Физиология растений, 2023, T. 70, № 3, стр. 293-300

ВВЕДЕНИЕ

Засоление почвы становится широко распространенным явлением во многих регионах мира и представляет собой глобальную проблему для сельского хозяйства. Длительное воздействие метеорологических факторов (дождь, ветер и др.) может привести к образованию полузасушливых и засушливых районов с естественным засолением почв. Антропогенная деятельность человека и применение нерациональных агротехнических приемов усугубляют ситуацию [1–3].

Засоление является одним из неблагоприятных факторов внешней среды, ограничивающих продуктивность сельскохозяйственных культур. Минерализация почвы ведет к осмотическому стрессу и нарушению ионного гомеостаза. В клетках возникает дефицит ионов K⁺ и одновременно происходит увеличение концентрации ионов Na⁺ внутри растений, что является токсичным для растений, затрудняется поглощение других ионов и питательных веществ, снижается скорость фотосинтеза, накопление биомассы и др. [4, 5].

Ионный дисбаланс и гиперосмотическое давление при засолении почвы ведут к развитию окислительного стресса. Возникают изменения в молекулярных и биохимических путях, участвующих в стрессоустойчивости растений, что в конечном итоге, проявляется в снижении физиологической адаптации растений [6].

Засоление почвы, таким образом, приводит к сочетанию множественных стрессов, кумулятивно действующих на растения. Снижение мобилизации питательных веществ, гормональная нестабильность, образование активных форм кислорода (АФК), ионная токсичность и осмотический стресс ведут к ингибированию роста и развития растений в условиях засоления [7, 8].

Известно, что некоторые микроорганизмы, в том числе и бактерии, стимулирующие рост (PGPB), как Pseudomonas, Bacillus, Rhizobium и др., при засолении среды повышают толерантность сельскохозяйственных культур к стрессу [4, 7, 8]. Доказано, что PGPB способны синтезировать фитогормоны (ауксины, абсцизовую кислоту, гиббереллины, цитокинин) и повышать уровень эндогенных гормонов растений, активируя так называемую индуцированную системную толерантность (ИСТ). ИСТ включает изменение физиологических и биохимических процессов растения, которые смягчают негативные последствия экологических стрессов [9–11]. Применение PGPB также может вызывать усиление антиоксидантной системы для смягчения пагубного воздействия АФК. Положительные эффекты при солевом стрессе обусловлены и продукцией бактериальной AЦК-деаминазы (1-аминоциклопропан-1-карбоксилат), что ведет к снижению уровня этилена и считается ключевым признаком смягчения стресса PGPB [9].

Многочисленные исследования свидетельствуют, что растение может легче приспосабливаться к стрессу, мутуалистически взаимодействуя с различными бактериальными популяциями, в сравнении с отсутствием подобного рода взаимоотношений с микроорганизмами [1, 2]. Усилия ученых в настоящее время направлены на поиск эффективных штаммов микроорганизмов, повышающих солеустойчивость растений, и оценку биохимических и молекулярных реакций растений, подвергшихся засолению и бактериальной инокуляции. Цель работы – изучение влияния эндофитных штаммов бактерий B. subtilis 26Д и 11ВМ на повышение солеустойчивости растений Triticum aestivum L.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Растительный материал. Объектом исследования служили растения пшеницы (Triticum aestivum L., сорт Омская 35). Эксперименты проводили в лабораторных условиях. Семена перед посадкой промывали в мыльной воде, стерилизовали 96%-ым этанолом в течение 1 мин, трижды ополаскивали в дистиллированной воде, подсушивали [16]. В экспериментах использовали бактерии B. subtilis штамма 26Д (коллекция ВНИИСХМ, №128) и штамма 11ВМ (ВНИИСХМ, №519). Семена обрабатывали в ламинар-боксе 20-часовой культурой бактерий, выращенной на мясопептонном агаре при +37°С. Клетки бактерий отмывали раствором 0.001 М KCl. Суспензию клеток доводили до необходимой концентрации по оптической плотности. Расход бактериальной суспензии (10⁶ кл/мл) составлял 20 мкл на 1 г семян. Обработанные семена выдерживали в течение часа, затем использовали в экспериментах. Контрольные семена обрабатывали дистиллированной водой.

Инокулированные и контрольные семена выращивали в вегетационных сосудах (20 × 20 см) при температуре 18–20°С при искусственном равномерном освещении (среднесуточный световой интеграл 200–250 мкмоль/(м² с)) и 16-часовом фотопериоде. Использовали чернозем выщелоченный (верхний гумусовый слой).

Солевой стресс имитировали однократным поливом почвы раствором NaCl в концентрациях 3, 4, 5, 6 г соли в 1 кг почвы после посева семян растений. Контрольные растения поливали дистиллированной водой. Через 30 сут отбирали только побеги для биохимического анализа.

Получение экстрактов из растительных тканей. Побеги растений, выращенных в почве с различной концентрацией соли, промывали в дистиллированной воде, удаляли избыток воды фильтровальной бумагой, взвешивали. Растительный материал гомогенизировали в 0.1 М К-фосфатном буфере pH 6.0 (при определении пероксидазы) или в Трис-содержащем буфере pH 7.8 (при определении каталазы и малонового диальдегида) в соотношении навеска (г) : экстрагент (мл) – 1 : 10, центрифугировали 10 мин при 3500 g на центрифуге (СМ-50, “Elmi”, Латвия). Надосадочную жидкость центрифугировали еще 10 мин при 15 300 g. Надосадочную жидкость использовали для определения активности ферментов и малонового диальдегида.

Определение активности ферментов и малонового диальдегида. Активность пероксидазы оценивали согласно методике Хайруллина с соавторами, исходя из количества окисленного ортофенилендиамина. 1 единица активности фермента соответствовала количеству окисленного ортофенилендиамина (Sigma, США), дающего в описанных условиях приращение оптической плотности ΔА₄₉₂ = 1 за 1 с, приведенное к сырой массе навески (мг растительного материала) [14]. Активность каталазы определяли согласно методике Королюк с соавторами. Принцип метода основан на способности перекиси водорода образовывать с солями молибдена стойкий окрашенный комплекс. За единицу активности каталазы принимали превращение 1 ммоль перекиси водорода за 1 с при заданных условиях, приведенное к сырой массе навески (мг растительного материала) [15].

Содержание МДА измеряли, используя метод Costa с соавторами, основанный на образовании окрашенного комплекса между МДА и тиобарбитуровой кислотой при нагревании [16]. Измерение оптической плотности окрашенных растворов проводили на спектрофотометре Unico 2800 (United products and Instruments, США).

Определение содержания фенольных соединений. Содержание растворимых фенольных соединений определяли по методу Фолина и Чокальтеу (Folin, Ciocoalteu, 1927) в модификации Синглетона и Росси [17, 18]. 50 мг навески воздушно-сухих побегов растирали в ступке, добавляли 1.5 мл 80%-ого этанола, помещали в пробирки и выдерживали на водяной бане при 80°С в течение 30 мин. Экстракт центрифугировали 5 мин при 7500 g. К 0.5 мл супернатанта добавляли 2.5 мл реактива Фолина-Чокальтеу, приготовленного по прописи [17, 18]. Через 3 мин реакцию останавливали добавлением 2.0 мл 7.5%-ного раствора карбоната натрия. В холостую пробу вместо растительного экстракта вносили 0.5 мл этилового спирта. Пробирки с реакционной смесью встряхивали, оставляли на 2 ч, затем измеряли оптическую плотность спектрофотометром при длине волны 765 нм.

Содержание фенольных соединений в экстракте оценивали по калибровочной кривой. В качестве стандарта использовали галловую кислоту (Acros organics, Бельгия). Содержание фенольных соединений выражали в мг-экв. галловой кислоты.

Определение содержания свободного пролина. Экстракцию и определение свободного пролина проводили по модифицированной методике Шихалеевой с соавт. [19], используя кислый нингидриновый реактив, приготовленный без нагревания (навеску 1.25 г нингидрина (“Acros organics”, Бельгия) растворяли в 30 мл ледяной уксусной кислоты и 20 мл 6 М раствора H₃PO₄). Навеску свежей листовой пластины (200 мг) заливали 20 мл кипящей дистиллированной воды и выдерживали 10 мин на водяной бане при температуре 100°С. Затем в пробирку заливали 2 мл ледяной уксусной кислоты, 2 мл нингидринового реактива и добавляли 2 мл приготовленного экстракта. Пробы инкубировали 20 мин на водяной бане при температуре 100°С, после чего быстро охлаждали до комнатной температуры на льду. Измеряли оптическую плотность продуктов реакции при длине волны 520 нм. Содержание пролина рассчитывали с помощью калибровочной кривой, используя в качестве стандарта пролин компании “Sigma” (США) [19].

Определение содержания калия и натрия в побегах растений. Содержание влаги и гигровлаги определяли по ГОСТ 57059-2016 [20]. Содержание калия и натрия определяли согласно ГОСТ 32250-2013 с помощью фотометра КФК-3 (Загорский оптико-механический завод, Россия). Макроэлементы калий и натрий определяли на пламенном фотометре ФПА (Загорский оптико-механический завод, Россия) [21].

Статистическая обработка результатов. Статистическую обработку результатов осуществляли с помощью стандартных программ пакета Microsoft Office, данные представлены в виде среднего значения ± стандартное отклонение. Все эксперименты проводили в трех биологических повторностях. Достоверность различий между средними определяли по критерию Стьюдента при уровне значимости P < 0.05.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Влияние соли на рост растений. При солевом стрессе происходило угнетение роста растений, как необработанных, так и обработанных бактериями (табл. 1). С увеличением концентрации соли токсический эффект усиливался. Так, у неинокулированных растений при концентрации NaCl 3, 4, 5, 6 г/кг почвы наблюдали уменьшение биомассы на 6, 18, 20 и 24.4%, соответственно, в сравнении с растениями, выросшими в почве без хлорида натрия.

При отсутствии соли в почве надземная часть растений, семена которых были инокулированы клетками бактерий B. subtilis 26Д и 11ВМ была больше, чем у контрольных растений на 22 и 47%, соответственно.

У растений, обработанных суспензией клеток штамма B. subtilis 26Д, масса надземной части при тех же концентрациях NaCl была больше на 12.3, 33, 18.4, 13.3 и 6% соответственно, в сравнении с массой необработанных растений и выросших при тех же условиях. При обработке клетками B. subtilis 11ВМ ростовые показатели растений при действии солевого стресса достоверно не отличались от показателей у стрессированных неинокулированных растений.

Влияние соли на активность антиоксидантных ферментов, уровень МДА, содержание фенольных соединений. Анализ активности одного из антиоксидантных ферментов, каталазы, выявил, что у растений, инокулированных клетками B. subtilis 26Д и 11ВМ и выросших в почве без воздействия стрессового фактора, активность изначально была выше в данном эксперименте в 2.16 и 1.75 раза, соответственно, чем у неинокулированных растений (табл. 2).

Показатели активности каталазы у неинокулированных бактериями растений, выросших при различных концентрациях NaCl, были высокими по сравнению с контрольными растениями (выросшими в почве без соли) (табл. 2). Так, при внесении в почву NaCl в концентрации 3 г/кг почвы активность фермента увеличивалась в 1.8 раза, при 4 г/кг почвы – в 2.3 раза, при 5 г/кг – в 1.8 раза, при 6 г/кг почвы – в 1.7 раза.

При обработке семян клетками штамма B. subtilis 26Д активность каталазы в побегах была всегда выше в сравнении с необработанными растениями, растущими в чистой почве. Предобработка семян клетками штамма 11ВМ также приводила к увеличению активности каталазы в побегах в сравнении с контрольными растениями, однако стимуляция была менее выражена, чем при обработке B. subtilis 26Д.

Активность другого фермента, пероксидазы, в побегах неинокулированных бактериями растений с увеличением концентрации NaCl в почве возрастала (табл. 2). Так, при внесении в почву NaCl в концентрации 6 г/кг почвы активность фермента увеличивалась на 48.5%, по сравнению со значением у контрольных растений. У инокулированных бактериями B. subtilis 26Д растений, выросших в почве с содержанием 3 г и 4 г соли в кг, отмечалось увеличение активности пероксидазы.

Предобработка семян клетками штамма 11ВМ приводила к достоверному увеличению активности пероксидазы в побегах в сравнении с контрольными растениями лишь при действии соли в концентрации 4 г/кг почвы. При дальнейшем увеличении концентрации соли активность фермента снижалась – при 6 г NaCl в кг почвы вплоть до уровня в побегах контрольных растений, растущих в чистой почве.

Содержание МДА как у инокулированных, так и неинокулированных растений при засолении почвы возрастало так, что с увеличением концентрации соли повышался и уровень МДА (табл. 2). У неинокулированых клетками бактерий обоих штаммов растений уровень МДА при концентрации NaCl 3, 4, 5, 6 г/кг почвы повышался на 20.9, 44.7, 90.6 и 94.5% (в 1.94 раза), по сравнению с контрольными растениями, выросшими в почве без содержания соли.

У инокулированных клетками бактерий растений уровень МДА был ниже, чем у неинокулированных при тех же концентрациях соли. Так, у растений, инокулированных клетками бактерий B. subtilis 26Д, уровень МДА при концентрациях NaCl 3, 4, 5, 6 г/кг почвы был на 11.4, 11.4, 30.7 и 31.5% ниже, соответственно, чем у неинокулированных при той же концентрации. У растений, инокулированных клетками бактерий B. subtilis 11ВМ, уровень МДА при концентрации NaCl 3, 4, 5, 6 г/кг почвы был на 11.4, 7.6, 29.5 и 26.7% ниже, соответственно, чем у неинокулированных при той же концентрации.

Содержание фенольных соединений с увеличением содержания NaCl повышалось как у необработанных, так и обработанных бактериями растений (табл. 2). Так, у необработанных бактериями растений при концентрации NaCl 3, 4, 5, 6 г/кг почвы уровень фенольных соединений повышался на 16, 56, 68 и 27%, соответственно. У растений, обработанных клетками бактерий обоих штаммов, содержание фенольных соединений в побегах было достоверно больше лишь при росте растений в почве, содержащей 4 г/кг соли (штаммом 26Д – на 12%, штаммом 11ВМ – 15%), а при обработке клетками штамма 26Д и при концентрации 5 г/кг почвы по сравнению с контрольными растениями, выросшими в почве без содержания соли. При концентрации NaCl 6 г/кг почвы содержание фенольных соединений в побегах было примерно равно таковому у побегов растений, растущих в почве с минимальной концентрацией соли (3 г/кг).

Влияние соли на уровень пролина. Изменение содержания пролина увеличивалось по мере возрастания интенсивности солевого стресса (табл. 3). У необработанных бактериями растений при концентрации NaCl 3 и 4 г/кг почвы содержание пролина повышалось на 71–75.3%, а при 5 г/кг и 6 г/кг – в 2.5–2.7 раза, соответственно. У обработанных клетками B. subtilis 26Д растений уровень пролина, так же, как и у неинокулированных, повышался, однако достоверные отличия по сравнению с необработанными и выросшими в тех же условиях, были обнаружены при концентрации соли 5 г/кг и 6 г/кг, показатели были выше в среднем 1.2 раза. У растений, инокулированных бактерими B. subtilis 11ВМ уровень пролина в побегах при концентрации NaCl в почве 3, 4, 5, 6 г/кг был выше на 18.6 и 31.6%, в 1.4 раза и 1.3 раза, соответственно, чем у неинокулированных при тех же условиях.

Влияние соли на содержание калия и натрия в побегах растений. Увеличение концентрации NaCl в почве приводило к повышению содержания Na⁺ и уменьшению количества ионов К⁺ в побегах растений (табл. 4). У инокулированных бактериями растений, растущих в засоленной почве, содержание ионов Na⁺ в побегах было меньше, а ионов К⁺ – больше по сравнению с неинокулированными растениями. Так, у инокулированных клетками B. subtilis 26Д и 11ВМ растений при концентрации NaCl 3 г/кг почвы, содержание Na⁺ в побегах было меньше в среднем на 29.3%; при концентрации NaCl 4, 5, 6 г/кг почвы – на 26.7 и 9.2%; 34.5 и 27.3%; 28.1 и 10.5%, соответственно, в сравнении с необработанными.

Обработка семян клетками штамма 11ВМ практически не влияла на содержание калия в побегах, за исключением варианта с концентрацией соли 6 г/кг. У растений пшеницы, предварительно инокулированных бактериями B. subtilis 26Д, содержание калия в побегах при концентрации NaCl в почве 3, 4, 5, 6 г/кг было больше на 29.3, 25.6, 5.7, 34.6%, соответственно, чем у неинокулированных.

ОБСУЖДЕНИЕ

Наличие соли в почве вызывает значительные изменения физиологических и морфологических показателей растений [4, 7]. Засоление ведет к развитию осмотического стресса, во время которого растения сталкиваются с компромиссом между получением воды и риском обезвоживания клеток, что в конечном итоге подавляет рост и деление клеток [4]. В наших экспериментах подавление роста под действием соли наблюдалось как у необработанных растений, так и у обработанных бактериями B. subtilis. Более высокие показатели роста в условиях засоления у растений, инокулированных бактериями, по сравнению с неинокулированными, были отмечены только в отношении B. subtilis 26Д, хотя оба штамма проявляли ростостимулирующий эффект на незасоленной почве. Известно, что оба исследованных штамма продуцируют различные биологически активные вещества, в том числе и фитогормоны, способны улучшать минеральное питание растений, защищать от патогенов, стимулировать рост корней и побегов, повышая тем самым стрессоустойчивость растений [22, 23]. Повышенный рост инокулированных растений в контролируемой и стрессовой среде, скорее всего, связан с синтезом ИУК PGPB [4].

Наряду с осмотическим стрессом еще одним негативным эффектом засоления является генерация АФК, вызывающих окислительный стресс. Накопление АФК в цитоплазме растительных клеток увеличивает риск повреждения мембран клеток и органелл, снижает стабильность белков и нуклеиновых кислот. В растениях в ответ на стрессовый фактор активируются различные системы антиоксидантной защиты, в которых участвуют такие ферменты, как пероксидаза, каталаза и др [24, 25].

У растений, инокулированных бактериями, наблюдались повышенные активности каталазы и пероксидазы (особенно у штамма 26Д), вследствие чего такие растения испытывали меньший стресс в условиях засоления. Оба фермента, как известно, участвуют в удалении перекиси водорода, что уменьшает силу негативного ее влияния на рост растений через различные механизмы [1, 2].

Уровень малонового диальдегида у обработанных бактериями растений был ниже, чем у неинокулированных. Повышенное накопление МДА при солевом стрессе может быть связано с повреждением мембран солью [3, 4]. Бактеризация семян, таким образом, может способствовать, вероятно, сохранению целостности мембранных структур растительных клеток пшеницы.

Известно, что в условиях солевого стресса метаболизм модифицируется и осмопротекторы (например, пролин) накапливаются для поддержания ионного баланса в клетке [30 ] . Было обнаружено, что индуцированное солевым стрессом накопление пролина было значительно выше у инокулированных бактериями растений. Пролин, как известно, улучшает способность клеток удерживать воду, участвует в регулировании осмотического давления и обладает другими защитными функциями, не нарушая нормальный обмен веществ. Считается, что осмотически активные вещества помогают растениям противостоять экстремальному осмотическому стрессу на протяжении всего жизненного цикла растения, защищают белки и другие клеточные мембраны от различных стрессовых воздействий [7]. Исследования показали, что под влиянием клеток штамма 11ВМ при выращивании растений в условиях солевого стресса пролина накапливалось больше в надземной части пшеницы, чем под влиянием штамма 26Д. Егоршиной было показано, что обработка семян пшеницы клетками бактерий B. subtilis 26Д и 11ВМ приводит к увеличению содержания АБК в побегах растений, что и могло привести к увеличению уровня синтеза пролина, так как известно, что АБК участвует в регуляции синтеза пролина [23].

Фенольные соединения играют жизненно важную роль в устойчивости растений к абиотическими стрессам, как, например, антиоксиданты в виде сложных эфиров, флавоноидов и других веществ, а также способствуя балансу минеральных компонентов в некоторых растительных органах [20, 26].

В большинстве случаев хлорид натрия является основным солевым токсикантом, и его негативный эффект может наблюдаться в виде снижения продуктивности или гибели растений. Засоление почвы вызывает у растений осмотический и токсический стрессы. Устойчивость растительных организмов к таким неблагоприятным факторам, наряду с другими механизмами, связана, в том числе с уменьшением количества ионов Na⁺, поступающих в растение и оттока ионов K⁺ [1, 6, 9]. Установлено, что обработка растений бактериями в условиях засоления снижало поступление Na⁺ в побеги. Аналогичные результаты были получены при использовании в экспериментах и других видов бактерий [7]. Известно, что стимулирующие рост растений ризобактерии (PGPR) модулируют архитектуру корней, расширяя ризосферу, уменьшая долю негативно действующих ионов и помогая, тем самым, растению поддерживать ионное равновесие [24]. Известно, что бактерии B. subtilis, синтезируют гормоны и разнообразные органические кислоты. Спектр кислот, синтезируемых B. subtilis 11ВМ, более разнообразен, и бактерии этого штамма синтезируют их значительно больше, чем B. subtilis 26Д [23]. Наличие органических кислот, продуцируемых бактериями B. subtilis 11ВМ в ризосфере, может увеличивать степень диссоциации ионов, в том числе Na⁺, что наряду с некоторыми негативными процессами, например, усилением перекисного окисления липидов, косвенным свидетельством которому является накопление МДА, большее, чем при действии бактерий B. subtilis 26Д, могло повышать уровень ионов натрия, поступающих в растения, которые конкурировали с ионами калия, чем и может быть объяснен более низкий уровень содержания этого иона в побегах растений, инокулированных клетками штамма 11ВМ.

Таким образом, исследованные эндофитные штаммы B. subtilis 26Д и 11ВМ обладают хорошим потенциалом для адаптации растений к солевому стрессу, однако протекторный эффект у штамма 26Д выражен лучше, чем у 11ВМ. Исследованные эндофиты повышают активность антиоксиданых ферментов, снижают уровень МДА как продукта перекисного окисления липидов; повышают уровень фенольных соединений и пролина; уменьшают количество поступающих в ткани ионов натрия и могут быть применены для повышения устойчивости растений к солевому стрессу.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов. Настоящая статья не содержит каких-либо исследований с участием людей и животных в качестве объектов исследования.