Физиология растений, 2023, T. 70, № 1, стр. 27-35

ВВЕДЕНИЕ

Водорастворимый периферический PsbO белок ФС II стабилизирует водоокисляющий 4-атомный марганцевый комплекс (ВОК) [1]. Установленным фактом считается разрушение 4-атомного марганцевого ВОК, связанное с удалением белка PsbO из мембран ФС II с помощью буфера 0.8 М Трис-HCl при рH 8.4 [2]. Обработка тилакоидных мембран NaCl-мочевиной удаляет из ФС II половину марганца и белок PsbO, но не полностью разрушает ВОК [3]. Зависимость совместного удаления из мембран ФС II белка PsbO и ионов Mn³⁺ от предварительного окисления Mn²⁺ до Mn³⁺ с помощью добавок окислителей в отмывающие растворы [4], свидетельствует о влиянии редокс-состояния этого металла на связывание с PsbO. Известно, что ионы Mn²⁺ влияют на конформацию белка при рН-титровании [5]. Однако остается открытым вопрос о возможном влиянии ионов металла на взаимодействие белка с реакционным центром D1-D2-cyt b₅₅₉ (РЦ) ФС II. Пока нет четких представлений о возможной роли связывания ионов Mn с белком PsbO в формировании ВОК. Не до конца изучен механизм марганец-стабилизирующей функции белка. Экспериментальные данные [6] с использованием мутаций белка являются доказательством защитной роли двух молекул PsbO от восстановителей марганца со стороны люмена. Вопрос о возможном димере PsbO in vivo, таким образом, остается актуальным. Остается также открытым вопрос о супероксиддисмутазной (СОД) активности PsbO. Ранее [7] на основании некоторого структурного сходства PsbO и СОД предполагалось наличие такой активности у белка PsbO. Однако данные, подтверждающие или опровергающие эту гипотезу, в литературе пока отсутствуют.

Настоящая работа посвящена исследованию взаимодействия белка PsbO с ионами Mn, комплексом РЦ ФС II, СОД-активности белка, связанного с Mn, и его димеризации.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В работе использовали тритон Х-100 (“Panreac”, Испания), Mes, Трис, n-додецил-β-D-мальтозид, реактивы для электрофореза фирмы “Sigma” (США), TSK-гель DEAE-Toyopearl 650S фирмы “TOSON” (Япония), CNBr-активированную агарозу фирмы “GE Healthcare”, нитросиний тетразолий хлорид (НСТ) фирмы “AppliChem”, акрилекс Р-4 “Reanal” (Венгрия), остальные реактивы квалификации х. ч. были произведены в России.

Кислород-выделяющие мембраны ФС II (BBY) получали из хлоропластов гороха (Pisum sativum L.) с помощью тритона Х-100, как описано ранее [8]. Кислород-выделяющий комплекс (КВК) и препараты РЦ получали из мембран по методу, описанному в нашей статье [9].

Экстракцию белка PsbO проводили последовательной обработкой мембран ФС II растворами 1 М NaCl и 1 M CaCl₂ в 50 мМ Трис-HCl буфере (pH 7.0), содержащем 0.3 М сахарозы при 4° на слабом свету. Полученный экстракт белка диализовали дважды по 5 ч против 10 мМ MES-буфера (рН 6.8), содержащего 10 мМ NaCl и 2 мМ ЭДТА, а затем концентрировали на ячейке Amicon (США).

Электрофоретически гомогенный белок PsbO иммобилизовали на CNBr-агарозе. Для этого 0.2 мг/мл белка инкубировали с BrCN-агарозой в 0.15 М Трис-HCl буфере (pH 8.5) с 0.2 М NaCl в течение 10 ч при 0˚. Непрореагировавшие с белком активные группы нейтрализовали 0.2 М α‑аминокапроновой кислотой при pH 8.5. В 1 мл агарозы содержалось 0.025 мг иммобилизованного белка PsbO. Агарозу-PsbO вносили в хроматографическую колонку и проводили аффинную хроматографию препаратов РЦ. Для исследования влияния ионов Mn³⁺ на взаимодействие белка с РЦ колонку последовательно промывали раствором, содержащим 5 мкМ MnCl₂, 5 мкМ феррицианида калия (ФЦ) и 5 мкМ 2,3,5,6-тетраметил-р-фенилендиамина (ТМФД) в 20 мМ Mes-NaOH (pH 6.5), уравновешивали препаратом комплекса РЦ, а затем элюировали градиентом концентрации CaCl₂.

Взаимодействие ионов Mn²⁺ с белком PsbO изучали также электрофорезом в нативных условиях, используя 15% ПААГ. Кроме ионов Mn²⁺ использовали Mg²⁺ и Fe²⁺. Электрофорез в денатурирующих условиях проводили в градиентном 7–15% ПААГ, содержащем 0.1% ДДС. Верхний электродный Tris-глициновый буфер (150 мМ, рН 8.3) содержал 0.1% ДДС. Для изучения связывания ионов Mn с белком в таких гелях, последний после завершения электрофореза отмывали от мочевины и ДДС, инкубировали 30 мин в 20 мМ Mes-NaOH (pH 6.5) с добавкой 20 мкм Mn²⁺, 5 мкМ ФЦ, 10 мкМ ТМФД, не связавшийся с белком металл отмывали той же буферной смесью. Гели инкубировали 20 мин в смеси, содержащей ТЕМЕД (20 мкМ), ЭДТА (5 мкМ), РФ (20 мкМ) и 50 мкМ нитросинего тетразолия хлорида (НСТ), после чего освещали 5–8 мин люминесцентной лампой ЛЛ 36 W/640 36 w. Зона в геле, содержавшая белок PsbO + Mn³⁺, не окрашивалась при освещении, что свидетельствовало о супероксиддисмутазной активности (СОД) [10].

Образование димера белка PsbO с участием дитирозина определяли спектрофлуориметрически [11, 12]. Флуоресценцию дитирозина в препарате белка после облучения УФ-светом сравнивали с флуоресценцией дитирозина при облучении раствора тирозина [13].

Спектры флуоресценции регистрировали с помощью спектрофлуориметра Hitachi-850 (Япония).

РЕЗУЛЬТАТЫ

На рис. 1а представлены электрофореграммы исходного препарата белка PsbO (дорожка 1), предварительно инкубированного с 2-меркаптоэтанолом (2МЕ) (дорожка 2), Mn²⁺ (дорожка 3) и 2МЕ + Mn²⁺ (дорожка 4), полученные с помощью SDS-PAGE электрофореза. Оказалось, что 2МЕ влияет на форму белковой полосы мономера. Последняя разделяется на две полосы: менее подвижную – восстановленную, и более подвижную – окисленную формы белка. Этот результат согласуется с литературными данными [14]. Интересным оказалось обнаружение дополнительной белковой зоны в опыте с Mn²⁺ (дорожка 3) и ее исчезновение, если вместе с Mn²⁺ был добавлен 2МЕ. Молекулярная масса белка в этой полосе соответствует димеру (66 кДа). Влияние 2МЕ на ее интенсивность свидетельствует о межмолекулярной дисульфидной ковалентной связи, образованной в гомодимере PsbO.

Рис. 1.

(а) SDS-PAGE электрофорез белка PsbO. 1 – контроль, PsbO, 15 мкМ; 2 – PsbO + 2-МЕ, 150 мкМ; 3 – PsbO + + Mn²⁺, 2 мкМ; 4 – PsbO + Mn²⁺, 2 мкМ + 2-МЕ, 150 мкМ; звездочкой показан димер белка PsbO. (б) СОД-активность (зона показана стрелкой) белка PsbO, связанного с ионами Mn²⁺.

На основании некоторого структурного сходства вторичной структуры молекул PsbO и СОД предполагалось [7], что белок PsbO может обладать СОД-активностью. Однако в литературе экспериментальное подтверждение этого предположения мы не обнаружили. Нам известна работа [15], в которой электрофоретически гомогенный препарат белка PsbO, выделенный из Capsosiphon fulvescens характеризуется как сильный антиоксидант, обладающий СОД-активностью. Остается неизвестным, какой металл содержится в активном центре белка PsbO из этого организма.

Так как механизм марганец-стабилизирующей функции в КВК остается невыясненным, и нельзя полностью исключить вклад взаимодействия ионов Mn c PsbO, мы попытались в опытах in vitro моделировать СОД-активность белка. Раствор белка 25 мкМ в 20 мМ Mes-буфере (pH 6.5) инкубировали отдельно с ионами Mn²⁺ и Mn²⁺ + + ФЦ + ТМФД, а несвязавшиеся ионы отделяли хроматографией на колонке биогеля Р-6. Комплекс белка PsbO с Mn³⁺ элюировался из колонки в первой фракции, свободный Mn – в последней фракции, что свидетельствовало о прочном связывании ионов Mn³⁺ с белком. Ионы Mn²⁺ не обнаруживались с белком PsbO по спектру в УФ-области поглощения. Однако комплекс белка с Mn³⁺, разделяемый в ПААГ не показывал СОД-активность, если ее определять в гелях (данные не представлены). Вероятно, утрата ионов Mn³⁺ происходит в ПААГ при электрофорезе и связана с восстановлением до Mn²⁺, что имеет место в марганцевом кластере при добавке к препаратам КВК восстановителей. Таким образом, было предположено, что комплекс белка с ионами металла нестабилен в условиях электрофореза. Это предположение было подтверждено в опытах с добавлением ионов Mn к белку после электрофореза. Гели с белком инкубировали в 20 мМ Mes-буфере (pH 6.5) с добавкой 20 мкм Mn²⁺, 5 мкМ ФЦ, 10 мкМ ТМФД. Не связавшийся с белком Mn отмывали от гелей 3-кратной инкубацией в 50 мМ Mes-NaOH (pH 6.5) и затем по методу [10] определяли СОД-активность PsbO. На рис. 1б на темном фоне восстановленного НСТ видна одна неокрашенная зона (показана стрелкой) СОД-активного белка, соответствующая молекулярной массе мономера PsbO.

Взаимодействие ионов металлов с белками можно исследовать различными методами, один из которых – металл-аффинный электрофорез в ПААГ [16]. В данном исследовании был использован метод нативного электрофореза в ПААГ.

На рис. 2 представлены денситограммы гелей, в которых проводили разделение смеси белка PsbO с ионами Mn²⁺, Mg²⁺ и Fe²⁺. Видно, что ионы используемых металлов, добавленные перед электрофорезом, влияют на количество мономера и димера белка PsbO. Сумма площади (отражающей количество белка) мономера и димера (образующегося в присутствии ионов Mn²⁺ и Fe²⁺) при добавке ионов металлов к белку перед электрофорезом меньше, чем площадь полосы белка в контрольном опыте (без добавок). Это можно объяснить образованием не только димера, но и агрегатов, которые осаждаются на старте гелей (1). Как видно из рис. 2, максимальной агрегирующей активностью обладают ионы Mg²⁺ по сравнению с ионами Mn²⁺. Димеризация белка наблюдается не только в присутствии Mn²⁺, но также ионов Fe²⁺. Кроме того, белок PsbO при взаимодействии с ионами металлов частично агрегирует, что можно объяснить металл-хелатирующим эффектом, который используется в методе аффинного металл-электрофореза [16].

Рис. 2.

Денситограммы гелей после нативного электрофореза в 15% ПААГ белка PsbO. 1 – агрегаты белка на старте геля, 2 – димер белка, 3 – мономер белка.

Результаты исследования взаимодействия PsbO c Mn²⁺ позволяют предполагать влияние Mn²⁺ на конформацию белка. Об этом свидетельствует димеризация белка и изменение электрофоретической подвижности мономера. Возможно, ионы Mn²⁺ регулируют взаимодействие PsbO с РЦ. Экспериментально проверить это предположение возможно хроматографией препарата РЦ с помощью аффинной колонки агароза-PsbO.

На рис. 3 представлены профили элюирования РЦ с колонки. Можно видеть, что в опыте без добавления ионов Mn (рис. 3, хроматограмма 1) комплекс элюируется в виде одного хроматографического пика. В опыте с последовательным внесением в колонку ионов Mn в присутствии ФЦ и ТМФД, затем препарата РЦ наблюдается более высокая концентрация СаCl₂, при которой комплекс РЦ-PsbO диссоциирует, при этом равновесие сдвигается в сторону свободного РЦ, и он вымывается из колонки (хроматограмма 2).

Рис. 3.

Хроматограмма элюирования с аффинной колонки комплекса D1/D2/cyt b₅₅₉ реакционного центра ФС II в отсутствие (1) и в присутствии (2) ионов Mn³⁺ (5 мкМ). Комплекс D1/D2/cyt в₅₅₉ РЦ ФС II наносили на колонку агарозы с иммобилизованным белком PsbO.

Взаимодействие PsbO с ионами Mn и белковыми компонентами РЦ было нами исследовано методом нативного электрофореза КВК в ПААГ (рис. 4). К препарату КВК перед электрофорезом добавляли 50 мкМ ЭДТА и хроматографировали на колонке акрилекс Р-4 для удаления металлов. Эффект ЭДТА проявляется уменьшением интенсивности синей окраски (гель 2) после инкубации гелей в растворе, содержащем ТЕМЕД, РФ, ФМС, и последующего освещения люминесцентной лампой. Это может свидетельствовать об ингибировании редуктазной (свето-индуцированное восстановление НСТ) активности в хлорофилл-белковых зонах суперкомплексов КВК (обозначено), вероятно, в результате хелатирования ионов Mn добавкой ЭДТА. На рис. 4 (гель 3) видно возрастание интенсивности восстановленного НСТ в зонах суперкомплексов КВК, к препарату которого перед электрофорезом были добавлены ЭДТА, белок PsbO и Mn²⁺.

Рис. 4.

СОД- и редуктазная активность Core PS II и белка PsbO. Электрофорез в нативных условиях, 7% ПААГ с дерифатом-160 и ДМ. 1 – Core PS II, контроль; 2 – Core PS II + ЭДТА; 3 – Core PS II + PsbO; 4 – PsbO (фракции нативного и окисленного белка). Звездочкой показано связывание белка PsbO с Core PS II. БФС – бромфеноловый синий.

Взаимодействие мономера PsbO с ионами Mn²⁺, как видно из рис. 1а (3), влияет на его электрофоретическую подвижность в ПААГ: белковая полоса мономера разделяется на две в присутствии ионов Mn. Похожий эффект наблюдается и при обработке препарата белка 2МЕ (рис. 1а (2)). Можно заключить, что одна из двух полос образуется в результате восстановления дисульфидной связи мономера. Восстановленный с помощью 2МЕ, либо ДТТ белок, как оказалось, проявлял цитохром с-550- и ДХФИФ-оксидазную активность (данные не представлены), стимулируемую освещением препарата белка УФ-светом. Возможно, активными сайтами, восстанавливающими цитохром, являются сульфгидрильные группы, которые образуются из дисульфидной связи при поглощении УФ-света белком [17].

Флуоресценция препарата PsbO до и после облучения УФ-светом дает дополнительную информацию к данным электрофореза в ПААГ об изменении нативной структуры и природе связи в димере белка. Так, на рис. 5а представлены спектры флуоресценции препарата до (1) и после (2) облучения УФ-светом. Величина максимума флуоресценции снижается при 310 нм (возбуждение флуоресценции длиной волны 296 нм, где поглощает Tрп), что свидетельствует об изменении конформации белка [18].

Рис. 5.

(а) Изменение спектра флуоресценции препарата белка PsbO до (1) и после (2) генерации супероксидных радикалов системой РФ-ТЕМЕД-ФМС-О₂, освещение УФ-светом 2 мин. Ех = 296, Ем = 305 нм. (б) Флуоресценция препарата (1мг/мл) белка PsbO (2, 4) и тирозина (1, 3) до (1, 2) и после (3, 4) освещения УФ-светом (2 мин). Ех = 325, Ем от 350 нм.

На рис. 5б представлены спектры флуоресценции препарата белка PsbO до (2) и после (4) и раствора Тир до (1) и после (3) облучения УФ-светом. Видно, что в спектре флуоресценции при возбуждении светом 340 нм обнаруживается максимум 410 нм, свидетельствующий об образовании дитирозиновой ковалентной связи в димере белка PsbO.

ОБСУЖДЕНИЕ

Мембраны ФС II, выделенные из тилакоидов высших растений, при освещении белым светом выделяют кислород в присутствии искусственных акцепторов электронов. Активность ингибируется обработкой мембран 0.8 М Трис-HCl (рН 8.4), либо 1М CaCl₂, так как от мембран отмываются водорастворимые белки и ионы Mn. Инкубация таких мембран с препаратом белка PsbO, ионами Mn²⁺, Cl^–, Са²⁺ частично восстанавливает активность [19–21]. Восстановление активности выделения кислорода добавками изолированного PsbO, ионов Mn²⁺, Ca²⁺, Cl^– является удобной моделью для исследования механизмов марганец-стабилизирующей функции PsbO белка. Белок при этом возможно предварительно химически модифицировать, и таким образом, изучить роль отдельных аминокислот в стабилизации марганцевого кластера [22, 23]. Эта же задача успешно решается методами мутагенеза [6].

В нашей работе исследовано взаимодействие иммобилизованного белка PsbO с ионами Mn²⁺ и препаратом РЦ. Аффинная хроматография препаратов РЦ на иммобилизованном белке PsbO позволяет исследовать влияние ионов Mn на взаимодействие белка с РЦ и, таким образом, моделировать взаимодействие белка с ионами Mn²⁺ и хлорофилл-белковым комплексом (ХБК) РЦ. Результаты связывания РЦ с иммобилизованным белком согласуются с литературными данными [24, 25]. Оказалось, что прочность связывания иммобилизованного белка с РЦ зависит от степени окисления Mn. Для окисления Mn²⁺ до Mn³⁺ необходимо в колонку с иммобилизованным белком вносить окислители, затем элюировать препарат РЦ градиентом концентрации CaCl₂. Результаты показали, что ионы Mn³⁺, связанные с белком, влияют на элюирование РЦ из колонки, что наблюдается задержкой выхода препарата из колонки (рис. 3, кривая 2) по сравнению с контролем (рис. 3, кривая 1). Возможно, эффект Mn связан с изменением электростатических и гидрофобных взаимодействий белка с РЦ. Как известно [4], ионы Mn³⁺ в присутствии ФЦ и ТМФД вымываются из мембран ФС II вместе с PsbO. При этом Mn³⁺ более прочно связывается с белком, чем Mn²⁺. Можно предположить, что ионы Mn³⁺ увеличивают электростатические и гидрофобные силы взаимодействия белка с РЦ.

В связывании катионов Mn³⁺ с PsbO могут принимать участие глутаматные и аспартатные остатки аминокислот, расположенные на поверхности β-спирали (бочонка). Они также участвуют в транспорте протонов из ВОК в люмен [26, 27]. Вероятно, связанные с белком ионы Mn в мембранах ФС II активируют СОД, а по данным [28, 29] карбоангидразную активность белка PsbO. Можно предположить, что СОД-активность PsbO белка защищает и стабилизирует D1-D2 / cyt b559 от инактивации, так как в этом комплексе генерируются супероксидные радикалы [30]. Супероксидные радикалы реагируют с ионами Mn, связанными с PsbO (рис. 4) и с Тир белка [31], что подтверждается изменением флуоресценции Tир в белке в условиях фотохимического образования радикалов О₂ (рис. 5).

Так как в используемой нами модели белок PsbO был пришит к BrCN-агарозе, можно исключить его внутрибелковые модификации в процессе иммобилизации. Это является существенным, учитывая физико-химическую природу белка, имеющего неупорядоченную внутреннюю структуру, которая претерпевает светоиндуцированные конформационные изменения, связанные с редокс-изменениями атомов Mn в ВОК [32]. Ковалентные внутрибелковые сшивки аминокислотных остатков белка PsbO приводят к неспособности восстановления кислород-выделяющей функции ФС II [33] и утрате динамического кислотно-основного гистерезиса [5].

Возрастание прочности связывания иммобилизованного PsbO-белка с РЦ в присутствии ионов марганца, хотя и косвенно, подтверждается эффектом увеличения в 6 раз константы связывания (К_а1) PsbO в опытах с мембранами ФС II, содержащими 4, 2 и 0 ионов Mn по данным, полученным в лаборатории T.M. Bricker [34], а также доказанной ролью белка PsbO в светоиндуцированной модуляции встраивания ионов Mn²⁺ в ФС II [35].

Локализация ионов Mn на иммобилизованном белке PsbO отличается от структурной организации ионов Mn в КВК. К тому же, белок не имеет прямого контакта с марганцевым кластером в ФС II [32]. Однако нельзя полностью исключать роль редокс-изменений атомов Mn в КВК, влияющих на конформацию PsbO-белка [27], и дальнодействующего эффекта PsbO на структуру и функции КВК [32]. Важно также, что в исследуемой нами системе (PsbO + Mn³⁺ + D1-D2-цитохром b₅₅₉) отсутствует антенный белок 47 кДа, который связывается с PsbO и участвует в организации Mn в КВК [36].

Оценивая полученные нами данные, можно заключить, что модельная система, включающая иммобилизованный PsbO-белок, РЦ и атомы Mn, позволяет изучать альтернативные механизмы взаимодействия ионов Mn с белком PsbO, активизируемыми стрессовыми факторами.

На рис. 6 представлена гипотетическая схема взаимодействия иммобилизованного PsbO белка с РЦ ФС II и ионами Mn³⁺. Согласно схеме, поверхностные группы аминокислотных остатков белка PsbO связаны ковалентной связью с агарозой. Аминокислоты внутренней неупорядоченной структуры белка не принимают участие в связывании с агарозой. Атомы Mn³⁺ взаимодействуют с аминокислотными остатками глутамата и аспартата β – структуры белка PsbO, и могут участвовать в альтернативной ЭТЦ [37]. Мы предполагаем, что белок PsbO в мембранах ФС II поддерживает ионы Mn в окисленной форме Mn³⁺, и таким образом выполняет марганец-стабилизирующую функцию.

Рис. 6.

Гипотетическая схема взаимодействия иммобилизованного белка PsbO с ионами Mn³⁺ и комплексом реакционного центра D1-D2-cyt b₅₅₉. Учитывая полученные данные с использованием иммобилизованного PsbO, ионов Mn³⁺ предполагается регуляция взаимодействия белка с РЦ. В хлоропластах Mn-оксидазная активность регулируется тиоредоксиновой системой, ионами Cl^– и О₂ [38]. Нековалентный димер PsbO [39] в хлоропластах может превращаться в ковалентный путем обратимых редокс-состояний связи. Тир белка PsbO участвует в альтернативной цепи электронного транспорта в условиях нитрования Тир9 [37]. На схеме использовали трехмерную гомологичную модель PsbO из цианобактерий [40]. 1 – Mn²⁺, 2 – Mn³⁺.

Известно, что изолированный белок PsbO в присутствии ионов Cl^–, О₂ и 2МЕ проявляет Mn-оксидазную активность [38]. Поэтому нельзя исключить в условиях in vivo формирование Mn³⁺ с участием белка и последующего включения Mn³⁺ в 4-атомный кластер. Ионы Mn³⁺ могут регулировать взаимодействие PsbO с РЦ, а также включаться в формирование 4-атомного кластера и таким образом стабилизировать КВК. Димеризация PsbO-белка может происходить в тилакоидах с участием электростатических взаимодействий и при участии аминокислот Тре и Сер [39], а также при последующем образовании дисульфидной связи в гомодимере белка в результате окислительно-восстановительных реакций и действия УФ-света.

Как показано на рис. 2, димеризация белка PsbO может иметь место не только при облучении УФ-светом, но и при взаимодействии белка с ионами металлов. Это может происходить в условиях загрязнения почвы тяжелыми металлами. Проникая в люмен тилакоидов, где локализован PsbO, ионы тяжелых металлов могут индуцировать окислительный стресс, особенно в присутствии восстановителей (например, аскорбиновой кислоты) и таким образом способствовать окислительно-восстановительным превращениям дисульфидной связи белка, что при условии близкого расположения в ФС II двух молекул PsbO способствует их димеризации. Кроме того, в условиях фотоинактивации ФС II, интенсивное продуцирование супероксидных радикалов, также может изменять структурную ориентацию белка и приводить к его димеризации.

По данным [39], перенос протонов на большие расстояния и специфическое связывание между белками в ФС II облегчаются сетями с водородными связями, которые часто включают более одной белковой субъединицы с участием глутамата и аспартата белка PsbO на люменальной поверхности ФС II.

Таким образом, при взаимодействии ионов Mn с растворимым препаратом белка PsbO может наблюдаться его димеризация и агрегация, а при включении Mn в иммобилизованный PsbO может изменяться его взаимодействие с РЦ. Возможно, что белок при взаимодействии с Mn³⁺, приобретает СОД-активность, что приводит к стабилизации КВК in vivo.

Авторы выражают благодарность в.н.с., к.б.н. А.А. Хоробрых из Института фундаментальных проблем биологии Российской академии наук за обсуждение полученных данных и помощь в оформлении.

Работа выполнена в рамках государственного задания Федерального исследовательского центра Пущинского научного центра биологических исследований Российской академии наук (№ 122041100274-6).

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов. Настоящая статья не содержит каких-либо исследований с участием людей и животных в качестве объектов исследования.