PTF1/TCP13 и его возможного участия в контроле экспрессии гена psbD со свето- и стресс-индуцируемого промотора BLRP и некоторых других хлоропластных генов. Мы показали, что PTF1/TCP13 не принимает непосредственного участия в регуляции экспрессии psbD с промотора BLRP. Однако он является одним из компонентов АБК-зависимого регуляторного механизма, способного модифицировать экспрессию ядерных и хлоропластных генов в условиях изменения гомеостаза.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В качестве модельного объекта была использована трансгенная линия TPT_3.02150.1E Arabidopsis thaliana из коллекции Transplanta, которая могла экспрессировать ген целевого транс-фактора PTF1/TCP13 (AT3G02150) под действием β-эстрадиол индуцибельного промотора [10]. В исследование были включены также мутанты по генам синтеза и трансдукции сигнала АБК aba2, aba3, abi1, abi2, abi3, abi4, abi5 и их родительские экотипы Columbia, Landsberg erecta и Wasielewskaya.

Проростки культивировали в течение двух недель на агаризованной половинной МС-среде с добавлением 1% сахарозы при температуре 22°C, продолжительности светового и темнового периодов 16/8 ч и интенсивности освещения 120 мкE m^–2 s^–1. После этого их помещали на фильтры, смоченные жидкой половинной средой МС, содержавшей АБК (5 × 10^–5 М), на 3 или 24 ч и фиксировали в жидком азоте. Растения трансгенной линии TPT_3.02150.1E инкубировали на растворе 1/2 МС с β-эстрадиолом (10^–5 М) и/или АБК. Для анализа светорегулируемой экспрессии psbD с промотора BLRP проростки трансформанта, инкубируемые на растворе 1/2 МС с β-эстрадиолом, переносили на 2 суток в темноту в соответствии с протоколом Baba с соавт. [3], после чего освещали в течение 2 ч.

Экспрессию генов в условиях абиотических стрессов тестировали на растениях линии TPT_3.02150.1E, которые переносили на 24 ч на бумажные фильтры, смоченные жидкой МС-средой с добавлением маннита (300 мM), NаCl (150 мM), или инкубировали при 1°С в климатической камере MLR-352Н-PE (“Sanyo”, Япония). Уровень транскриптов исследуемых генов оценивали с помощью ПЦР-РВ с использованием амплификатора LigthCyclerR96 (“Roche”, Швейцария) согласно методике, описанной ранее [11]. Нуклеотидные последовательности праймеров к кодирующей области целевых генов приведены в таблице 1 Дополнительных материалов. Последовательности праймеров к psbD BLRP были взяты из работы Belbin с соавт. [12]. В качестве референсных генов использовали ген убиквитина UBQ10 (At5g53300) и/или ген регуляторной субъединицы А2 протеинфосфатазы PP2A (At3g25800).

Содержание пролина и МДА определяли в соответствии с протоколами Bates с соавт. [13] и Heath и Packer [14]. Для оценки солеустойчивости 4-дневные проростки переносили на 1% агаризованную 1/2 МС-среду, содержавшую 150 мM NаCl, и через 4 суток измеряли удлинение корней. Всхожесть семян на среде с 150 мM NаCl оценивали через 6 дней по появлению раскрытых семядолей [15]. Выживание растений в условиях засоления определяли через 4 дня после перенесения 7-дневных растений на 1/2 МС-среду, содержавшую 150 мM NаCl.

Все эксперименты проводили в трех биологических повторностях. Достоверность различий между опытными и контрольными образцами оценивали с помощью критерия Стьюдента. На рисунках приведены средние значения и стандартные ошибки средних.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Для анализа участия белка TCP13 в регуляции экспрессии гена psbD нами был использован трансформант из коллекции линий TRANSPLANTA, у которого ген транс-фактора экспрессировался под действием β-эстрадиол-индуцибельного промотора. Наличие подобных конструкций позволяет оценить, как оверэкспрессия белка влияет на фенотип мутанта, что решает проблему функциональной избыточности для представителей больших семейств транс-факторов и одновременно нивелирует возможное негативное влияние конститутивной оверэкспрессии [10].

Прежде всего, мы воспроизвели эксперимент Baba с соавт. [3] на трансгенных растениях, оверэкспрессирующих PTF1/TCP13 ген. Двухнедельные проростки, инкубируемые на растворе половинной среды МС, в которую был добавлен β-эстрадиол в концентрации 10^–5 М, переносили на 2 суток в темноту, после чего освещали в течение 2 ч. Уровень транскриптов psbD, транскрипция которых инициировалась с промотора BLRP, как и ожидалось, существенно увеличивался на свету, хотя количество матриц psbD, транскрибируемых с других промоторов этого гена, практически не изменялось (рис. 1). Однако накопление транскриптов psbD-BLRP у трансформанта в присутствии β-эстрадиола не отличалось от уровня контрольного варианта, инкубируемого на среде без индуктора. При этом экспрессия гена PTF1/TCP13 под действием β-эстрадиола резко возрастала. Следовательно, увеличение экспрессии гена PTF1/TCP13 на среде с β-эстрадиолом не способствовало ожидаемому росту накопления продукта гена psbD-BLRP. Подобная реакция заставляет усомниться в прямом участии PTF1/TCP13 в регуляции экспрессии пластидных генов в качестве транскрипционного фактора.

Рис. 1.

Влияние света и β-эстрадиола на уровень транскриптов генов psbD и PTF1/TCP13 у 2-недельных растений линии TPT_3.02150.1E A. thaliana, которые инкубировались в течение 48 ч в темноте и затем 2 ч на свету на средах: 1 – МС; 2 – МС + β-эстрадиол (10^–5 М). * – Статистически значимые различия между образцами на МС с эстрадиолом и без эстрадиола при P < 0.05 (t-критерий); # – статистически значимые различия меду образцами в темноте и на свету.

Известно, что АБК повышает уровень мРНК psbD, транскрибируемых со свето- и стресс-регулируемого промотора BLRP [6]. Действительно, при обработке АБК (5 × 10^–3 М) мы наблюдали повышенное накопление транскриптов psbD-BLRP, но не мРНК, транскрибируемых с других промоторов гена psbD (рис. 2). Параллельно в 3–5 раз усиливалась экспрессия PTF1. Однако еще более значимая индукция экспрессии PTF1 при действии β- эстрадиола через 24 ч обработки (до 15–20 раз) не приводила к достоверным изменениям в количестве транскриптов psbD-BLRP. Это, безусловно, означает, что прямая зависимость между экспрессией PTF1/TCP13 и psbD-BLRP отсутствует.

Рис. 2.

Влияние АБК и β-эстрадиола на уровень транскриптов генов psbD и PTF1/TCP13 у 2-недельных растений A. thaliana, инкубированных на свету в течение 3 и 24 ч на следующих средах: 1 – МС; 2 ‒ МС + АБК (5 × 10^–5 М); 3 – МС + β-эстрадиол (10^–5 М); 4 – МС + β-эстрадиол (10^–5 М) + АБК (5 × × 10^–5 М). * – Статистически значимые различия при P < 0.05 (t-критерий).

Активация PTF1/TCP13 β-эстрадиолом также не вызывала значимых изменений в экспрессии некоторых других генов, кодируемых пластомом, включая rbcL, psbA, clpP, rpoB и accD. Вместе с тем, в присутствии АБК (24 ч) наблюдалось подавление их экспрессии (табл. 1). Таким образом, АБК подавляла накопление транскриптов как PEP- (Plastid Encoded Polymerase), так и NEP- (Nuclear Encoded Polymerase) зависимых хлоропластных генов. Аналогичные результаты были получены для кодируемых ядром генов пластидных РНК-полимераз RPOTp и RPOTmp, а также ядерного гена CAB2, продукты которого входят в светособирающий комплекс ФС II.

Активация PTF1 абсцизовой кислотой может являться одним из механизмов, способных опосредованно модифицировать экспрессию ядерных и хлоропластных генов в ответ на изменение гомеостаза. С целью дальнейшего анализа функции PTF1 и его роли в АБК-регулируемых физиологических реакциях мы, прежде всего, задались вопросом о потенциальных путях передачи сигнала АБК у трансгенной линии TPT_3.02150.1E A. thaliana. Для выявления роли компонентов сигналинга АБК в регуляции экспрессии PTF1/TCP13 были использованы мутанты abi1 и abi2 с инактивированными протеинфосфатазами РР2С и их исходный экотип Landsgerg erecta, а также мутант abi5 с нокаутированным геном ответа на АБК и его родительский экотип Wasielewskaya. При проведении сигнала АБК рецепторы типа PYR/PYL/RCAR ингибировали активность протеинфосфатаз РР2С, что вызывало автоактивацию киназы SnRK2, которая фосфорилировала транс-факторы, регулирующие транскрипцию целевых генов [16]. АБК-зависимая индукция гена PTF1/TCP13 была снижена у мутантов abi1 и abi5 и отсутствовала у abi2 (рис. 3). Это позволяет заключить, что в регуляции экспрессии PTF1/TCP13 принимают участие гены канонического пути передачи сигнала АБК.

Рис. 3.

Эффект АБК на экспрессию гена PTF1/TCP13 у 2-недельных растений A. thaliana дикого типа (а) Ler, (б) Was и полученных на их основе мутантов по генам трансдукции сигнала АБК, инкубированных на свету в течение 3 ч на средах: 1 – МС; 2 – МС + АБК (5 × × 10^–5 М). * – Статистически значимые различия при P < 0.05 (t-критерий).

Далее мы исследовали экспрессию некоторых генов синтеза и сигналинга АБК у линии TPT_3.02150.1E в присутствии β-эстрадиола. Оверэкспрессия PTF1/TCP13 способствовала росту накопления транскриптов маркерных генов ответа на АБК RAB18 и RD29A, хотя их активация была значительно более слабой, чем при обработке экзогенной АБК (рис. 4). При этом воспроизводимые отличия в экспрессии генов сигналинга или метаболизма АБК в присутствии β-эстрадиола отсутствовали (табл. 2).

Рис. 4.

Влияние АБК и β-эстрадиола на уровень транскриптов маркерных генов ответа на АБК у 2‑недельных растений A. thaliana, инкубированных в течение 3 (а) и 24 (б) часов на свету на следующих средах: 1 – МС; 2 – МС + АБК (5 × 10^–5 М); 3 – МС + + β-эстрадиол (10^–5 М); 4 – МС + β-эстрадиол (10^‒5 М) + АБК (5 × 10^–5 М). * – Статистически значимые различия при P < 0.05 (t-критерий).

Для углубленного анализа функции PTF1/TCP13 был изучен также ответ линии TPT_3.02150.1E на действие абиотических стрессоров. Экспрессия гена PTF1/TCP13 в отсутствии индуктора (β-эстрадиола) возрастала в полтора раза при засолении (150 мM NаCI, 24 ч) и практически не менялась в ответ на холодовой (1°С, 24 ч) или осмотический стрессы (300 мM маннит, 24 ч), хотя экспрессия маркерных генов абиотического стресса (RAB18, RD29A и COR15) резко активировалась. При одновременной обработке β-эстрадиолом и стрессорами накопление транскриптов PTF1/TCP13 сохранялось на уровне значений, индуцируемых только β-эстрадиолом при солевом и осмотическом стрессах, но оказалось ниже при гипотермии (табл. 2). Следовательно, холодовая экспозиция в использованной нами экспериментальной постановке могла способствовать подавлению оверэкспрессии PTF1/TCP13.

Необходимо отметить, что стимуляция PTF1/TCP13 β-эстрадиолом слабо влияла на изменение экспрессии позитивных маркеров абиотического стресса и АБК на фоне осмотического или холодового стресса, т.е. уровни накопления транскриптов COR15, RAB18 и RD29A незначительно отличались от стресс-активируемых значений в отсутствии индуктора. Однако неожиданным результатом экспериментов явился тот факт, что содержание матриц всех этих генов оказалось резко снижено в условиях солевого стресса и одновременной индукции PTF1/TCP13 β-эстрадиолом (табл. 2). При этом гены трансдукции сигнала АБК HAB1, ABI1 и ABI2, активируемые солевым стрессом в 2–4 раза, сохраняли контрольные значения экспрессии при одновременной обработке NaCl и β-эстрадиолом, а экспрессия гена синтеза АБК ABA1 (ZEP) подавлялась (табл. 2). Таким образом, оверэкспрессия PTF1/TCP13 при засолении сопровождалась снижением накопления матриц стресс-индуцибельных генов и некоторых генов синтеза и сигналинга АБК. Параллельно у оверэкспрессирующих растений при солевом стрессе уменьшалось подавление экспрессии некоторых генов пластидного кодирования, причем для генов psbA и rpoB уровни транскриптов не отличались от контрольных.

На среде с β-эстрадиолом в условиях засоления у трансформанта снижалась также экспрессия гена CBF1, используемого как маркер солевого стресса, и экспрессия гена сенсора Са⁺²SOS3 (AT5G24270, salt overly sensitive 3), регулирующего гомеостаз Na (+)/K (+), при этом экспрессия гена К⁺/Na⁺ транспортера HKT1;1 (At4G10310) оказалась снижена как на среде с β-эстрадиолом, так и без добавления индуктора. Это говорит о том, что PTF1/TCP13 не связан с регуляцией загрузки ионов Na⁺ из корневой ксилемы в клетки паренхимы побегов (рис. 5).

Рис. 5.

Уровни транскриптов генов, регулируемых NаCl, у трансгенной линии TPT_3.02150.1E A. thaliana на среде с β-эстрадиолом и в отсутствии индуктора. Растения находились на средах: 1 – МС; 2 – МС+ + β-эстрадиол (10^–5 М); 3 – NаCl (150 mM); 4 – NаCl (150 mM) + β-эстрадиол (10^–5 М). * Статистически значимые различия по сравнению с контролем (МС) при P < 0.05 (t-критерий); # – статистически значимые различия при сравнении обработанных и необработанных эстрадиолом растений при P < 0.05 (t‑критерий).

Далее мы проанализировали влияние оверэкспрессии PTF1/TCP13 на фенотипические характеристики устойчивости к солевому стрессу: прорастание семян (всхожесть семян определяли по появлению раскрытых семядолей [15]), удлинение корней и выживание растений. Прорастание семян оказалось достоверно снижено на среде с NaCl (150 мМ) по сравнению с контрольным вариантом (рис. 6), а при индукции PTF1/TCP13 β-эстрадиолом на фоне солевого стресса этот показатель был уменьшен еще в большей степени. Мы выявили также достоверное укорочение корней на среде с β-эстрадиолом и NaCl по сравнению с образцами, культивированными в присутствии только NaCl, хотя эффект мог быть связан с кумулятивным действием обоих факторов, поскольку индукция PTF1 только β-эстрадиолом также приводила к укорочению корней. Эти результаты свидетельствуют, что PTF1 негативно регулирует рост корней и прорастание при солевом стрессе.

Рис. 6.

Фенотипическая характеристика трансгенной линии TPT_3.02150.1E A. thaliana в условиях засоления: а – всхожесть семян через 6 дней прорастания на среде МС (1) с добавлением β-эстрадиола (10^–5 М) (2), NаCl (150 мM) (3) и NаCl (150 мM) + β-эстрадиол (10^–5 М) (4), измеряемая по количеству полностью раскрывшихся семядолей; б – рост корней у 4-дневных проростков через 4 дня после перенесения на среду МС (1), содержащую β-эстрадиол (10^—5 М) (2), NаCl (150 mM) (3) и NаCl (150 мM) + β-эстрадиол (10^–5 М) (4); в – показатель выживаемости 7-дневных растений через 4 дня после перенесения на среду МС, содержащую NаCl (150 мM) (3) и NаCl (150 мM) + β-эстрадиол (10^–5 М) (4); г – содержание пролина у 4-дневных проростков через 4 дня после перенесения на среду МС (1), содержащую β-эстрадиол (10^—5 М) (2), NаCl (150 mM) (3) и NаCl (150 мM) + β-эстрадиол (10^–5 М) (4); д – МДА у 4-дневных проростков через 4 дня после перенесения на среду МС (1), содержащую β-эстрадиол (10^—5 М) (2), NаCl (150 mM) (3) и NаCl (150 мM) + β-эстрадиол (10^–5 М) (4). * Статистически значимые различия по сравнению с контролем (МС) при P < 0.05 (t-критерий); # – статистически значимые различия при сравнении обработанных и необработанных эстрадиолом растений при P < 0.05 (t-критерий).

Кроме того, в среде с β-эстрадиолом в условиях засоления у трансформанта достоверно уменьшалось содержание пролина и возрастало накопление малонового диальдегида, что указывало на снижение эффективности неферментативной антиоксидантой защиты (рис. 6). Однако оверэспрессия PTF1/TCP13 на среде, содержавшей 150 мМ NaCl, не влияла на показатель выживаемости растений, хотя при увеличении концентрации соли в среде до 200 мМ количество живых растений после четырех дней инкубирования на среде с β-эстрадиолом было достоверно ниже.

В целом, полученные данные позволяют сделать вывод об участии PTF1/TCP13 в АБК-зависимых реакциях при засолении в качестве отрицательного регулятора.

ОБСУЖДЕНИЕ

Вопрос об участии эукариотических транс-факторов в регуляции экспрессии пластидного генома, которые бы обеспечивали специфичность узнавания промоторов и непосредственно cвязывались с промоторной областью хлоропластных генов при их транскрипции, было предметом многочисленных исследований. К настоящему времени описано несколько предполагаемых кандидатов, таких как CDF у шпината, AGF и PGTF у ячменя, RLBF у табака, WHIRLY у томата [5, 17]. Показано, что эти факторы в большинстве случаев могут связываться со специфическими сайтами, отличающимися по своей последовательности от типичных промоторных элементов NEP или PEP [1]. Помимо них в регуляции транскрипции пластид принимают участие некоторые митохондриальные факторы терминации транскрипции (MTERF). Так, например, MTERF5 действует как фактор, обеспечивающий паузу в транскрипции оперона psbEFLG, кодирующего четыре ключевые субъединицы ФС II у A. thaliana [18], а mTERF6 обеспечивает терминацию транскрипции полицистрона rpoA [19]. Кроме того, был выявлен еще ряд нуклеоидных белков, включающих мотивы эукариотических транс-факторов: PEND, PD1 и PD3 у Pisum sativum, CND41 и NtWIN4 у Nicotiana tabacum и другие, которые, по-видимому, связаны с обеспечением структурной целостности нуклеоидов. На N-конце они обладают сгруппированными основными остатками, которые могут составлять ключевую структуру для превращения ядерных транскрипционных факторов в белки с пластидной локализацией [4]. Исследования подобных белков, содержащих мотивы факторов транскрипции и транзитные пептиды, позволили предположить, что растения в процессе эволюции развили способность преобразовывать белковые мотивы, приобретая, таким образом, множество функциональных белков, интегрированных в ответ пластома на стимулы окружающей среды.

К числу таких белков мог бы принадлежать и PTF1/TCP13. Однако спорные аргументы относительно его роли и клеточной локализации предполагают необходимость тщательной экспериментальной переоценки биологических функций этого транс-фактора. В представленной работе мы исследовали участие PTF1/TCP13 в регуляции экспрессии psbD с промотора BLRP, используя трансформант, у которого ген PTF1/TCP13 экспрессировался под контролем β-эстрадиол-индуцибельного промотора. Согласно полученным нами результатам, оверэкспрессия PTF1/TCP13 не способствовала ожидаемому росту накопления продукта гена psbD, транскрибируемого с промотора BLRP, хотя в отсутствии индукции β-эстрадиолом уровень транскриптов psbD-BLRP увеличивался при действии света или АБК (рис. 1). По данным Tsunoyama с соавт. [20], светозависимая транскрипция psbD не снижалась и у мутантов ptf1 с подавленной экспрессией PTF1, что также противоречит представлению об участии PTF1/TCP13 в световой сигнализации. Подобная реакция опровергает прямую зависимость экспрессии psbD с промотора BLRP от продукта гена PTF1/TCP13. В связи с этим заметим, что у мутанта с инактивированным геном SIG5 экспрессия psbD-BLRP, транскрибируемого при участии этого сигма-фактора, была полностью репрессирована [20].

SIG5, как известно, способен активироваться АБК и в условиях стресса поддерживать экспрессию psbD и psbA, усиливая восстановление реакционного центра ФС II [21]. С другой стороны, АБК репрессирует транскрипционную активность хлоропластных генов, стимулируя синтез алармона гуанозин-3’-5’-бисдифосфата (ppGpp), который связывается с β-субъединицей пластидной РНК-полимеразы и ингибирует транскрипцию генов рРНК, тРНК и других [6]. При патогенных инфекциях эта вторая функция АБК выходит на первый план и позволяет эффективно заражать растения. Так, индуцируемые Pseudomonas эффекторы HopR1 и HopBB1 усиливают синтез АБК, действуя через PTF1/TCP13, и подавляют экспрессию psbD и psbА, а также других пластидных генов [7]. Этим они блокируют электронный транспорт, предотвращая окислительный стресс, который является одним из факторов поддержания иммунитета растений. Существование подобной вирулентной стратегии противоречит возможности прямого связывания PTF1/TCP13 с psbD-BLRP, что, напротив, приводило бы к усилению экспрессии psbD. Суммируя эти данные, можно предполагать, что PTF1/TCP13 не является белковым фактором, регулирующим транскрипцию пластидных генов. В пользу данного предположения свидетельствуют также дополнительные исследования внутриклеточной локализации PTF1/TCP13, которые недавно были представлены в работе Urano с соавт. [9]: маркерный белок TCP13-sGFP экспрессировался в ядре. Эти результаты противоречат сведениям, приводимым на сервере ресурса http://bar.utoronto.ca/ efp/cgi-bin/efpWeb.cgi, но подтверждают ранее опубликованные данные [5].

Вместе с тем, PTF1 может представлять собой один из АБК-индуцируемых транс-факторов, опосредованно связанных с регуляцией экспрессии пластидного генома при стрессах, как биотических, о которых сообщали de Torres Zabala с соавт. [7], так и абиотических. При этом PTF1/TCP13, как и другие транс-факторы семейства CIN-подобных TCP транс-факторов, напрямую связан с механизмами адаптации к стрессам за счет изменений роста и морфологии листьев и корней. Согласно данным исследований Urano с соавт. [9], PTF1/TCP13 играет важную роль в регуляции роста листьев и корней в условиях обезвоживания, действуя через индуцированные засухой ауксиновые репрессоры IAA5 и IAA19 и регуляцию сигналинга АБК. Листья оверэкспрессирующих трансгенных растений 35Spro::TCP13OX показали снижение потери воды из листьев и повышенную устойчивость к обезвоживанию по сравнению с контрольными аналогами.

В условиях нашей экспериментальной модели не выявлено значимых отличий в экспрессии PTF1/TCP13 при обработке маннитом оверэспрессирующих растений по сравнению с аналогами с нормальным уровнем экспрессии этого транс-фактора, что, по-видимому, объяснялось дозой и длительностью воздействия осмотического стресса (24 ч и 300 мМ маннита против 7 дней и 25 мМ маннита в постановке Urano с соавт. [9]). Однако данные наших экспериментов свидетельствовали об участии PTF1/TCP13 в солевом стрессе. Оверэкспрессия PTF1/TCP13 способствовала снижению уровня транскриптов COR15, CBF1, RAB18 и RD29A, индуцируемых NaCl, по сравнению с аналогами на среде без β-эстрадиола, а также подавлению экспрессии гена кальциевого сенсора солеустойчивости SOS3 (табл. 2, рис. 5). Подобный транскриптомный ответ соответствует представлению о роли PTF1/TCP13 как отрицательного регулятора ответа на солевой стресс, что подтверждается пониженной солеустойчивостью оверэкспрессирующей линии. Таким образом, PTF1/TCP13 может действовать как положительный регулятор осмотического, но как отрицательный регулятор солевого стрессов.

Это неудивительно. Засоление сопровождается увеличенным поглощением растворенных веществ из воды под действием H*-ATФ-азной помпы и разрыхлением клеточных стенок, что способствует улучшению ионного гомеостаза и стимулирует расширение и рост клеток [22]. Вместе с тем, как было показано в серии экспериментов Hur с соавт. [8], PTF1/TCP13 ингибирует экспрессию транскрипционного фактора ATHB12, который способствует росту листьев, особенно во время фазы растяжения клеток. Тем самым PTF1/TCP13 препятствует поддержанию солеустойчивости. Эта реакция, как следует из наших данных, является АБК-зависимой и сопровождается снижением активности некоторых генов синтеза и трансдукции сигнала АБК, что, в свою очередь, содействует сохранению более высоких уровней экспрессии пластидных генов у оверэкспрессирующих растений в условиях солевого стресса. Таким образом, детали влияния АБК и PTF1/TCP13 могут быть динамичными и в каждый момент определяться балансом действующих внешних и внутренних факторов.

Суммируя вышесказанное, можно заключить, что PTF1 с большой вероятностью вовлечен в ответы на стрессы, связанные с изменением содержания АБК в клетке и способен опосредованно регулировать экспрессию хлоропластных генов.

Работа выполнена при финансовой поддержке Российского научного фонда, грант № 20-14-00065, а данные, представленные в таблице 2, получены при поддержке Министерства науки и высшего образования Российской Федерации (тема № 121040800153-1).

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов. Настоящая статья не содержит каких-либо исследований с участием людей и животных в качестве объектов исследований.