1. На главную
  2. Электронные версии
  3. Физиология растений
  4. T. 70, № 2, 2023

Физиология растений, 2023, T. 70, № 2, стр. 181-191

Сравнительный анализ состава стеринов эмбриогенных и неэмбриогенных клеточных линий Larix sibirica Ledeb

Н. В. Семёнова a, *, В. Н. Шмаков a, Ю. М. Константинов a, Л. В. Дударева a

a Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Сибирский институт физиологии и биохимии растений Сибирского отделения Российской академии наук
Иркутск, Россия

* E-mail: tashasemyonova@mail.ru

Поступила в редакцию 09.09.2022
После доработки 09.09.2022
Принята к публикации 09.09.2022

Полный текст (PDF)

Аннотация

C помощью метода газовой хромато-масс-спектрометрии проведен сравнительный анализ качественного и количественного составов стериновых компонентов в тканях клеточных линий лиственницы сибирской (Larix sibirica Ledeb.) с разным эмбриогенным потенциалом. Обнаружены существенные межлинейные различия в качественном и количественном содержаниях фракций свободных стеринов и эфиров стеринов. Наряду со стериновыми компонентами обнаружен сквален – тритерпен, являющийся промежуточным соединением в биосинтезе стеринов. Доминирующими свободными стеринами эмбриогенных клеточных линий были β-ситостерин, кампестерин, изофукостерин и стигмастерин, а неэмбриогенных линий – β-ситостерин, кампестерин и стигмастерин. При этом содержание кампестерина в эмбриогенных линиях было в 1.3−1.9 раза выше, чем в неэмбриогенных. Поскольку кампестерин является предшественником брассиностероидов, логично предположить, что его высокое содержание обусловлено эмбриогенным состоянием клеточных линий. Изофукостерин в заметных количествах найден только в эмбриогенных линиях. Во фракции эфиров стеринов неэмбриогенных линий обнаружено бόльшее разнообразие компонентов по сравнению с эмбриогенными линиями. Во всех клеточных линиях среди идентифицированных стериновых эфиров преобладали соединения без двойных связей, несущие в качестве структурного фрагмента стерановое ядро (кор) – циклопентанопергидрофенантрен: их содержание варьировало от 52 до 71% от суммы эфиров стеринов. Обнаруженные различия в составе стеринов и эфиров стеринов у клеточных линий L. sibirica с разным эмбриогенным потенциалом свидетельствуют о значительных перестройках в метаболизме стеринов в ходе эмбриогенеза, которые, могут быть связаны с их участием в этом процессе на стадии формирования зародышей.

Ключевые слова: Larix sibirica, клеточные линии, соматический эмбриогенез, стерины, эфиры стеринов

ВВЕДЕНИЕ

Соматический эмбриогенез является одним из перспективных направлений в биотехнологии микроклонального размножения растений в культуре in vitro. При таком способе размножения становится возможным массовое воспроизводство растительного материала идентичного материнскому генотипу [1]. Из-за недостатка сведений о молекулярных механизмах индукции соматического эмбриогенеза, особенно для древесных видов, в частности, хвойных, получение и развитие соматических зародышей до настоящего времени остается трудноосуществимой задачей [2]. Изучение последовательности событий индукции соматического эмбриогенеза и этапов его последующего развития имеет достаточно длительную историю [3], однако роль липидных компонентов в этих процессах в культуре in vitro хвойных видов все еще остается малоизученной. На сегодняшний день этой проблеме посвящены единичные исследования [4–7]. Например, установлено, что качественный и количественный составы некоторых липидов у эмбриогенных и неэмбриогенных клеточных линий Larix sibirica существенно различаются. Так, для эмбриогенных линий характерно повышенное содержание олеиновой кислоты [5], глицеридов [6], фосфатидилхолинов, фосфатидилэтаноламинов и фосфатидилинозитов [7], по сравнению с неэмбриогенными. Однако полной ясности в вопросах липидного обмена в культуре растительных тканей in vitro, в том числе, сведений об участии в процессах эмбриогенеза отдельных групп липидов, в частности, эфиров стеринов, а также свободных стеринов пока нет.

В настоящее время известно более 200 видов растительных стеринов [8]. В растениях они присутствуют как в свободном состоянии (свободные стерины), так и в виде производных, представляющих собой эфиры жирных кислот или гликозиды (стерилгликозиды и ацилстерилгликозиды) [8]. Стерины и их производные задействованы во многих клеточных процессах. Например, стерины играют важную роль в регуляции текучести мембраны и ее проницаемости [9]. Для плазматической мембраны характерны высокая вариабельность стеринового состава, а также различия в соотношении стерины/мембранные липиды, в зависимости от вида растения, стадии его развития, органа и ткани [10]. Функции отдельных стеринов в составе мембран также различны. Известно, что β‑ситостерин и кампестерин являются наиболее эффективными соединениями для ограничения подвижности фосфолипидных жирных ацильных цепей, по сравнению со стигмастерином. Кроме того, β-ситостерин и кампестерин, в отличие от стигмастерина, снижают проницаемость мембран [8, 11]. Стигмастерин, являющийся “стрессовым” стерином, как предполагается, влияет на распределение других мембранных липидов, метаболические процессы в мембранах, а также на сигнальные пути, изменяющие экспрессию “стрессовых” генов [12]. Поддержание определенного состава стеринов в клеточных мембранах необходимо для оптимальной активности ферментов, транспорта ионов и метаболитов через каналы, белок-белковых и белок-липидных взаимодействий, а также трансдукции сигналов [8, 13]. Важно отметить, что стерины являются предшественниками брассиностероидов (БС) – гормонов, регулирующих рост и развитие растений [9, 14]. Известно, что БС принимают активное участие в элонгации клеток растений и морфогенезе органов, клеточном делении, модуляции гормональных ответов, а также в ответной реакции клеток на стрессовые воздействия [15, 16]. Кроме того, БС регулируют множество физиологических реакций, необходимых как для вегетативной, так и для репродуктивной стадий развития растений [15, 17, 18].

Растительные стерины играют важную роль в ходе эмбриональной и постэмбриональной стадий развития, а также во время цветения [19, 20]. Это касается как целых растений, так и культуры растительных тканей. В ряде работ были обнаружены изменения состава и содержания стеринов в процессе соматического эмбриогенеза растений in vitro. Так, установлено, что содержание стеринов в культуре льна посевного (Linum usitatissimum L.) различалось в зависимости от степени дифференциации клеток [21]. Индукция соматического эмбриогенеза и органогенеза побегов льна была связана с увеличением общего количества стеринов в компетентных к эмбриогенезу каллусах и повышенным соотношением стигмастерина к β-ситостерину в эмбрионах и побегах. Напротив, в неорганогенных каллусах величина соотношения стигмастерин/β-ситостерин снижалась во время фазы экспоненциального роста из-за значительного увеличения содержания β-ситостерина. В работе [22] показано, что результатом дифференциации клеток Brassica napus L. в культуре in vitro было изменение состава свободных стеринов в регенерирующих каллусах, при этом содержание стигмастерина увеличивалось, а кампестерина уменьшалось.

Таким образом, анализ литературы свидетельствует о важной роли стеринов в жизнедеятельности растений и их адаптации к условиям внешней среды. Стерины являются структурными компонентами клеточных мембран, принимают активное участие в регуляции процессов онтогенеза и стрессоустойчивости растений. Многообразие стеринового состава позволяет растениям на клеточном уровне адаптироваться к изменяющимся условиям окружающей среды. Очевидно, что в значительной мере аналогичные клеточные механизмы реализуются и в случае адаптации растительных клеток in vitro. При этом необходимо принимать во внимание, что стресс может быть одним из индукторов процесса эмбриогенеза. Следовательно, наряду с фитогормонами, фенольными и другими соединениями, стерины играют важную роль в процессах роста и развития растительных клеток как in vivo, так и in vitro. Поэтому изучение особенностей состава стеринов и их эфиров, как возможных маркеров процесса развития в клеточных линиях с разным эмбриогенным потенциалом in vitro, позволит прояснить роль этих соединений в процессе эмбриогенеза, что важно как для фундаментальных, так и для прикладных исследований.

Цель работы − провести сравнительный анализ качественного и количественного составов свободных стеринов и их эфиров в эмбриогенных и неэмбриогенных клеточных линиях лиственницы сибирской на ранней стадии развития.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Растительный материал. В качестве растительного материала использовали эмбриогенные и неэмбриогенные клеточные линии лиственницы сибирской (Larix sibirica Ledeb.), полученные И.Н. Третьяковой с соавт. [1, 2] в Институте леса им. В.Н. Сукачева СО РАН (г. Красноярск). Клеточные линии L. sibirica поддерживали в течение 6 лет на агаризованной питательной среде АИ, разработанной И.Н. Третьяковой [2]. В качестве регуляторов роста использовали 2,4-Д (2 мг/л) и БАП (0.5 мг/л). Для анализа качественного и количественного составов стеринов каллусов лиственницы сибирской использовали эмбриогенные долгоживущие клеточные линии Кл2, Кл4, Кл6, Кл10 на стадии пролиферации эмбрионально-суспензорной массы (ЭСМ) и неэмбриогенные клеточные линии Кл23 и Кл31. Клеточные линии имели видимые внешние различия: эмбриогенные – кремового цвета, рыхлые, со сформированными незрелыми соматическими зародышами; неэмбриогенные – кремового цвета, плотные, глобулярные, без зародышей. Каждая эмбриогенная клеточная линия представляла собой ЭСМ, состоящую из глобулярных зародышей (эмбрионов) и суспензоров. В ЭСМ образуются полиэмбриональные комплексы, состоящие из нескольких эмбрионов, других клеток в ней не наблюдается [2]. Для эмбриогенных клеточных линий число зародышей составляло от 2 (Кл2, Кл6) до 11 (Кл10) тыс. шт./г сырой массы ЭСМ [1, 2]. Эмбриогенные клеточные линии L. sibirica со сформированными незрелыми соматическими зародышами в дальнейшем могут формировать растения-регенеранты, при этом линия Кл4 была наиболее перспективной в этом отношении, в то время как неэмбриогенные клеточные линии не формируют соматические зародыши и, соответственно, не обладают способностью к регенерации [1, 2].

Оводненность тканей клеточных линий составляла 95–97%. Пересадку на свежую питательную среду проводили каждые 28 дней. Материал для исследования во всех случаях брали на 28 сутки выращивания каллусных культур (фаза роста – стадии замедления роста).

Выделение липидной фракции. Для выделения липидной фракции навеску растительного материала (0.5 г) фиксировали в жидком азоте и растирали в ступке до получения гомогенной массы. Затем добавляли 10 мл смеси хлороформ : метанол (2 : 1 v/v), используя хлороформ, стабилизированный 0.005% массовой долей амилена, а также ионол в качестве антиоксиданта (из расчета 1.25 мг на 100 мл указанной смеси растворителей). Полученную суспензию тщательно перемешивали и оставляли на 30 мин для извлечения липидов растворителем. Полученный раствор отделяли от осадка фильтрованием. Ступку и фильтр с остатками растительного материала трижды промывали используемой смесью растворителей и объединяли с основным объемом раствора. В делительную воронку с объединенным раствором добавляли воду и оставляли до расслаивания водной и органической фаз. После органическую (нижнюю, хлороформную) фазу, содержащую сумму липидных компонентов, отделяли от водной фазы. Хлороформ из полученного липидного экстракта удаляли при пониженном давлении с помощью роторного испарителя RVO-64 (Микротехна, Чехия).

Выделение стериновых компонентов. Обнаружение и выделение стериновых компонентов (свободных стеринов и стериновых эфиров) осуществляли с помощью метода ТСХ. Для этого полученную фракцию, содержащую сумму липидов, повторно растворяли в 200 мкл хлороформа и наносили тонкой полосой на высокоэффективную пластинку Sorbfil ПТСХ-АФ-В (Россия) (сорбент силикагель СТХ-1ВЭ, зернение 8−12 мкм, толщина слоя 80−100 мкм). Операцию нанесения пробы повторяли дважды. Пластину помещали в хроматографическую камеру и осуществляли хроматографирование элюентом следующего состава: гексан : диэтиловый эфир : уксусная кислота (80 : 20 : 1 v/v/v). По окончании хроматографирования (когда элюент доходил до края пластины), пластину вынимали из камеры и высушивали. Для обнаружения стериновых компонентов край пластины (0.5 см) обрабатывали 10% раствором серной кислоты в этаноле, а затем нагревали на электроплитке до 110°С. Зоны обнаружения стериновых компонентов проявлялись на пластинке розово-голубыми пятнами. Рассчитанные значения Rf для свободных стеринов (Rf = 0.19) и стериновых эфиров (Rf = 0.87−0.92) совпадали со значениями Rf для стандартных образцов (холестерин, стигмастерин, кампестерин (Sigma, США)), β-ситостерин (European pharmacopoeia reference standard, Франция) и табличными значениями. После хроматографирования с высушенной необработанной пластины шпателем удаляли сорбент в зонах обнаружения стериновых компонентов. Сорбент с хроматографической пластины количественно переносили в центрифужные пробирки (10 мл) и добавляли в них по 1.5 мл хлороформа. Извлечение стериновых компонентов с адсорбента в среду хлороформа осуществляли с помощью облучения ультразвуком (частота 35 кГц, мощность 80 Вт, продолжительность 15 мин), используя ультразвуковую ванну (Bandelin Sonorex, Германия). Суспензию адсорбента в хлороформе центрифугировали (5 мин) при 3000 об/мин. После центрифугирования надосадочный раствор переносили в стеклянные флаконы (2 мл). Из полученных растворов упаривали (досуха) хлороформ в инертной атмосфере (в токе азота) во избежание окисления выделяемых субстанций. Для полноты выделения стериновых компонентов к сорбенту, оставшемуся в пробирке, добавляли 1.5 мл этилацетата и повторяли экстракцию с использованием ультразвукового воздействия дважды. К полученным свободным стеринам и их эфирам в качестве внутреннего стандарта добавляли эргостерин (20 мкг) (Sigma, США) – компонент, не встречающийся в объектах исследования. Для получения необходимых для анализа методом газовой хромато-масс-спектрометрии (ГХ-МС) летучих производных свободные стерины и эфиры стеринов подвергали модификации – силилированию путем обработки N,O-бис-(триметилсилил)трифторацетамидом с триметилхлорсиланом (200 мкл) (Fluka, США). Силилирование проводили в сушильном шкафу (Binder, Германия) в течение 30 мин при 70°С. Полученные триметилсилил-производные анализировали с помощью метода ГХ-МС.

ГХ-МС анализ. Анализ проводили с помощью хромато-масс-спектрометра Agilent G7000B Triple Quad (Agilent Technologies Inc., США), состоящего из газового хроматографа 7890А (колонка HP-5MS, 30 м × 250 мкм × 0.25 мкм со стационарной фазой метилполисилаксан) и масс-селективного детектора Agilent 7000 (QQQ) с трехквадрупольным масс-анализатором (в режиме квадруполя). Температурная программа хроматографирования: при 70°С (1 мин), изотерма; далее программируемый нагрев до 280°С со скоростью 5°С/мин; при 280°С (5 мин), изотерма; далее программируемый нагрев до 300°С со скоростью 20°С/мин; при 300°С (3 мин), изотерма. Инжектор с делением потока 5 : 1. Температура инжектора 250°С, температура детектора 150°С, температура интерфейса 280°С. Газ-носитель – гелий, скорость потока 1 мл/мин. Объем вводимой пробы 1 мкл. Хроматограмма образцов – по полному ионному току (SCAN). Условия масс-спектрометрического детектирования: энергия ионизирующих электронов 70 эВ; регистрация масс-спектров положительных ионов в диапазоне (m/z) от 50 до 600 а.е.м. со скоростью 1.9 скан/сек. Программное обеспечение – MassHunter GC/MS Acquisition B.05.00.412 и Mass Hunter Workstation Software Qualitative Analysis Version B.03.01 Build 3.1.346.14 Service Pack 3 (Agilent Technologies Inc., США).

Детектирование и количественный анализ. Идентификация компонентного состава (качественный анализ) проведена в соответствии с базой данных полных масс-спектров (NIST-08 и Wiley-7), с учетом фрагментных диагностических пиков, присутствующих в масс-спектрах и характеризующих структурные особенности исследуемых соединений, а также в соответствии со значениями хроматографического времени удерживания (Retention Time, RT) стандартных образцов. В качестве стандартных образцов использовали холестерин, стигмастерин, кампестерин (Sigma, США) и β-ситостерин (European pharmacopoeia reference standard, Франция). Относительное содержание (%) компонентов смеси (количественный анализ) вычислено из соотношения площадей хроматографических пиков (методом простого нормирования). Количественный анализ исследуемых компонентов проводили методом внешней калибровки с учетом отклика внутреннего стандарта по формуле:

${{{\text{C}}}_{{{\text{СТЕРИНА}}}}} = \frac{{{{{\text{С}}}_{{{\text{СТ}}}}}{{S}_{{{\text{СТЕРИНА}}}}}}}{{a{{S}_{{{\text{СТ}}}}} + b{{S}_{{{\text{СТЕРИНА}}}}}}},$

где ССТЕРИНА – концентрация искомого стерина, ССТ – концентрация стандарта, SСТЕРИНА – площадь искомого стерина, SСТ – площадь стандарта, a и b – поправочные коэффициенты.

Статистическая обработка. В таблицах представлены средние данные из четырех-шести биологических повторностей и их стандартные отклонения. Статистическую обработку экспериментальных данных осуществляли с использованием пакета статистического анализа в среде Microsoft Office Excel 2010. Нормальность распределения полученных значений определяли по критерию Шапиро-Уилка. Статистическую значимость различий сравниваемых средних значений оценивали с помощью t-критерия (P < 0.05).

РЕЗУЛЬТАТЫ

Результаты ГХ-МС анализа компонентного состава свободных стеринов в эмбриогенных и неэмбриогенных клеточных линиях лиственницы сибирской приведены в табл. 1 и 2, а эфиров стеринов – в табл. 3, 4 и 5. Подробный компонентный состав фракций стеринов и их эфиров представлен в табл. 1 и 2 (Дополнительные материалы). Следует отметить, что свободные стерины клеточных линий отличались бóльшим разнообразием компонентов и насчитывали от 11 (Кл2) до 21 (Кл4, Кл10) различных соединений, по сравнению с эфирами стеринов, которых было обнаружено 10 соединений у эмбриогенных клеточных линий и 16 – у неэмбриогенных.

Таблица 1.

Содержание компонентов фракции свободных стеринов в эмбриогенных и неэмбриогенных клеточных линиях лиственницы сибирской (% по весу)

Соединения Кл2 (э) Кл4 (э) Кл6 (э) Кл10 (э) Кл23 (нэ) Кл31 (нэ)
Стерины
Без двойной связи 1.9 ± 0.1 2.8 ± 0.2 0.3 ± 0.0 6.0 ± 0.5 3.3 ± 0.3 6.0 ± 0.5
С разными двойными связями 1.8 ± 0.2 0.2 ± 0.0 0.1 ± 0.0 0.1 ± 0.0 0.03 ± 0.00 1.2 ± 0.1
∑∆7-стеринов 3.1 ± 0.4 1.6 ± 0.2 1.0 ± 0.1 1.4 ± 0.1 2.3 ± 0.3 2.1 ± 0.1
∑∆5-стеринов 93.2 ± 1.0 95.3 ± 1.0 98.6 ± 1.1 92.5 ± 0.4 94.4 ± 0.9 90.7 ± 1.1
∆5-стерины
Изофукостерин 12.9 ± 1.2 15.3 ± 0.1 18.0 ± 1.3 17.7 ± 0.3 – 2.6 ± 0.1
Холестерин 0.2 ± 0.0 0.6 ± 0.0 1.8 ± 0.2 0.4 ± 0.0 0.4 ± 0.0 0.2 ± 0.0
Кампестерин 9.2 ± 0.9 15.5 ± 0.7 19.8 ± 0.6 12.5 ± 0.3 10.2 ± 1.2 4.6 ± 0.6
Стигмастерин 1.0 ± 0.1 6.3 ± 0.3 4.1 ± 0.2 23.2 ± 1.4 3.9 ± 0.4 2.9 ± 0.2
β-ситостерин 65.6 ± 4.9 54.3 ± 0.9 54.2 ± 2.0 38.4 ± 1.1 75.9 ± 1.2 75.6 ± 2.0

Примечание. (э) – эмбриогенные клеточные линии; (нэ) – неэмбриогенные клеточные линии. В таблице приведены средние значения из 4–5 биологических повторностей и их стандартные отклонения, различия значимы при P < 0.05.

Таблица 2.

Абсолютное содержание наиболее распространенных ∆5-стеринов в эмбриогенных и неэмбриогенных клеточных линиях лиственницы сибирской во фракции свободных стеринов

Стерины, Кл2 (э) Кл4 (э) Кл6 (э) Кл10 (э) Кл23 (нэ) Кл31 (нэ)
мкг/г сухого веса
Холестерин 4.2 ± 0.3 6.7 ± 2.8 17.6 ± 1.5 4.4 ± 1.5 4.4 ± 0.7 4.2 ± 0.1
Кампестерин 191.8 ± 8.1 166.2 ± 7.7 199.2 ± 12.0 133.8 ± 1.3 104.3 ± 2.9 102.4 ± 0.9
Стигмастерин 21.8 ± 1.3 67.2 ± 8.0 41.7 ± 4.9 248.2 ± 3.8 40.0 ± 0.1 63.9 ± 1.3
β-ситостерин 1370.1 ± 49.3 582.5 ± 53.5 544.7 ± 32.3 410.0 ± 7.1 776.5 ± 96.5 1684.8 ± 23.7
Стигмастерин/Ситостерин 0.02 ± 0.00 0.12 ± 0.01 0.08 ± 0.01 0.61 ± 0.02 0.05 ± 0.01 0.04 ± 0.00
Ситостерин/Кампестерин 7.14 ± 0.05 3.50 ± 0.17 2.73 ± 0.10 3.06 ± 0.08 7.44 ± 1.17 16.45 ± 0.19

Примечание. (э) – эмбриогенные клеточные линии; (нэ) – неэмбриогенные клеточные линии. В таблице приведены средние значения из 4–5 биологических повторностей и их стандартные отклонения, различия значимы при P < 0.05.

Таблица 3.

Содержание различных компонентов во фракции эфиров стеринов в эмбриогенных и неэмбриогенных клеточных линиях лиственницы сибирской (% по весу)

Соединения Кл2 (э) Кл4 (э) Кл6 (э) Кл10 (э) Кл23 (нэ) Кл31 (нэ)
Эфиры стеринов
Без двойной связи 54.4 ± 0.6 61.0 ± 3.9 52.8 ± 3.1 71.1 ± 3.3 61.9 ± 2.3 55.7 ± 0.1
С разными двойными связями 15.5 ± 0.1 4.6 ± 0.5 2.6 ± 0.3 3.1 ± 0.3 4.0 ± 0.3 4.0 ± 0.0
∆5-стерины 17.6 ± 0.4 8.6 ± 0.6 10.4 ± 0.9 10.7 ± 1.0 15.6 ± 1.8 7.8 ± 0.2
∆5-стерины
Холестерин 3.1 ± 0.2 2.2 ± 0.3 3.6 ± 0.4 3.1 ± 0.4 1.9 ± 0.2 1.4 ± 0.1
Кампестерин 1.6 ± 0.2 2.1 ± 0.2 2.3 ± 0.3 3.1 ± 0.4 1.4 ± 0.1 0.5 ± 0.0
Стигмастерин 4.7 ± 0.5 2.4 ± 0.3 1.8 ± 0.2 2.2 ± 0.3 1.0 ± 0.1 1.5 ± 0.1
β-ситостерин 8.3 ± 0.2 1.9 ± 0.2 2.8 ± 0.3 2.4 ± 0.2 2.1 ± 0.3 1.7 ± 0.2

Примечание. (э) – эмбриогенные клеточные линии; (нэ) – неэмбриогенные клеточные линии. В таблице приведены средние значения из 4–5 биологических повторностей и их стандартные отклонения, различия значимы при P < 0.05.

Таблица 4.

Абсолютное содержание наиболее распространенных эфиров ∆5-стеринов в эмбриогенных и неэмбриогенных клеточных линиях лиственницы сибирской, во фракции свободных стеринов

Эфиры стеринов, мкг/г сухого веса Кл2 (э) Кл4 (э) Кл6 (э) Кл10 (э) Кл23 (нэ) Кл31 (нэ)
Холестерин 1.2 ± 0.1 1.3 ± 0.1 2.8 ± 0.1 1.4 ± 0.3 5.8 ± 0.0 3.2 ± 0.4
Кампестерин 0.6 ± 0.0 1.2 ± 0.2 1.8 ± 0.4 1.4 ± 0.4 4.3 ± 0.7 1.1 ± 0.1
Стигмастерин 1.8 ± 0.2 1.4 ± 0.1 1.4 ± 0.2 1.0 ± 0.1 3.1 ± 0.8 3.3 ± 0.1
β-ситостерин 3.2 ± 0.1 1.1 ± 0.4 2.2 ± 0.2 1.1 ± 0.1 6.5 ± 0.5 3.8 ± 0.4

Примечание. (э) – эмбриогенные клеточные линии; (нэ) – неэмбриогенные клеточные линии. В таблице приведены средние значения из 4–5 биологических повторностей и их стандартные отклонения, различия значимы при P < 0.05.

Таблица 5.

Содержание соединений не циклической природы во фракции эфиров стеринов в эмбриогенных и неэмбриогенных клеточных линиях лиственницы сибирской (% по весу)

Соединения Кл2 (э) Кл4 (э) Кл6 (э) Кл10 (э) Кл23 (нэ) Кл31 (нэ)
Сквален 12.5 ± 0.1 25.8 ± 2.8 34.2 ± 3.3 15.1 ± 1.6 2.3 ± 0.3 2.9 ± 0.0
9,10-секохолеста-5,7,10(19)-триен-1,3,25-триол – – – – 16.2 ± 2.3 29.6 ± 0.1

Примечание. (э) – эмбриогенные клеточные линии; (нэ) – неэмбриогенные клеточные линии. В таблице приведены средние значения из 4–5 биологических повторностей и их стандартные отклонения, различия значимы при P < 0.05.

Как известно, свободные стерины по химической структуре относятся к изопреноидам с циклопентанопергидрофенантреном в качестве остова [8]. Методом ГХ-МС в клеточных линиях L. sibirica среди свободных стеринов были обнаружены соединения как без двойных связей в структуре циклопентанопергидрофенантрена, в их числе циклоартенол, так и с двойными связями: в положении ∆8, ∆4, ∆12 и две большие группы свободных стеринов с двойными связями в положении ∆7 и ∆5 (табл. 1). Среди ∆7-стеринов обнаружен холеста-7-aн-3β-ол, являющийся предшественником холестерина и авенастерин – предшественник 24-этилстеринов. Основной вклад в общее количество свободных стеринов внесли ∆5-стерины (холест-5-ен-3-он, холест-5-ен-24-он, прегн-5-ен-20-он, γ-ситостерин, изофукостерин, холестерин, кампестерин, стигмастерин, β-ситостерин), их относительное содержание варьировало от 90.7% (Кл31) до 98.6% (Кл6) от суммы свободных стеринов (табл. 1; Дополнительные материалы, табл. 1). Хроматографическое время удерживания (RT) и характеристические ионы (m/z), наблюдаемые в масс-спектрах идентифицированных стериновых компонентов, представлены в табл. 6.

Таблица 6.

Хроматографическое время удерживания (RT, мин) и характеристические ионы (m/z), наблюдаемые в масс-спектрах идентифицированных стериновых компонентов

Соединения RT, мин m/z
Циклоартенол 22.757 458, 75, 255, 458
Авенастерин 22.914 484, 343, 386, 344
Изофукостерин 22.103 484, 386, 296, 257
Холестерин 19.514 458, 329, 129, 368
Кампестерин 20.734 472, 129, 343, 382
Стигмастерин 21.057 484, 83, 55, 129
β-ситостерин 21.938 486, 129, 357, 396
Этилизо-аллохолат 10.549 436, 55, 57, 81
7,8-эпоксиланостан-11-ол, 3-ацетокси 18.755 502, 57, 69, 95
Сквален 16.688 410, 69, 81, 95
9,10-секохолеста-5,7,10(19)-триен-1,3,25-триол 7.278 502, 55, 57, 71

Наибольший вклад в суммарное содержание свободных стеринов эмбриогенных клеточных линий L. sibirica внесли (% от суммы свободных стеринов): β-ситостерин (38.4−65.6), кампестерин (9.2−19.8), изофукостерин (12.9−18.0) и стигмастерин (1.0−23.2) (табл. 2). Наибольший вклад в суммарное содержание свободных стеринов (% от суммы свободных стеринов) неэмбриогенных линий внесли β-ситостерин (75.6−75.9), кампестерин (4.6−10.2) и стигмастерин (2.9−3.9). Изофукостерин в неэмбриогенных линиях, в отличие от эмбриогенных, либо не был обнаружен (Кл23), либо обнаружен в незначительных количествах (2.6% от суммы свободных стеринов для Кл31).

Доминирующим стерином во всех клеточных линиях L. sibirica был β-ситостерин – его содержание варьировало от 410.0 (Кл10) до 1684.8 (Кл31) мкг/г сухого веса образца (табл. 2). Содержание β-ситостерина было достоверно выше в неэмбриогенных клеточных линиях, по сравнению с эмбриогенными. Абсолютное содержание кампестерина было достоверно более высоким в эмбриогенных клеточных линиях – от 133.8 (Кл10) до 199.2 (Кл6) мкг/г сухого веса, чем в неэмбриогенных, где этот показатель составлял 102.4 (Кл31) − 104.3 (Кл23) мкг/г сухого веса (табл. 2). Значимых отличий в распределении стигмастерина и холестерина между эмбриогенными и неэмбриогенными клеточными линиями выявлено не было (табл. 2). Абсолютное содержание стигмастерина варьировало в пределах от 21.8 (Кл2) до 248.2 (Кл10) мкг/г сухого веса. Абсолютное содержание холестерина у всех линий было значительно ниже, чем стигмастерина и составляло от 4.2 (Кл31) до 17.6 (Кл6) мкг/г сухого веса. Следует отметить, что в эмбриогенных клеточных линиях лиственницы сибирской обнаружено довольно высокое относительное содержание изофукостерина (12.9% (Кл2) и 18.0% (Кл6) от суммы свободных стеринов), в то время как в неэмбриогенных клеточных линиях этот стерин был обнаружен только в линии Кл31 в минорном количестве.

Во всех клеточных линиях L. sibirica во фракции эфиров стеринов в небольшом количестве были обнаружены эфиры холестерина, кампестерина, стигмастерина, β-ситостерина (табл. 3, 4). Наибольший вклад в суммарное содержание эфиров стеринов во всех клеточных линиях вносили соединения без двойной связи в структуре циклопентанопергидрофенантрена: от 52.8% (Кл6) до 71.1% (Кл10) от суммы эфиров стеринов (табл. 3). Кроме того, этот тип соединений включал в себя наибольшее разнообразие эфиров – 7 соединений (Дополнительные материалы, табл. 2). Среди эфиров стеринов всех клеточных линий, в отличие от свободных стеринов, не были обнаружены ∆7-стерины. Во фракции, содержащей эфиры стеринов, был идентифицирован сквален – углеводород тритерпенового ряда (табл. 5). Относительное содержание этого компонента (% от суммы эфиров стеринов) в эмбриогенных линиях было значительно выше (12.5 (Кл2) – 34.2 (Кл6)), чем в неэмбриогенных (2.3% (Кл23) – 2.9% (Кл31)).

ОБСУЖДЕНИЕ

Известно, что холестерин оказывает значительное влияние на мембранную проницаемость, в меньшей степени такое влияние оказывают кампестерин, β-ситостерин и стигмастерин [8]. У растений содержание холестерина, как правило, достаточно низкое. Так, у арабидопсиса содержание холестерина составляло 3.8% от суммы свободных стеринов [23], а в надземных частях хвоща пестрого (Equisetum variegatum Shleich. ex Web.) с-одержание холестерина снижалось к осенней вегетации с 1.2 до 0.6% от суммы свободных стеринов (с 4.9 до 2.7 мкг/г сухого веса) по сравнению с летней [24]. В растительных тканях in vitro холестерин может отсутствовать. Например, холестерин не был обнаружен в каллусных культурах Euphorbia tirucalli L. [25] и Linum usitatissimum L. [21], но содержался в малых количествах (1.2%) в суспензионной культуре Nicotiana tabacum L. [26]. В наших экспериментах абсолютное содержание холестерина во всех клеточных линиях L. sibirica было значительно ниже, чем стигмастерина и варьировало от 4.2 (Кл31) до 17.6 (Кл6) мкг/г сухого веса или от 0.2% (Кл2, Кл31) до 1.8% (Кл6) от суммы свободных стеринов. При этом анализ полученных результатов не выявил различий в содержании холестерина между эмбриогенными и неэмбриогенными линиями.

Как уже говорилось выше, доминирующим стерином во всех клеточных линиях L. sibirica был β-ситостерин – его содержание варьировало от 410.0 (Кл10) до 1684.8 (Кл31) мкг/г сухого веса (табл. 2). Следует отметить, что содержание этого стерина было достоверно выше в неэмбриогенных клеточных линиях, по сравнению с эмбриогенными (табл. 2). Однако было и исключение: в эмбриогенной линии Кл2 содержание β-ситостерина было более высоким (1370.1 мкг/г сухого веса), чем в других эмбриогенных линиях и, таким образом, сравнимо с таковым у неэмбриогенных линий. Известно, что β-ситостерин является важным участником процесса элонгации клеток [27], а также участвует в процессах их пролиферации [28] и дифференциации [29]. В растениях in vivo β-ситостерин также обычно является преобладающим стерином, однако, его содержание может отличаться в тканях отдельных органов. Например, в цветках и плодах Olea europaea L. cv. Picual, содержание этого стерина составляло 97 и 92% от суммы свободных стеринов, соответственно [30]. У N. tabacum L. var. Xanthi содержание β-ситостерина в корнях составляло 31%, а в листьях 18% от суммы свободных стеринов [31]. Для Triticum aestivum L. (сорт Казанская Юбилейная), также отмечено более высокое содержание этого стерина в корнях, чем в листьях – 60.5 и 55.6% от суммы свободных стеринов, соответственно [32]. Что касается растений in vitro, то β-ситостерин не всегда является преобладающим. Например, в суспензионной культуре сельдерея (Apium graveolens L.) отмечено более низкое относительное содержание этого стерина – 28.3% от суммы свободных стеринов, тогда как доминирующим стерином был стигмастерин (44.2% от суммы свободных стеринов) [33]. Известно, что содержание стеринов в каллусной культуре растений зависит от исходного материала (типа экспланта) [34]. Например, в каллусах Crataeva tapia L., полученных из листьев, содержание β-ситостерина варьировало от 360 до 1230 мкг/г сухого веса, тогда как в каллусах, полученных из тканей стебля, оно было более высоким и составляло 420-3410 мкг/г сухого веса [34]. Показано также, что в эмбриогенных и неэмбриогенных каллусах льна (L. usitatissimum L.) абсолютное содержание β-ситостерина было около 800 и 700 мкг/г сухого веса (53.3 и 50.0% от суммы свободных стеринов), соответственно [21]. Этими же авторами установлена связь между накоплением β-ситостерина и ростом биомассы неэмбриогенных каллусов. По-видимому, уровень β-ситостерина, необходимый для нормального развития растения in vivo и in vitro является видоспецифическим признаком. При этом, как известно, важное физиологическое значение имеет баланс содержаний стигмастерина и β-ситостерина [8].

Стигмастерин считается “стрессовым” стерином, поскольку его содержание в тканях возрастает при реакции растений на стрессирующие воздействия различной природы [8]. У высших растений содержание стигмастерина обычно ниже, чем β-ситостерина. Например, у арабидопсиса содержание стигмастерина составляло всего 4.2% от суммы свободных стеринов [23]. В работе [24] авторами показано, что в надземных частях хвоща пестрого стигмастерин обнаружен только в образцах осенней вегетации (4.3 мкг/г сухого веса) при относительно низкой температуре. Имеющиеся в литературе данные показывают, что для каллусов, полученных от разных видов растений, содержание этого стерина может существенно различаться. Например, в суспензионной культуре табака (N. tabacum L.) содержание стигмастерина составляло 7.1% [26], а в каллусах молочая (E. tirucalli L.) − от 5.9 до 34.3% от суммы свободных стеринов [25]. В нашем исследовании не было выявлено значимых отличий в распределении стигмастерина (и холестерина) между эмбриогенными и неэмбриогенными клеточными линиями лиственницы сибирской (табл. 2). Относительное и абсолютное содержание стигмастерина варьировало в пределах от 21.8 (Кл2) до 248.2 (Кл10) мкг/г сухого веса или от 1.0% (Кл2) до 23.2% (Кл10) от суммы свободных стеринов, за одним исключением. Среди эмбриогенных линий, Кл10 отличалась значительно более высоким абсолютным и относительным содержанием этого стерина (248.2 мкг/г сухого веса и 23.2% соответственно), чем все остальные линии. Следует отметить, что на ранней стадии культивирования (1 год) Кл10 формировала самое высокое число зародышей, однако при более длительном культивировании эта линия характеризовалась низким относительным количеством нормальных соматических зародышей и более низким процентом их прорастания относительно других эмбриогенных линий [35]. Учитывая, что низкое соотношение стигмастерин/β-ситостерин характерно для линий с более высоким потенциалом выхода нормальных соматических зародышей и процентом их прорастания, можно предположить, что соотношение этих двух стеринов важно для регуляции нормального развития эмбриогенных тканей в культуре лиственницы сибирской. Известно, что высокие значения соотношения стигмастерин/β-ситостерин характерны для стрессового состояния растений [8]. Можно предположить, что увеличение на порядок этого параметра для Кл10, относительно других эмбриогенных клеточных линий, связано со стрессовым состоянием тканей этой линии, обусловленным особенностями ее развития.

В растениях предшественником β-ситостерина в биосинтезе стеринов является изофукостерин [13, 36]. Его содержание может быть достаточно высоким, наряду с другими распространенными стеринами, такими как β-ситостерин, кампестерин и стигмастерин [8]. Например, в каллусах E. tirucalli содержание изофукостерина составляло от 20.7 до 90.3% от суммы свободных стеринов [25]. В наших экспериментах относительное содержание изофукостерина в эмбриогенных клеточных линиях лиственницы сибирской варьировало от 12.9% (Кл2) до 18.0% (Кл6) от суммы свободных стеринов. В неэмбриогенных клеточных линиях изофукостерин был обнаружен только в линии Кл31, где его содержание было в 5-7 раз ниже, чем в эмбриогенных линиях. Можно предположить, что в эмбриогенных клеточных линиях конвертация изофукостерина в β-ситостерин (посредством работы SSR1 − Sterol Side-chain Reductase − редуктазы боковой цепи) менее интенсивна, чем у неэмбриогенных. В биосинтезе стеринов SSR1 участвует не только в образовании β-ситостерина из изофукостерина, но также в образовании кампестерина из 24-метиленхолестерина [14, 36]. Особенностями работы этого фермента в эмбриогенных и неэмбриогенных линиях лиственницы сибирской могло бы объясняться не только более высокое содержание β-ситостерина в неэмбриогенных каллусах, но и более высокое содержание кампестерина в эмбриогенных линиях. В наших экспериментах относительное содержание кампестерина составляло около 19% от суммы свободных стеринов в эмбриогенных линиях и 4.6% (Кл31) и 10.2% (Кл23) от суммы свободных стеринов в неэмбриогенных (табл. 2). Что касается абсолютного содержания кампестерина, то в эмбриогенных линиях оно было значительно (в линии Кл6 в два раза) выше (от 133.8 (Кл10) до 199.2 (Кл6) мкг/г сухого веса), чем в неэмбриогенных, где этот показатель составлял 102.4 (Кл31) − 104.3 (Кл23) мкг/г сухого веса (табл. 2). Следует отметить, что линия Кл10, имеющая низкий выход нормальных зародышей, имела наиболее низкое содержание кампестерина среди эмбриогенных линий.

Известно, что кампестерин является основным предшественником БС, которые у многих растений играют важную роль в их росте и развитии. БС вызывают широкий спектр морфологических и физиологических реакций и влияют на устойчивость растений к абиотическим и биотическим стрессовым факторам. Предполагается, что дефекты роста тканей могут быть связаны с отсутствием достаточного количества кампестерина в качестве предшественника БС [13]. Кампестерин стимулирует рост и развитие растительных тканей в условиях in vivo и в культуре in vitro и участвует в регуляции морфогенетических процессов [9, 14]. Поэтому можно предположить, что установленное в наших экспериментах высокое абсолютное содержание кампестерина в эмбриогенных линиях лиственницы сибирской, значительно превышающее таковое у неэмбриогенных линий, может свидетельствовать о важной роли этого стерина в процессах эмбриогенеза.

Полученные нами данные показывают, что биосинтез стеринов у эмбриогенных и неэмбриогенных линиях лиственницы сибирской имеет отличительные особенности в отношении баланса 24-этилстеринов (β-ситостерин) и 24-метилстеринов (кампестерин).

Как уже говорилось выше, эфиры стеринов неэмбриогенных клеточных линий, в отличие от эмбриогенных, характеризуются бóльшим разнообразием. Во фракции эфиров стеринов всех клеточных линий лиственницы сибирской были обнаружены эфиры холестерина, кампестерина, стигмастерина, β-ситостерина в сравнительно небольшом количестве (табл. 3). Абсолютное их содержание представлено в табл. 4. Помимо стеринов и их эфиров в процессе анализа был идентифицирован сквален – углеводород тритерпенового ряда (табл. 5). Содержание этого компонента в эмбриогенных линиях лиственницы сибирской было значительно, в 4 и более раз выше, чем в неэмбриогенных. Сквален является важным предшественником в процессе биосинтеза стеринов [8, 14]. Кроме того, благодаря неполярной природе и расположению в гидрофобном центре липидного бислоя, сквален увеличивает жесткость и размер клеточной мембраны, ее полярность и гидрофобные свойства, способствует восстановлению мембран, функциональной регуляции мембранных белков, транспорту ионов, обладая при этом антиоксидантными свойствами [37]. Можно предположить, что высокое содержание сквалена в эмбриогенных клеточных линиях, обусловленное, вероятно, особенностями биосинтеза стеринов в тканях каллусов с разной эмбриогенностью, способно положительно влиять на мембранную структуру клеток, защищая их от окисления и способствуя тем самым нормальному прохождению процесса эмбриогенеза.

В неэмбриогенных линиях лиственницы сибирской во фракции эфиров стеринов обнаружено соединение 9,10-секохолеста-5,7,10(19)-триен-1,3,25-триол (табл. 5), которое в своей структуре содержит только два циклогексановых кольца вместо четырех, характерных для стеринов, и относится к классу терпеноидов [38]. Содержание этого соединения достаточно высокое − 16.2% (Кл23) и 29.6% (Кл31) от общего количества эфиров стеринов. Исходя из структуры 9,10-секохолеста-5,7,10(19)-триен-1,3,25-триола, можно предположить, что это соединение является предшественником или побочным продуктом при биосинтезе стеринов. В литературе имеются сведения об обнаружении этого соединения в семенах Wrightia arborea [39], экстрактах листьев Terminalia catappa [38] и др.

Анализ полученных результатов показывает, что содержание и качественный состав свободных стеринов и их эфиров в культуре in vitro лиственницы сибирской существенно различаются в клеточных линиях с разным эмбриогенным потенциалом. Эмбриогенные линии содержали значительно больше кампестерина – предшественника БС, для которого показана важная роль в морфогенезе [14], а неэмбриогенные линии − β-ситостерина, высокое содержание которого многие авторы связывают с накоплением биомассы [21], но не с эмбриогенезом. Установлено, что клеточные линии лиственницы сибирской, контрастные по способности к соматическому эмбриогенезу, демонстрировали значительные различия в соотношении двух основных растительных стеринов − β-ситостерин/кампестерин. Известно, что это соотношение критически важно для функционального состояния клеточной мембраны, в том числе для упорядочивания жирнокислотных цепей в составе мембран, увеличения мембранной проницаемости для воды и ионов, а также для активности мембранно-связанных белков [8, 22]. Мы предполагаем, что установленные в экспериментах различия в соотношении β-ситостерин/кампестерин могут указывать на такие изменения мембранных свойств, которые играют важную роль в процессах дифференциации клеток при эмбриогенезе. В отношении “стрессового” стигмастерина, большое количество которого обнаружено у линии Кл10, имеющей нарушения в развитии зародышей, логично предположить, что его высокое содержание сопровождает и/или вызывает нарушение нормального развития эмбриогенных структур лиственницы сибирской. Высокое содержание в тканях эмбриогенных линий сквалена, являющегося субстратом для биосинтеза стеринов, может быть связано как с различиями в активности синтетических процессов в клеточных линиях L. sibirica с разной эмбриогенностью, так и со структурными и антиоксидантными функциями этого соединения, которые могут способствовать эмбриогенезу.

Высокое содержание кампестерина в эмбриогенных тканях клеточных линий L. sibirica, наряду с ранее установленным нами высоким содержание в них моноеновых ЖК (в первую очередь, олеиновой) [5], вероятно, могут служить маркером эмбриогенного потенциала этих линий для отбора перспективных для клонального размножения каллусов.

Работа выполнена с использованием оборудования Центра коллективного пользования “Биоаналитика” СИФИБР СО РАН. Авторы выражают благодарность д.б.н., проф. И.Н. Третьяковой (Институт леса им. В.Н. Сукачева СО РАН, г. Красноярск) за предоставление исходного растительного материала лиственницы сибирской.

Список литературы

  1. Третьякова И.Н., Ворошилова Е.В., Шуваев Д.Н., Пак М.Э. Перспективы микроклонального размножения хвойных в культуре in vitro через соматический эмбриогенез // Хвойные бореальной зоны. 2012. Т. 30. С. 180.

  2. Tretiakova I.N. Embryogenic cell lines and somatic embryogenesis in an vitro culture of Siberian larch // Dokl. Biol. Sci. 2013. V. 450. № 1. P. 139. https://doi.org/10.1134/S0012496613030034

  3. Joy R.W., Yeung E.C., Kong L., Thorpe T. Development of white spruce somatic embryos: I. Storage product deposition // In Vitro Cell. Dev. Biol. – Plant. 1991. V. 27. P. 32.

  4. Tranvan H.O.A., Troton D., Calvayrac R. Morphological, histological and lipid changes during adventitious budding in Pinus pinaster cultured cotyledons // J. Exp. Bot. 1988. V. 39. № 7. P. 907. https://doi.org/10.1093/jxb/39.7.907

  5. Makarenko S.P., Shmakov V.N., Dudareva L.V., Stolbikova A.V., Semenova N.V., Tret’yakova I.N., Konstantinov Yu.M. Fatty acid composition of total lipids in embryogenic and nonembryogenic callus lines of larch // Russ. J. Plant Physiol. 2016. V. 63. №. 2. P. 252. https://doi.org/10.1134/S1021443716020102

  6. Семёнова Н.В., Шмаков В.Н., Пак М.Э., Третьякова И.Н., Константинов Ю.М., Дударева Л.В. Особенности состава нейтральных липидов эмбриогенных и неэмбриогенных клеточных линий Larix sibirica Ledeb. // Биологические мембраны. 2020. Т. 37. С. 215. https://doi.org/10.31857/S0233475520020127

  7. Semenova N.V., Shmakov V.N., Konstantinov Yu.M., Dudareva L.V. Phospholipids of embryogenic and non-embryogenic cell lines of Larix sibirica Ledeb. // Russ. J. Plant Physiol. 2020. V. 67. P. 1076. https://doi.org/10.1134/S1021443720060151

  8. Valitova J.N., Sulkarnayeva A.G., Minibayeva F.V. Plant sterols: Diversity, biosynthesis, and physiological functions // Biochemistry (Moscow). 2016. V. 81. P. 819. https://doi.org/10.1134/S0006297916080046

  9. Kreis W., Muller-Uri F. Biochemistry of sterols, cardiac glycosides, brassinosteroids, phytoecdysteroids and steroid saponins // Ann. Plant Rev. 2010. V. 40. P. 304. https://doi.org/10.1002/9781444320503.ch6

  10. Willmann M.R. Sterols as regulators of plant embryogenesis // Trends Plant Sci. 2000. V. 5. № 10. P. 416. https://doi.org/10.1016/S1360-1385(00)91717-5

  11. Hartmann M.A. Plant sterols and the membrane environment // Trends Plant Sci. 1998. V. 3. № 5. P. 170. https://doi.org/10.1016/S1360-1385(98)01233-3

  12. Senthill-Kumar M., Wang K., Mysore K.S. AtCYP710A1 gene emediated stigmasterol production plays a role in imparting temperature stress tolerance in Arabidopsis thaliana // Plant Signal. Behav. 2013. V. 8. № 2. P. e23142-1. https://doi.org/10.4161/psb.23142

  13. Schaller H. The role of sterols in plant growth and development // Prog. Lipid Res. 2003. V. 42. № 3. P. 163. https://doi.org/10.1016/S0163-7827(02)00047-4

  14. Bajguz A., Chmur M., Gruszka D. Comprehensive overview of the Brassinosteroid biosynthesis pathways: substrates, products, inhibitors, and connections // Front. Plant Sci. 2020. V. 11. P. 1034. https://doi.org/10.3389/fpls.2020.01034

  15. Clouse S.D. Brassinosteroid signal transduction: from receptor kinase activation to transcriptional networks regulating plant development // Plant Cell. 2011. V. 23. № 4. P. 1219. https://doi.org/10.1105/tpc.111.084475

  16. Tian X., Xuan L., Liu B., Hu T., Wang C., Wang X. Effects of heterologous expression of Populus euphratica brassinosteroids biosynthetic enzyme genes CPD (PeCPD) and DWF4 (PeDWF4) on tissue dedifferentiation and growth of Arabidopsis thaliana seedlings // Plant Cell Tissue Organ Cult. 2018. V. 132. № 1. P. 111. https://doi.org/10.1007/s11240-017-1316-2

  17. Nolan T., Chen J., Yin Y. Cross-talk of Brassinosteroid signaling in controlling growth and stress responses // Biochem. J. 2017. V. 474. № 16. P. 2641. https://doi.org/10.1042/BCJ20160633

  18. Zu S.H., Jiang Y.T., Hu L.Q., Zhang Y.J., Chang J.H., Xue H.W., Lin W.H. Effective modulating Brassinosteroids signal to study their specific regulation of reproductive development and enhance yield // Front. Plant Sci. 2019. V. 10. P. 1. https://doi.org/10.3389/fpls.2019.00980

  19. Schrick K. Mayer U., Martin G., Bellini C., Kuhnt C., Schmidt J., Jurgens G. Interactions between sterol biosynthesis genes in embryonic development of Arabidopsis // Plant J. 2002. V. 31. № 1. P. 61. https://doi.org/10.1046/j.1365-313X.2002.01333.x

  20. Schrick K., Cordova C., Li G., Murray L., Fujioka S. A dynamic role for sterols in embryogenesis of Pisum sativum // Phytochem. 2011. V. 72. № 6. P. 465. https://doi.org/10.1016/j.phytochem.2011.01.009

  21. Cunha A., Ferreira M.F. Differences in free sterols content and composition associated with somatic embryogenesis, shoot organogenesis and calli growth of flax // Plant Sci. 1997. V. 124. P. 97. https://doi.org/10.1016/S0168-9452(97)04587-1

  22. Zur I., Skoczowski A., Niemczyk E., Dubert F. Changes in the composition of fatty acids and sterols of membrane lipids during induction and differentiation of Brassica napus (var. oleifera L.) callus // Acta Physiol. Plant. 2002. V. 24. № 1. P. 3. https://doi.org/10.1007/s11738-002-0015-7

  23. Silvestro D., Andersen T.G., Schaller H., Jensen P.E. Plant sterol metabolism. ∆7-Sterol-C5-desaturase (STE1/DWARF7), ∆5,7-sterol-∆7-reductase (DWARF5) and ∆24-sterol-∆24-reductase (DIMINUTO/DWARF1) show multiple subcellular localizations in Arabidopsis thaliana (Heynh) L. // PLOS One. 2013. V. 8. P. 1. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0056429

  24. Дударева Л.В., Семенова Н.В., Нохсоров В.В., Рудиковская Е.Г., Петров К.А. Компонентный состав фитостеринов надземной части хвоща пестрого Еquisétum variegatum Schleich. ex. Web., произрастающего в cеверо-восточной Якутии // Химия растительного сырья. 2020. № 2. С. 133. https://doi.org/10.14258/jcprm.2020025555

  25. Uchida H., Ohyama K., Suzuki M., Yamashita H., Muranaka T., Ohyama K. Triterpenoid levels are reduced during Euphorbia tirucalli L. callus formation // Plant Biotechnol. 2010. V. 27. № 1. P. 105. https://doi.org/10.5511/plantbiotechnology.27.105

  26. Chiu P.L., Bottino P.J., Patterson G.W. Sterol composition of nystatin and amphotericin B resistant tobacco calluses // Lipids. 1980. V. 15. №. 1. P. 50. https://doi.org/10.1007/BF02534118

  27. Deng S., Wei T., Tan K., Hu M., Li F., Zhai Y., Ye Sh., Xiao Y., Hou L., Luo M. Phytosterol content and the campesterol: sitosterol ratio influence cotton fiber development: role of phytosterols in cell elongation // Sci. China Life Sci. 2016. V. 59. № 2. P. 183. https://doi.org/10.1007/s11427-015-4992-3

  28. Qian P., Han B., Forestier E., Hu Z., Gao N., Lu W., Shaller H., Li J., Hou S. Sterols are required for cell fate commitment and maintenance of the stomatal lineage in Arabidopsis // Plant J. 2013. V. 74. № 6. P. 1029. https://doi.org/10.1111/tpj.12190

  29. Carland F.M., Fujioka Sh., Takatsuto S., Yoshida Sh., Nelson T. The identification of CVP1 reveals a role for sterols in vascular patterning // Plant Cell. 2002. V. 14. P. 2045. https://doi.org/10.1105/tpc.003939

  30. Ines C., Corbacho J., Paredes M.A., Labrador J., Cordeiro A.M., Gomez Jimenez M.C. Regulation of sterol content and biosynthetic gene expression during flower opening and early fruit development in olive // Physiol. Plant. 2019. V. 167. № 4. P. 526. https://doi.org/10.1111/ppl.12969

  31. Schaeffer A., Bouvier-Nave P., Benveniste P., Schaller H. Plant sterol-C24-methyl transferases: different profiles of tobacco transformed with SMT1 or SMT2 // Lipids. 2000. V. 35. № 3. P. 263. https://doi.org/10.1007/s11745-000-0522-1

  32. Valitova J., Renkova A., Mukhitova F., Dmitrieva S., Beckett R.P., Minibayeva F.V. Membrane sterols and genes of sterol biosynthesis are involved in the response of Triticum aestivum seedlings to cold stress // Plant Physiol. Biochem. 2019. V. 142. P. 452. https://doi.org/10.1016/j.plaphy.2019.07.026

  33. Dyas L., Prescott M.C., Evershed R.P., Goad L.J. Steryl esters in a cell suspension culture of celery (Apium graveolens) // Lipids. 1991. V. 26. № 7. P. 536. https://doi.org/10.1007/BF02536600

  34. Sharma P., Patil A., Patil D. Quantification of β-sitosterol from field grown plants and callus of Crataeva tapia L. // Int. J. Pharm. Sci. 2016. V. 7. № 4. P. 1556. https://doi.org/10.13040/IJPSR.0975-8232.7(4).1556-63

  35. Третьякова И.Н., Иваницкая А.С., Пак М.Э. Продуктивность эмбриогенных клеточных линий и их сомаклональная изменчивость у лиственницы сибирской in vitro // Лесоведение. 2015. №. 1. С. 27.

  36. Sonawane P.D., Pollier J., Panda S., Szymanski J., Massalha H., Yona M., Unger T., Malitsky S., Arendt Ph., Pauwels L., Almekias-Siegl E., Rogachev I., Meir S., Cardenas P.D., Athar M. et al. Plant cholesterol biosynthetic pathway overlaps with phytosterol metabolism // Nat. Plants. 2016. V. 3. № 1. P. 1. https://doi.org/10.1038/nplants.2016.205

  37. Lozano-Grande M.A., Gorinstein S., Espitia-Rangel E., Dávila-Ortiz G., Martínez-Ayala A.L. Plant sources, extraction methods, and uses of squalene // Int. J. Agron. 2018. V. 2018. P. 1. https://doi.org/10.1155/2018/1829160

  38. Iheagwam F.N., Israel E.N., Kayode K.O., De Campos O.C., Ogunlana O.O., Chinedu S.N. GC-MS analysis and inhibitory evaluation of Terminalia catappa leaf extracts on major enzymes linked to diabetes // Evid. Based Complement. Alternat. Med. 2019. V. 2019. P. 1. https://doi.org/10.1155/2019/6316231

  39. Nagalakshmi M.A.H., Murthy K.S.R. Phytochemical profile of crude seed oil of Wrightia tinctoria R. BR. and Wrightia arborea (DENNST.) MABB. by GC-MS // Int. J. Pharm. Sci. Rev. Res. 2015. V. 31. P. 46.

Дополнительные материалы

скачать ESM.docx
Приложение 1.
Таблица 1. Компонентное содержание фракции свободных стеринов в эмбриогенных и неэмбриогенных клеточных линиях лиственницы сибирской (% по весу)
Таблица 2. Cодержание компонентов фракции эфиров стеринов в эмбриогенных и неэмбриогенных клеточных линиях лиственницы сибирской (% по весу)

Инструменты

следующая статья выпуска предыдущая статья выпуска содержание выпуска

Физиология растений

Архивы выпусков Информация о журнале Отправить рукопись в журнал