Физиология растений, 2023, T. 70, № 5, стр. 506-513

ВВЕДЕНИЕ

Представители семейства Brassicaceae в целом характеризуются довольно высокой устойчивостью к тяжелым металлам, в том числе к цинку [1–3]. Более того, некоторые из них рекомендованы для использования в фиторемедиации загрязненных цинком территорий. Среди них в большей степени изучена горчица сарептская (Brassica juncea, род Brassica), которая, судя по литературным данным, не только хорошо адаптируется к загрязнению почвы цинком, но и накапливает металл в больших количествах в надземных органах [3–5]. Ряд авторов относят этот вид к гипераккумуляторам этого металла [3, 5]. Механизмы устойчивости растений B. juncea к высоким концентрациям цинка в окружающей среде активно изучаются. В частности, обнаружено, что при высоких концентрациях этого металла у B. juncea усиливается активность некоторых транспортных белков, в том числе, транспортирующих ионы цинка в вакуоль, белков-дегидринов [6], которые повышают металлоустойчивость растений за счет снижения интенсивности перекисного окисления липидов и защиты клеточных мембран [7] и возрастает содержание низкомолекулярных соединений [8]. Помимо этого выявлена важная роль антиоксидантной системы в адаптации растений этого вида к избытку цинка в корнеобитаемой среде [8–10].

В роде Sinapis, который филогенетически тесно связан с родом Brassica [11], также присутствуют виды, способные расти на загрязненных цинком почвах, в частности, горчица белая (Sinapis alba). Более того, растения этого вида могут накапливать металл в довольно больших количествах, хотя и не относятся к гипераккумуляторам, как B. juncea [12–14]. Вследствие этого, а также учитывая большую биомассу горчицы белой, в последнее время повысился интерес к ней как к перспективной для фиторемедиации культуре. К настоящему времени выявлены даже некоторые механизмы устойчивости S. alba к высоким концентрациям цинка. Так, показано, что растения этого вида имеют высокий уровень экспрессии генов, кодирующих металлотионеины [15] и транспортные белки [16], что, вероятно, способствует их успешному росту в условиях повышения содержания этого металла в почве. Однако в целом устойчивость S. alba к тяжелым металлам изучена в гораздо меньшей степени, чем B. juncea.

Известно, что одним из важных механизмов устойчивости растений к стресс-факторам различной природы является активизация компонентов антиоксидантной системы, направленная на снижение количества активных форм кислорода и предотвращение развития окислительного стресса. При избытке цинка в окружающей среде у растений, как правило, повышается активность ряда антиоксидантных ферментов, в том числе, супероксиддисмутазы (СОД), каталазы (КАТ), аскорбатпероксидазы (АПО), гваяколяпероксидазы, глутатионредуктазы и увеличивается количество неферментных антиоксидантов, таких, например, как пролин, аскорбат, глутатион и др. [5, 17]. Что касается вклада антиоксидантной системы в устойчивость растений семейства Brassicaceae к высокому содержанию цинка, данных относительно немного, и они носят противоречивый характер. Например, у B. napus при воздействии цинка в концентрациях 50, 150 и 300 мкМ активность СОД возрастала [10], тогда как у этого же вида при схожих концентрациях этого металла (70, 140 и 280 мкМ) она не изменялась [18]. Активность КАТ у B. rapa и B. chinensis при использовании цинка в концентрации 200 мкМ возрастала [19, 20], а у B. napus сохранялась неизменной даже при более высокой концентрации металла (280 мкМ) [18].

Учитывая, что реакции разных видов растений семейства Brassicaсеае на повышение концентрации цинка различны [10, 21], целью настоящего исследования было сравнительное изучение влияния избытка этого металла в корнеобитаемой среде на активность компонентов антиоксидантной системы у растенийB. juncea и S. alba.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Исследования проводили на растениях горчицы сарептской (Brassica juncea L. (Сzern.)) сорта Славянка и горчицы белой (Sinapis alba L.) сорта Бельгия. Семена были предоставлены Отделом генетических ресурсов масличных и прядильных культур Федерального исследовательского центра “Всероссийский институт генетических ресурсов растений им. Н.И. Вавилова”.

Растения выращивали в условиях вегетационного опыта в сосудах с песком объемом 0.8 л. Плотность посева составляла 10 растений на сосуд. В опыте использовали промытый водой и прокаленный песок. Цинк в субстрат добавляли перед началом опыта в виде его сернокислой соли (ZnSO₄ · 7H₂O) в концентрации 5 (контроль), 50, 100 или 150 мг/кг субстрата. Полив осуществляли питательным раствором Хогланда-Арнона (1/2 концентрации), не содержащим ионы цинка.

О влиянии избытка цинка на растения судили спустя 21 сут от посева по изменению (по отношению к контролю) показателей роста побега (высота, сырая и сухая биомассы), интенсивности перекисного окисления липидов (ПОЛ), активности ключевых антиоксидантных ферментов (СОД, КАТ и ГвПО) и содержанию неферментных антиоксидантов (пролин, каротиноиды). Помимо этого, определяли содержание цинка в побегах растений.

Для измерения ростовых показателей использовали общепринятые методы. Интенсивность ПОЛ в листьях оценивали по накоплению МДА, содержание которого определяли по его способности реагировать с тиобарбитуровой кислотой, образуя окрашенный комплекс [22]. Оптическую плотность измеряли при 532 и 600 нм.

Для определения активности антиоксидантных ферментов навеску листьев 0.4 г гомогенизировали в 2 мл буфера (pH 7.5), который включал: HEPES (50 мМ), MgCl₂ (5 мМ), ЭДТА (0.4 мМ), ДТТ (3 мМ), PMSF (1 мМ), PVP (1%), глицерол (10%), после чего гомогенат центрифугировали 20 мин при 4°С и 14 000 g. Активность СОД определяли методом, основанным на способности фермента ингибировать фотохимическое восстановление нитросинего тетрозолия [23], с модификацией [24]. Оптическую плотность измеряли при 560 нм. Активность КАТ определяли по ферментативному разложению пероксида водорода при 240 нм [24, 25]. Динамику изменения оптической плотности наблюдали в течение 5 мин, когда зависимость активности КАТ от времени была линейная. Об активности гваякол-спецефичной пероксидазы (ГвПО) судили по увеличению оптической плотности при 470 нм в результате окисления гваякола до тетрагваякола в присутствии пероксида водорода [24, 26]. Содержание белка определяли по методу Бредфорда [27], используя в качестве стандарта бычий сывороточный альбумин.

Содержание пролина определяли методом Бейтса с соавт, основанного на реакции пролина с нингидрином с образованием окрашенного комплексного соединения [28]. Каротиноиды экстрагировали 80% ацетоном, их содержание рассчитывали по формулам D. Wettstein [29].

Содержание МДА, пролина и каротинодов и активность антиоксидантных ферментов определяли на спектрофотометре СФ-2000 (“Спектр”, Россия).

Анализ содержания цинка в побегах растений проводился масс-спектрометрическим методом с использованием ICP-MS (“Aligent”, США) с предварительным разложением образцов в растворе кислот HNO₃ : HCl (4 : 1) в системе микроволнового разложения Berghof Speedwave Xpert Microwave Digestion System. Представленные в табл. 2 значения являются результатом анализа смешанной пробы (n = 27). Погрешность измерений (±Δ) рассчитывали по формулам согласно сертифицированной методике [30].

Повторность в пределах одного варианта опыта 3–6 кратная, опыт повторяли не менее 3 раз. Нормальность распределения проверяли с помощью критерия Шапиро-Уилка. В случае нормального распределения (ростовые показатели и содержание МДА) статистическую значимость между средними значениями устанавливали с помощью критерия Стьюдента. Достоверность различий между вариантами опыта по содержанию цинка в побегах растений выявляли с использованием метода наименьших квадратов (LSD_0.05). Когда распределение отличалось от нормального (активность ферментов) использовали непараметрический критерий Манна–Уитни. Данные на графиках и в таблицах представлены в виде средних арифметических значений и их стандартных ошибок (при P < 0.05).

РЕЗУЛЬТАТЫ

Проведенные исследования показали, что у растений B. juncea торможение роста побега наблюдалось уже при концентрации цинка 50 мг/кг субстрата. Дальнейшее повышение концентрации металла вызывало более сильный ингибирующий эффект на высоту побега и накопление биомассы. У S. alba рост побега замедлялся при использовании цинка в более высоких концентрациях (100 и 150 мг/кг субстрата) (табл. 1). Однако при наибольшей концентрации металла (150 мг/кг субстрата) у S. alba высота побега и сырая биомасса оказались более, чем в 3.5 и 4.5 раза, соответственно, меньше, чем в контроле, тогда как у B. juncea – менее, чем в 3 раза.

Как известно, ответная реакция растений на избыток цинка во многом зависит от его содержания в органах. В наших исследованиях содержание цинка в побегах обоих видов возрастало с увеличением концентрации металла в субстрате. При этом в побегах S. alba оно оказалось выше, чем у B. juncea, в том числе и при оптимальной концентрации металла в субстрате (5 мг/кг) (табл. 2).

Несмотря на высокие концентрации цинка в надземных органах, увеличения интенсивности ПОЛ у B. juncea не наблюдалось, о чем свидетельствует отсутствие изменений в содержании МДА даже при наиболее высокой концентрации металла. В отличие от этого у S. alba отмечено накопление МДА при 100 и 150 мг/кг цинка в субстрате (табл. 3), показывающее усиление интенсивности ПОЛ и развитие окислительного стресса.

Отсутствие изменений окислительно-восстановительного баланса клеток в стрессовых условиях может свидетельствовать об устойчивости растений к данному стрессору и/или об эффективной работе компонентов антиоксидантной системы растений. Изучение активности антиоксидантных ферментов у двух представителей семейства Brassicaсеае выявило, что ее изменение в значительной степени зависит от вида растений. Так, в условиях цинкового стресса активность СОД у растений B. juncea не изменялась (по сравнению с контролем) ни при одной из изученных концентраций металла (рис. 1а). В отличие от этого, у растений S. alba она возрастала (на 34% по сравнению с контролем) уже в присутствии металла в концентрации 50 мг/кг субстрата и при дальнейшем усилении стрессовой нагрузки сохранялась на этом же уровне.

Рис. 1.

Активность CОД (а), КАТ (б), ГвПО (в) в листьях 1 – B. juncea сорт Славянка и 2 – S. alba сорт Бельгия, при разных концентрациях цинка в субстрате. Разными латинскими буквами отмечены статистически значимые различия между средними значениями при P < 0.05.

Активность КАТ у растений B. juncea повышалась в присутствии цинка в концентрациях 50 и 100 мг/кг субстрата (на 28 и 14% по сравнению с контролем соответственно), однако дальнейшее увеличение концентрации (до 150 мг/кг субстрата) вызывало резкое снижение этого показателя. У растений S. alba независимо от концентрации металла в субстрате увеличения активности фермента не происходило (рис. 1б).

Активность ГвПО у обоих видов растений возрастала (по сравнению с контролем) уже в присутствии цинка в концентрации 50 мг/кг субстрата. При этом у B. juncea она повышалась в 1.5 раза по сравнению с контролем и при дальнейшем увеличении концентрации металла сохранялась практически неизменной. У S. alba активность фермента возрастала при использовании цинка в концентрациях 50 и 100 мг/кг субстрата в 6 и 9 раз соответственно, не изменяясь в дальнейшем (рис. 1в).

Важно также отметить, что в оптимальных условиях минерального питания (5 мг/кг субстрата) активность КАТ и ГвПО у растений B. juncea была гораздо выше, чем у S. alba.

Помимо антиоксидантных ферментов в защите клеток от избыточных количеств АФК большую роль играют неферментные компоненты АОС. Нами обнаружено, что у обоих изученных видов растений с увеличением концентрации цинка в субстрате возрастает содержание пролина в листьях, причем в большей степени у S. alba (табл. 4). Так, при наибольшей концентрации металла (150 мг/кг субстрата) у B. juncea оно повышалось в 2 раза по сравнению с контролем, а у S. alba – более, чем в 3 раза. Увеличения содержания каротиноидов у обоих видов в этих условиях не наблюдалось. Наоборот, оно снижалось у B. juncea на 28% по сравнению с контролем при использовании цинка в концентрации 150 мг/кг субстрата, а у S. alba – на 54%.

ОБСУЖДЕНИЕ

Хорошо известно, что цинк в высоких концентрациях негативно сказывается на физиологических процессах у растений и снижает их продуктивность [5, 31]. Однако некоторые виды из семейства Brassicaсеае, в том числе B. juncea и S. alba, способны адаптироваться к высоким концентрациям этого металла в окружающей среде, что обеспечивается наличием у них механизмов, действующих на разных уровнях организации. Одним из важных механизмов металлоустойчивости растений является активизация в стрессовых условиях антиоксидантной системы, направленной на ликвидацию избыточных количеств активных форм кислорода в клетке [17, 31].

В целом ряде исследований показано, что при избытке цинка у растений семейства Brassicaceae заметно усиливается интенсивность ПОЛ, свидетельствуя о развитии окислительного стресса [10, 14, 31]. Однако в наших опытах у B. juncea повышения (по отношению к контролю) содержания МДА не было обнаружено ни при одной из изученных концентраций металла несмотря на высокую (150 мг/кг) концентрацию металла в побегах, что, очевидно, можно объяснить высокой устойчивостью растений этого вида к цинку (табл. 2, 3). В отличие от этого, в листьях S. alba наблюдалось усиление интенсивности ПОЛ при воздействии цинка в концентрациях 100 и 150 мг/кг субстрата. При этом содержание металла в надземной биомассе было выше, чем у B. juncea (табл. 2, 3). В ряде работ показаны сходные данные по изученным видам. Так, у растений B. juncea интенсивность ПОЛ практически не изменялась даже при концентрации цинка 500 мкМ [10, 32], тогда как у S. alba при концентрации металла 200 мкМ наблюдалось значительное повышение количества МДА [14].

Известно, что важную роль в защите клеток от избыточных количеств активных форм кислорода играют антиоксидантные ферменты, в том числе СОД, КАТ и ГвПО. Так, утилизация супероксид-радикала осуществляется в реакции дисмутации при участии ферментов СОД, которые в клетках представлены тремя изоформами: Cu/Zn-СОД, Mn-СОД и Fe-СОД [10]. При увеличении содержания анион-радикала в стрессовых условиях активность СОД, как правило, увеличивается. В наших опытах у B. juncea повышения активности СОД не было обнаружено даже при высоких концентрациях цинка в корнеобитаемой среде (рис. 1а). Аналогичные данные были получены и другими авторами при концентрации металла 50 и 300 мкМ [4, 10]. Подобный эффект может быть связан с отсутствием количества субстрата, необходимого для работы фермента, поскольку, судя по отсутствию изменений ПОЛ, значительного повышения содержания АФК (в том числе, супероксид радикала) в клетках не происходило. Кроме того, при сохранении неизменной общей активности СОД, могут изменяться активности разных ее изоформ. Например, у B. juncea при концентрации цинка в субстрате 300 мкМ активность Cu/Zn-СОД повышалась, тогда как активность Mn-СОД и Fe-СОД при этом снижалась [10], что, по мнению авторов, обусловлено дефицитом марганца и железа, наблюдаемого при избытке цинка. У S. alba общая активность СОД возрастала (рис. 1а). Поскольку, у растений этого вида в клетках листа развивался окислительный стресс, о чем можно судить по содержанию МДА (табл. 3), усиление активности фермента было направлено на ликвидацию избыточных количеств анион-радикала.

Функция КАТ как антиоксидантного фермента состоит в разложении перекиси водорода с выделением молекулярного кислорода. В ряде работ показано, что у B. juncea при избытке цинка активность КАТ повышается, например, при использовании металла в концентрации 1500 и 2000 мкМ [4, 10]. В наших опытах активность КАТ у растений этого вида также возрастала при концентрациях металла 50 и 100 мг/кг субстрата (рис. 1б). Поскольку активность СОД в этом варианте опыта не изменялась, повышение количества Н₂О₂ и, как следствие, увеличение активности КАТ, могло быть связано с усилением активности других ферментов, например, оксалатоксидазы, аминоксидаз и некоторых пероксидаз, проявляющих оксидазную активность [33].

Важно отметить, что у S. alba, несмотря на повышение активности СОД, увеличения активности КАТ не происходило (рис. 1б). Наоборот, отмечалось некоторое ее снижение (по сравнению с контролем). Аналогичный эффект в листьях растений S. alba наблюдали также при концентрации цинка 500 и 1000 мг/кг субстрата, при которых двукратное повышение интенсивности ПОЛ сопровождалось снижением активности КАТ [14]. Возможно, это связано с тем, что определенный пул пероксида водорода должен поддерживается в клетке, поскольку Н₂О₂ играет важную роль в сигналинге [17, 33], а также участвует в лигнификации клеточных стенок [34], что является одним из механизмов адаптации растений к избытку цинка.

В детоксикации избытка перекиси, образуемой у S. alba в ходе реакции дисмутации, вероятно, участие принимал другой фермент – ГвПО, увеличение активности которого было обнаружено уже при концентрации металла 50 мг/кг субстрата (рис. 1в). Однако активность этого фермента повышалась и у B. juncea (рис. 1в), что отмечалось и другими авторами, например, при концентрации цинка 5000 и 10000 мкМ [9] и у B. rapa при содержании цинка в почве 30 мг/кг [35]. Увеличение активности ПО при отсутствии изменений или даже снижении активности КАТ, возможно, является следствием более высокого сродства этого фермента к субстрату (Н₂О₂), по сравнению с КАТ.

Важно также отметить, что у B. juncea в оптимальных условиях минерального питания активность КАТ и ПО была значительно выше, чем у S. alba (рис. 1б, в). Аналогичные сведения указаны также в работах других авторов, которые показали, что растения с более высокой активностью антиоксидантных ферментов в отсутствии воздействия тяжелых металлов оказались более устойчивы к повышению их уровня в окружающей среде, что связано с лучшей защитой клеток от окислительного стресса [36, 37].

Известно, что при воздействии цинка в высоких концентрациях у растений усиливается активность неферментных компонентов АОС [30]. В частности, у B. juncea в условиях избытка металла (200 мг/кг субстрата) отмечено увеличение содержания пролина, что коррелировало с образованием в клетке свободных радикалов [8]. В ответ на обработку цинком в концентрации 2000 мкМ увеличивалось содержание пролина у B. napus [38]. В наших исследованиях цинк в концентрациях 50, 100 и 150 мг/кг субстрата также приводил к накоплению пролина в листьях B. juncea и S. alba (табл. 4). Поскольку известно, что пролин, среди прочего, обладает антиоксидантным эффектом и способен снижать содержание АФК [5], увеличение его содержания у обоих видов растений отчасти способствовало сохранению окислительно-восстановительного равновесия в клетках. Функцией нейтрализации АФК обладают также каротиноиды. Однако в большинстве случаев при воздействии цинка наблюдается снижение их содержания [5, 17, 30]. В наших опытах у B. juncea и S. alba содержание каротиноидов также уменьшалось в присутствии цинка в высоких концентрациях, причем в большей степени у S. alba (табл. 4). Ингибирующее действие избытка цинка на содержание пигментов, возможно, связано с некоторыми изменениями (нарушениями) в фотосинтетическом аппарате, например, с торможением их синтеза или нарушением работы фотосистемы II, что было обнаружено у B. chinensis и B. alboglabra [39]. Это могло быть также одной из причин торможения роста растений и уменьшения накопления ими биомассы в стрессовых условиях.

В целом, растения B. juncea и S. alba способны расти при избытке цинка в субстрате и при этом накапливать его в листьях в высоких концентрациях. Этому во многом способствует увеличение активности антиоксидантных ферментов и пролина, направленное на сохранение окислительно-восстановительного баланса клеток. При этом более высокая активность ферментов КАТ и ГвПО у растений B. juncea в отсутствии действия цинка и дальнейшее ее увеличение при возрастании концентрации металла в субстрате, а также увеличение содержания пролина способствовало сохранению интенсивности ПОЛ на уровне контроля. У растений S. alba повышение активности СОД и ПО, а также увеличение содержания МДА при воздействии цинка в концентрациях 100 и 150 мг/кг субстрата свидетельствует о развитии окислительного стресса в условиях избытка металла в субстрате. Меньшее снижение показателей роста побега у B. juncea по сравнению с S. alba позволяет сделать вывод о большей устойчивости растений этого вида к цинку в изученных концентрациях.

Настоящая статья не содержит каких-либо исследований с участием людей в качестве объектов исследований. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Исследование выполнено за счет гранта Российского научного фонда (проект № 22–24–00668). В работе использовано оборудование Центра коллективного пользования Федерального исследовательского центра “Карельский научный центр Российской академии наук”.