Физиология растений, 2023, T. 70, № 2, стр. 192-201

ВВЕДЕНИЕ

Известно, что связь между циклом трикарбоновых кислот и шунтом γ-аминомасляной кислоты активируется в ответ на действие некоторых абиотических стрессов и осуществляется посредством изменения функционирования глутаматдегидрогеназы. Этот фермент располагается на важном участке пересечения азотного и углеводного метаболизмов [1–3].

Глутаматдегидрогеназа (ГДГ, L-глутамат: НАД(Ф)-оксидоредуктаза, КФ 1.4.1.3), катализируя обратимое дезаминирование глутамата, является олигомером и может состоять из субъединиц различного типа: α, β и, как показано для Arabidopsis thaliana, γ [4]. Известно, что преобладание α-субъединиц в структуре обеспечивает более высокое сродство к глутамату, в то время как наличие β-субъединиц повышает сродство к 2-оксоглутарату [4]. In vivo отдельные субъединицы связываются в различных соотношениях с образованием гомо- и гетерогексамеров ~ 270 кДа [5‒8]. В животных клетках ГДГ присутствует преимущественно в виде димеров и тетрамеров, в то время как у ряда бактерий и растений обнаруживаются преимущественно гексамерные формы. Гексамеры глутаматдегидрогеназы имеют существенное сходство в структуре, независимо от коферментной специфичности [9]. ГДГ растений является гетерогенным ферментом, и степень его гетерогенности зависит от вида растений и локализации [10]. Существование тканеспецифичных изоформ ГДГ может быть связано с клеточной дифференцировкой, субклеточным компартментом или физиологической функцией. Предполагается, что разные изоформы ГДГ могут быть вовлечены в анаболические и катаболические процессы [11].

У растений и микроорганизмов физиологическая роль ГДГ включает ассимиляцию азота, катаболизм глутамата, а также поддержание осмотического баланса и устойчивость к высоким температурам. Также данный фермент является промежуточным звеном между циклом трикарбоновых кислот (ЦТК) и шунтом γ-аминомасляной кислоты (ГАМК-шунтом). Известно, что продукт реакции, катализируемой ГДГ – 2-оксоглутарат – может быть введен в цикл лимонной кислоты и использован для энергизации клетки [12].

У кукурузы глутаматдегидрогеназа кодируется двумя генами [13]. Ген GDH1 (LOC542220), кодирующий β-субъединицу глутаматдегидрогеназы кукурузы, локализован в первой хромосоме [14]. Ген GDH2 (LOC100193614) находится в 10 хромосоме и кодирует α-субъединицу ГДГ кукурузы.

Имеются доказательства того, что роль ГДГ в прямой ассимиляции ${\text{NH}}_{4}^{ + }$ незначительна (5%) по сравнению с вкладом глутаминсинтетазы и глутаминоксоглутаратаминотрансферазы (цикл ГС-ГОГАТ) (95%) [15]. Однако ГДГ обеспечивает альтернативный путь включения аммиака в органические соединения только во время определенных экологических стимулов, когда требуется ремобилизация питательных веществ [16]. Основная роль ГДГ заключается в подпитке цикла трикарбоновых кислот 2ОГ, когда углерод становится ограничивающим фактором [7]. Таким образом, вместе с глутамин-2-оксоглутаратаминотрансферазой (ГОГАТ), глутаматдегидрогеназа участвует в образовании и гомеостазе глутамата [17]. По этой причине фермент играет важную роль в точке разветвления путей ассимиляции углерода и азота [3].

Дефицит кислорода приводит к ингибированию ЦТК, что связано, в первую очередь, с тем, что электрон-транспортная цепь (ЭТЦ) митохондрий в отсутствии основного акцептора электронов – кислорода, не способна нормально функционировать. Во время гипоксии, когда цепь переноса электронов не окисляет восстанавливающие эквиваленты, некоторые сегменты ЦТК все же остаются работоспособными и катализируют реакции в противоположных направлениях. Это служит для использования высокоэнергетических фосфатов посредством фосфорилирования на уровне матричного субстрата в отсутствие окислительного фосфорилирования [18].

Ранее нами было показано, что 2-оксоглутаратдегидрогеназный комплекс (2ОГДК), который катализирует лимитирующую и самую высокоэнергичную стадию ЦТК, в условиях дефицита кислорода инактивируется [19]. Однако непонятным остается механизм, который обеспечивает адаптацию клеточного метаболизма в этих условиях. Регулирующая роль в данном процессе может принадлежать глутаматдегидрогеназе, которая за счет изменения субъединичного состава контролирует поток 2-оксоглутарата между азотным и углеродным метаболизмом: увеличение α-субъединиц в структуре фермента способно приводить к смещению равновесия реакции в сторону дезаминирования глутамата, а преобладание β-субъединиц способствует протеканию реакции аминирования 2-оксоглутарата [4].

Существуют убедительные доказательства того, что изменение уровня γ-аминомасляной кислоты (ГАМК) регулирует функционирование ЦТК, который обеспечивает энергизацию клетки для поддержания энергозатратной реакции адаптации к абиотическим стрессам, в том числе и к гипоксии [20]. В связи с этим целью работы являлось исследование роли метилирования промоторов генов GDH1 и GDH2 глутаматдегидрогеназы в регуляции их экспрессии в листьях кукурузы (Zea mays L) при гипоксии, а также выявление механизмов трансформации метаболических потоков при адаптивной реакции клеточного метаболизма в условиях дефицита кислорода.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В качестве объекта исследований использовались 10–12-дневные проростки кукурузы (Zea mays L.) сорта Воронежская-76, выращивание которых осуществляли гидропонно при 10-часовом световом дне с интенсивностью света 25 Вт/м² (климатическая камера “LabTech”, Корея) и температурой окружающей среды 25°С.

Растения предварительно помещали в вакуум-эксикаторы на 24 ч без доступа света, после чего в эксикатор с опытной группой растений в течение суток подавался азот из баллона 10150У (ГОСТ 94973, Россия, УЗГПО) со средней скоростью 18 см³/сек. Контрольная группа находилась в среде, куда непрерывно осуществлялся приток кислорода воздуха.

Согласно сертификату соответствия содержание кислорода в баллоне с азотом составляло ≤ 0.5%. Температура окружающей среды во время эксперимента поддерживалась на уровне 25°С. Первые образцы (“нулевой контроль”) для исследования изымали до начала эксперимента.

Экстракция фракции митохондрий из листьев кукурузы осуществлялась путем гомогенизации образцов в ледяной среде выделения, включающей: 0.15 М Tris-HCl буфер (pH 7.4), 0.4 М сахароза, 2.5 мМ динатриевая соль ЭДТА, 1 мМ КСl, 4 мМ МgСl₂, 0.05% Triton Х-100 в соотношении 1 : 10. Гомогенат фильтровали и осаждали клеточные стенки 3 мин при 3000 g (Еppendorf Centrifuge 5804 R). Надосадочную жидкость центрифугировали при 12 000 g в течение 20 мин при температуре +4°С. Супернатант удаляли, а осадок растворяли в 2 мл среды ресуспендирования, включавшей 0.15 М Tris-HCl буфер (pH 7.4) и 2.5 мМ динатриевую соль ЭДТА.

Активность ГДГ по реакции аминирования определяли спектрофотометрически при 340 нм в среде, содержащей 13 мМ 2-оксоглутарата, 0.25 мМ НАДН, 1 мМ CaCl₂, 50 мМ (NH₄)₂SO₄, 100 мМ Tris-HCl буфер рН 8.0 [21]. За единицу ферментативной активности глутаматдегидрогеназы принимали такое количество фермента, которое катализировало превращение 1 мкмоль 2-оксоглутарата за 1 мин при 25°С при оптимальном значении pH (8.0). Значения общей ферментативной активности рассчитывали, как отношение количества ферментативных единиц на г/сырой массы листьев кукурузы.

Суммарная РНК и ДНК выделялись методом фенол-хлороформной экстракции [23, 24]. Выделение ДНК осуществлялось путем лизиса растительной ткани в буфере, содержащем: 2% цетримониум бромид, 1.4 М NаСl, 20 мМ ЭДТА, 0.1 М Tрис-HCl (pH 8.0) с последующим центрифугированием (3 мин при 5000 об/мин). К надосадку добавляли смесь фенола, хлороформа и изоамилового спирта (25 : 24 : 1) и центрифугировали при 13 000 об/мин в течение 20 мин. Нуклеиновые кислоты из водной фазы осаждали 3 М ацетатом натрия и тремя объемами 96% этанола с последующей инкубацией при ‒20°С. Полученный осадок промывали 75% этанолом, высушивали и растворяли в воде, свободной от ДНКаз.

Выделение РНК проводили путем гомогенизации растительной ткани в соотношении 1 : 10 с буфером выделения (4 М гуанидин тиоционат, 25 мМ цитрат натрия (pH 7.0), 0.5% (вес/объем) N-лауросилсаркозин и 0.1 М β-меркаптоэтанол). К надосадку, полученному в ходе 3 мин центрифугирования (5000 об/мин.), добавляли смесь фенола : хлороформа (49 : 1) и центрифугировали при 13 000 об/мин 20 мин. Осаждение нуклеиновых кислот из водной фазы проводили путем добавления 2 М ацетата натрия (pH 4.0) и 1 мл изопропанола. Осажденную РНК промывали в 80% этаноле, высушивали и растворяли в воде, свободной от ДНКаз. Добавление равного объема 12 М хлорида лития и последующая инкубация при ‒20°С обеспечивали очистку РНК от ДНК. Все манипуляции проводили при +4°С, если не указано иное.

ПЦР в реальном времени проводили на приборе LightCycler96 (“Roche”, Швеция) с использованием в качестве интеркалирующего красителя SYBR Green I. В качестве матрицы использовали кДНК, полученную в ходе реакции обратной транскрипции с набором ММLV-RT Kit (ЗАО “Евроген”, Россия) в соответствии с протоколом производителя. Количество РНК-матрицы составляло 2 мкг. Специфические праймеры к генам GDH1 и GDH2 представлены в таблице 1. Количественный контроль матрицы осуществляли путем параллельной амплификации образцов с праймерами к гену ЕF-1α. В качестве отрицательного контроля использовали суммарную РНК без этапа обратной транскрипции. Относительный уровень экспрессии исследуемых генов определяли с применением 2^–ΔΔCt-метода.

Анализ промоторов исследуемых генов на наличие CpG-островков и подбор праймеров для метил-специфичной ПЦР (табл. 2) осуществляли с помощью онлайн-сервиса MethPrimer (www.urogene.org/cgi-bin/methprimer/methprimer.cgi).

Степень метилирования отдельных СpG-динуклеотидов определяли путем проведения метил-специфичной ПЦР (МС-ПЦР) с последующей детекцией полученных ампликонов методом электрофореза в 2% агарозном геле (Helicon, Россия) с добавлением бромистого этидия (Sigma Aldrich, США). В качестве матрицы для проведения МС-ПЦР использовали ДНК, подвергнутую модификации бисульфитом натрия.

Конверсия ДНК проводилась в три этапа с использованием бисульфита натрия в качестве основного модифицирующего агента [22]. На первом этапе, предварительно денатурированная ДНК (инкубация при 55°С в присутствии 0.3 М NaOH) модифицировалась путем добавления смеси 4 М раствора NaHSO₃ и 0.2 М гидрохинона с последующей инкубацией в темноте при 55°С. На втором этапе происходила очистка модифицированной ДНК от бисульфита натрия с использованием набора DNeasy Plant Pro Kit (Qiagen, Германия). Десульфонирование осуществляли путем инкубации с 0.3 М NaOH при 37°С. Для осаждения ДНК из раствора добавляли гликоген в концентрации 20 мг/мл, 10 М ацетата аммония и 3 объема 80% этанола. Отмывка нуклеиновой кислоты происходила с применением 80% этанола, после чего ДНК высушивали и растворяли в воде, свободной от ДНКаз.

Статистический анализ. Опыт проводился в 3‒4-кратной повторности, аналитические определения активности глутаматдегидрогеназы для каждой пробы осуществляли в трех повторностях. Метил-специфичную ПРЦ с каждым из образцов проводили в трех аналитических повторностях. Постановку ПЦР в реальном времени проводили трижды. Количественные показатели оценивались на предмет соответствия нормальному распределению с помощью критерия Шапиро-Уилка. Результаты на графиках выражали как среднее значение. Бары на графиках представляют собой стандартную ошибку среднего (SEM). Различия анализировали на статистическую значимость с использованием критерия Стьюдента [25, 26]. Дополнительно применялся однофакторный дисперсионный анализ ANOVA (влияние фактора достоверно при P < 0.05). Статистический анализ полученных данных проводился с использованием программы STATISTICA 12.0.

РЕЗУЛЬТАТЫ

В рамках проведенного исследования было изучено влияние гипоксии на общую ферментативную активность ГДГ, что позволило обнаружить активацию данной ферментной системы (рис. 1). В первый час гипоксического воздействия в листьях кукурузы наблюдали существенное увеличение (более чем в 1.5 раза) активности ГДГ по реакции аминирования, которое сохранялось на протяжении 12 ч. Максимум активности был зафиксирован на 12 ч инкубации. Спустя сутки эксперимента значения общей ферментативной активности ГДГ снижались практически до уровня контрольной группы.

Рис. 1.

Изменение общей ферментативной активности ГДГ в условиях действия гипоксии. Сплошная черная линия ‒ опытная группа растений, инкубация которых осуществлялась в гипоксической среде с азотом; пунктирная серая линия – контрольная группа растений, инкубация которой осуществлялась в нормоксических условиях. Различия между контролем (О₂) и опытом (N₂) статистически значимы (P < 0.05). Представлены данные не менее трех независимых экспериментов.

Для установления механизма, регулирующего активность ГДГ в данных условиях, было проведено исследование транскрипционной активности генов, которые в геноме кукурузы кодируют α и β-субъединицы глутаматдегидрогеназы.

Было установлено, что транскрипция гена GDH1 при инкубации растений в среде с низким содержанием кислорода первоначально снижается в 2 раза, что, однако, к третьему часу сменяется активацией работы данного гена (рис. 2). К 6 ч эксперимента относительный уровень транскриптов GDH1 достигает своего максимума, превышая контрольные значения более чем в 1.5 раза. В последующие часы концентрация мРНК данного гена постепенно снижается. Следует отметить, что в контрольной группе растений относительный уровень транскриптов гена GDH1 практически не изменялся (изменения в пределах колебаний) на протяжении всего времени эксперимента.

Рис. 2.

Относительный уровень транскриптов гена GDH1 в условиях действия гипоксии. Черные столбцы ‒ опытная группа растений, инкубация которых осуществлялась в гипоксической среде с азотом; серые столбцы – контрольная группа растений, инкубация которой осуществлялась в нормоксических условиях. Различия между контролем (О₂) и опытом (N₂) статистически значимы. Представлены результаты четырех независимых экспериментов. Данные достоверно различаются: * ‒ P < 0.05 по сравнению с контролем соответствующего часа эксперимента; ** ‒ P < 0.03 по сравнению с результатами, полученными до начала эксперимента (“нулевой контроль”).

Проведенное исследование динамики относительного уровня транскриптов гена, кодирующего α-субъединицу ГДГ – GDH2 показало, что уже в первые часы инкубации растений в среде, с низкой концентрацией кислорода происходила инактивация экспрессии гена (рис. 3). Интересно отметить, что на 6 ч гипоксического воздействия зарегистрировано минимальное значение уровня мРНК данного гена, что в некотором смысле коррелирует с максимумом транскрипционной активности гена GDH1. На протяжении всего времени эксперимента содержание транскриптов гена GDH2, кодирующего α-субъединицу ГДГ остается на достаточно низком уровне, более чем в 9 раз ниже значений, отмеченных в контрольной группе растений.

Рис. 3.

Динамика относительного уровня транскриптов GDH2 при гипоксии. Черные столбцы ‒ опытная группа растений, инкубация которых осуществлялась в гипоксической среде с азотом; серые столбцы – контрольная группа растений, инкубация которой осуществлялась в нормоксических условиях. Различия между контролем (О₂) и опытом (N₂) статистически значимы. Представлены результаты четырех независимых экспериментов. Данные достоверно различаются: * ‒ P < 0.05 по сравнению с контролем соответствующего часа эксперимента; ** ‒ P < 0.03 по сравнению с результатами, полученными до начала эксперимента (“нулевой контроль”).

В связи с тем, что активность некоторых ферментов регулируется на биохимическом, молекулярно-генетическом и эпигенетическом уровнях, [27‒29] было проведено исследование роли метилирования в изменении каталитической активности глутаматдегидрогеназы при адаптивной реакции растительной клетки к гипоксии в листьях кукурузы. Предварительный анализ нуклеотидных последовательностей генов семейства GDH на наличие CpG-островков показал, что промотор гена GDH1 не содержит ни одного CpG-островка, в то время как в составе промоторной области гена GDH2 обнаружено два островка размером 404 и 383 п.н. (рис. 4). Анализ промоторной области гена GDH1 на наличие сайтов СpNpG и CpNpN, по которым в растительных организмах также осуществляется метилирование цитозинов [30], позволил установить, что исследуемый участок промотора размером 1000 п.н. содержит около 24.9% CpNpN-сайтов (от общего числа исследуемых нуклеотидов) и 13.8% приходится на сайты СpNpG.

Рис. 4.

Анализ промотора гена GDH1 (А) и GDH2 (Б) на наличие CpG-островков. Голубым цветом отмечены CpG – островки. Красными вертикальными полосками указаны положения СрG-динуклеотидов.

Полученные в результате проведенной метил-специфичной ПЦР данные позволили выявить корреляцию между динамикой транскрипционной активности генов семейства GDH и модуляциями в метильном статусе исследуемых СpG-динуклеотидов.

Установлено, что инкубация растений кукурузы в среде с низким содержанием кислорода приводит к снижению количества метилированных цитозинов в промоторе гена GDH1, что сопровождается увеличением его транскрипционной активности – до начала эксперимента 50% от количества всех проанализированных СрG-динуклеотидов обладали метильной группой, однако, по истечении третьего часа гипоксического воздействия 25% исследуемых цитозинов находились уже в деметилированном состоянии (рис. 5). У растений, находившихся в нормоксических условиях, степень метилирования составляла 50% на протяжении всего времени эксперимента (рис. 6).

Рис. 5.

Динамика изменения относительного уровня транскриптов гена GDH1 от степени метилирования (5mC) его промотора в условиях дефицита кислорода (N₂). Представлены результаты четырех независимых экспериментов. Данные достоверно различаются: * ‒ P < 0.05 по сравнению с контролем; # ‒ P < 0.03 по сравнению с контролем.

Рис. 6.

Динамика изменения относительного уровня транскриптов гена GDH1 от степени метилирования его промотора в нормоксических условиях. Представлены результаты четырех независимых экспериментов. Данные достоверно различаются: * ‒ P < 0.05 по сравнению с результатами, полученными до начала эксперимента (“нулевой контроль”); # ‒ P < 0.03 по сравнению с результатами, полученными до начала эксперимента (“нулевой контроль”).

Инактивация гена GDH2 с первого часа нахождения в условиях дефицита кислорода была обусловлена метилированием CpG-динуклеотидов в составе его промотора до 75% (рис. 7). Увеличение доли метилированных цитозинов у контрольной группы растений не наблюдалось ‒ степень метилирования промотора в условиях нормоксии составляла 25% (рис. 8).

Рис. 7.

Динамика изменения относительного уровня транскриптов гена GDH2 от степени метилирования его промотора в условиях дефицита кислорода. Представлены результаты четырех независимых экспериментов. Данные достоверно различаются: * ‒ P < 0.05 по сравнению с контролем; # ‒ P < 0.03 по сравнению с контролем.

Рис. 8.

Динамика изменения относительного уровня транскриптов гена GDH2 от степени метилирования его промотора в нормоксичеких условиях. Представлены результаты четырех независимых экспериментов. Данные достоверно различаются, * ‒ P < 0.05 по сравнению с “нулевым контролем”; # ‒ P < 0.03 по сравнению с “нулевым контролем”.

Таким образом, разнонаправленные модуляции в метильном статусе исследуемых CpG-динуклеотидов промоторов генов GDH1 и GDH2 в условиях действия гипоксического стресса, сопряженные с изменением их транскрипционной активности, указывают на существенную роль эпигенетического механизма в регуляции работы глутаматдегидрогеназной активности.

ОБСУЖДЕНИЕ

Известно, что снижение концентрации кислорода запускает механизм гипоксического ответа, который обеспечивает ингибирование 2-оксоглутаратдегидрогеназного комплекса [19]. 2ОГ, который в виду инактивации 2ОГДК не способен метаболизироваться до сукцинил-СоА, направляется через альтернативный путь для компенсации или же нивелирования негативного влияния стрессора [20]. В работе показано, что увеличение активности глутаматдегидрогеназы в первые часы гипоксического воздействия связано с интенсификацией синтеза глутамата, который, являясь первичной аминокислотой, обеспечивает поставку аминогрупп для азотного метаболизма и связь между ЦТК и ГАМК-шунтом. Выявленная индукция гена GDH1 способствует синтезу β-субъединицы, что обеспечивает смещение равновесия реакции в сторону аминирования 2-оксоглутарата. Образовавшийся глутамат может служить субстратом для ГАМК-шунта, который, как известно, активируется в ответ на действие некоторых стрессоров [31]. Это предположение подтверждает тот факт, что при гипоксии транскрипция гена GDH2, кодирующего α-субъединицу в геноме Zea mays, практически полностью инактивируется, тем самым “перекрывая” поток 2ОГ в сторону ЦТК [32]. Как уже упоминалось, важную роль в адаптации клетки к гипоксии играет азотный метаболизм. Ранее было высказано предположение, что адаптивный ответ метаболизма аминокислот на стресс, вызванный дефицитом кислорода, состоит из согласованной модуляции потока органического азота, проходящего через глутамат и аланин [33]. Следовательно, пути потребления АТФ, которые участвуют в биосинтезе глутамина и аспарагина, подавляются в пользу аланина и ГАМК, которые обычно накапливаются, представляя основной пул органического азота [34]. Модуляции аминокислотных путей являются результатом регуляции некоторых ферментов, в том числе и участников ГАМК-шунта. Шунт ГАМК вносит свой вклад в клеточный pH-статус, поскольку декарбоксилирование глутамата является реакцией потребления протонов, которая увеличивает pH [34].

ГДГ играет в адаптивном процессе к действию гипоксии значительную роль. Механизм регуляции работы данного фермента требует отдельного изучения, так как установленный характер функционирования фермента нуждается в “тонкой настройке” для быстрого переключения из ингибированного состояния в активное во время перехода от низкого кислородного стресса к периоду постстрессорного восстановления.

Известно, что активность ферментных систем может регулироваться на биохимическом, молекулярно-генетическом и эпигенетическом уровнях. Однако особая роль принадлежит эпигенетическим механизмам регуляции работы генома, что необычайно важно в контексте исследования адаптивной реакции к действию абиотических стрессов. Многие исследования показали, что эпигенетическая изменчивость может быть важным механизмом адаптации к разным средам обитания [27]. Более того, имеется множество данных, свидетельствующих об изменении степени метилирования как всего генома, так и его отдельных участков, индуцированных стрессовым воздействием [27]. Ряд ферментов дыхательного метаболизма подвержен регуляции посредством процессов метилирования/деметилирования СpG-динуклеотидов в составе промоторов соответствующих генов [28, 29].

Анализ нуклеотидных последовательностей промоторных областей генов GDH1 и GDH2 выявил в их структуре различия. Так, промотор гена GDH1 не содержит CpG-островков, однако в его составе было обнаружено порядка 38% сайтов CpNpG и CpNpN, по которым возможно присоединение метильных групп к цитозину у растительных организмов, наряду с CpG-динуклеотидами. Главное отличие структуры промотора гена GDH2 состоит в наличии двух CpG-островков размером 404 и 383 п.н. Ввиду того, что в промоторе гена присутствуют СрG-островки, можно предположить возможную регуляцию работы данного гена посредством метилирования. Однако отсутствие CpG-островков не говорит о невозможности регуляции работы гена посредством изменения метильного статуса [30]. Дело в том, что у растительных организмов, в отличие от животных, метилирование цитозина возможно не только по сайтам CpG, но также по сайтам СpNpG и CpNpN, где N – A, T или C [30]. Несмотря на то, что CpG-островки обнаружены лишь в промоторе одного гена, была выявлена зависимость между степенью метилирования отдельных CpG-нуклеотидов и изменением экспрессии обоих исследуемых генов.

Показано, что при понижении концентрации кислорода в среде в листьях кукурузы происходят существенные изменения в статусе метилирования CpG-динуклеотидов, в промоторах генов субъединиц глутаматдегидрогеназы. Снижение количества метилированных CG-динуклеотидов промотора гена GDH1 приводило к росту его транскрипционной активности. В то же время, увеличение доли метилированных цитозинов инактивировало ген GDH2. Характер распределения динамики относительного уровня транскриптов генов, кодирующих α и β-субъединицы глутаматдегидрогеназы указывает на эпигенетический характер регуляции функционирования данного фермента в гипоксических условиях, что лишь в очередной раз подтверждает ключевую роль данного фермента в процессах адаптации клеточного метаболизма к изменяющимся условиям среды.

Таким образом, выявлена роль глутаматдегидрогеназы в механизме переключения метаболического пути 2-оксоглутарата с цикла трикарбоновых кислот, обеспечивающего энергизацию клетки, на альтернативный путь – шунт γ-аминомасляной кислоты. Вызванное понижением уровня кислорода в среде ингибирование 2-оксоглутаратдегидрогеназного комплекса, а также последующих ферментов, вероятно, запускает механизм индукции аминирующей активности глутаматдегидрогеназы. Существенное увеличение интенсивности функционирования ГДГ в первые 12 ч инкубации листьев кукурузы в гипоксических условиях обеспечивает перераспределение потоков углерода между циклом Кребса и ГАМК-шунтом. Механизм адаптивной реакции вызван дифференциальной экспрессией генов GDH1 и GDH2, изменяющей соотношение β- и α-субъединиц в молекуле фермента. Это, в свою очередь приводит к перераспределению потока 2-оксоглутарата между углеродным и азотным метаболизмом. При этом регуляция транскрипционной активности генов в условиях гипоксии осуществляется эпигенетически, за счет модуляций степени метилирования CpG-динуклеотидов промоторных областей генов GDH1 и GDH2.

Настоящая статья не содержит каких-либо исследований с участием людей и животных в качестве объектов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Работа выполнена при поддержке Министерства науки и высшего образования Российской Федерации в рамках государственного задания ВУЗам в сфере научной деятельности на 2023–2025 г., проект № FZGU-2023-0009.