Генетика, 2019, T. 55, № 2, стр. 234-238

Высокая скорость эволюции симбиотических бактерий, с одной стороны, определяется отбором и дрейфом генов на стадии симбиоза с растением-хозяином, а с другой – пластичностью микробных геномов [1]. Для изучения закономерностей и механизмов эволюции симбиотических (sym) генов мы использовали в качестве модели клубеньковые бактерии Neorhizobium galegae, азотфиксирующие симбионты козлятника – рода многолетних травянистых бобовых, включающего два вида: козлятник восточный (Galega orientalis) и лекарственный (G. officinalis). Вид N. galegae разделяют на два биотипа – bv. orientalis и bv. officinalis, фиксирующие азот в симбиозе только с растениями “своего” вида, а при инокуляции гетерологичного хозяина образующих клубеньки, не способные фиксировать азот [2]. В связи с этим логично предположить, что дивергенция bv. orientalis и bv. officinalis по генам N₂-фиксации (nif/fix) должна быть выражена сильнее, чем по генам образования клубеньков (nod). Для проверки этого предположения мы изучили нуклеотидный полиморфизм двух групп генов: симбиотические гены (sym-группа, включая гены клубенькообразования и азотфиксации) и группу генов домашнего хозяйства в качестве референсной группы. Группа sym включает гены, которые экспрессируются только при взаимодействии с хозяевами и локализированы на плазмиде. Гены второй группы (референс) отвечают за разнообразные клеточные функции (в основном это – хромосомные гены “домашнего хозяйства”) и специфически не связаны с симбиозом.

Мы секвенировали полные геномы 11 штаммов Neorhizobium galegae (6 – bv. officinalis, 5 – bv. orientalis). Эти штаммы выделены в Северокавказском регионе, в котором G. orientalis характеризуется гораздо большим морфологическим и эколого-генетическим разнообразием, чем G. officinalis (Северный Кавказ является центром происхождения для G. orientalis [3]). Геномы штаммов Ng37 (bv. officinalis) и Ng87 (bv. orientalis) секвенированы с помощью технологии PacBio. Последовательности этих штаммов использовали в качестве референсов. Остальные штаммы (Ng35, Ng46, Ng47, Ng58, Ng77, Ng110, Ng35*, Ng77*, Ng110* [2, 3]) секвенировали с помощью технологии shotgun на приборе MiSeq Illumina. Сборку последовательностей проводили с помощью программы CLC Genomic Workbench. Данные, полученные с помощью технологии PacBio, собирали с помощью HGAP (Hierarchical Genome Assembly Process). Аннотацию геномов проводили с помощью сервера RAST (http://rast.nmpdr.org/). Выравнивание нуклеотидных последовательностей, вычисление нуклеотидного полиморфизма и стандартных ошибок осуществляли с помощью программы MEGA5.1.

Статистический анализ проводили с использованием конкатенатов всех генов в каждом из исследуемых участках. Последовательности выравнивали, а затем определяли величину нуклеотидного полиморфизма (p-distance) и его стандартные ошибки в программе MEGA5.1. Вероятность нулевых гипотез об отсутствии различий по уровню полиморфизма между биотипами ризобий или группами геном (P0) рассчитывали с помощью функции СТЬЮДЕНТ.РАСП.2Х (MS Excel), с помощью полученных в тесте Уэлша значений t-критерия и чисел степеней свободы (различия считали значимыми при P₀ не более 0.05).

Для сравнительного анализа были выбраны три несцепленных участка бактериального генома – два хромосомных и плазмидный. Один из хромосомных участков имел длину 10 тпн и содержал 12 генов, а другой имел длину 11 тпн и содержал девять генов. Гены в этих участках выполняют разнородные функции “домашнего хозяйства”, включая образование клеточной стенки, контроль деления и метаболизма клеток. Симбиотический регион, расположенный на Sym-плазмиде, содержит 26 генов, функционирующих только в ассоциации с растением. Эти гены определяют два признака: образование клубеньков (nod) и фиксацию азота (nif/fix), т.е. они функционально более однородны, чем “несимбиотические” гены. Размер этого участка у изученных штаммов варьирует, составляя в среднем 32 тпн.

После выравнивания последовательностей для каждого из генов был проведен анализ нуклеотидного полиморфизма. Оказалось, что нуклеотидный полиморфизм как симбиотических, так и несимбиотических генов у bv. orientalis выше, чем у bv. officinalis (табл. 1; рис. 1,а, б). На филогенетических деревьях эти биотипы образуют два статистически различающихся (bootstrap 100%) кластера (данные не приводятся). Таким образом, наиболее разнообразному растению-хозяину соответствует наиболее разнообразный симбионт, что согласуется с ранее полученными результатами анализа геномных AFLP-фингерпринтов [2, 3].

Рис. 1.

Сравнительный анализ нуклеотидного полиморфизма (p-distance) симбиотических и несимбиотических генов ризобий козлятника Neorhizobium galegae. a – несимбиотические (хромосомные) гены; б – симбиотические (плазмидные) гены; в – дивергенция биотипов ризобий козлятника (bv. orientalis и bv. officinalis) по величине p-distance для разных групп генов (1 – несимбиотические, 2 – гены образования клубеньков, 3 – гены N₂-фиксации). Бары над столбиками обозначают стандартные ошибки. Достоверность различий оценивали тестом Уэлша (значение t-критерия Стъюдента при сравнении генов клубенькообразования и N₂-фиксации составило 26.954; Р₀ < 0.01).

“Несимбиотические” гены продемонстрировали более низкий уровень нуклеотидного полиморфизма, чем симбиотические гены (табл. 2). Среди несимбиотических генов наиболее консервативными оказались гены рибосомного протеина (S70EA) и протеина, связанного с делением MraZ [4]. Среди sym-генов самыми консервативными оказались общие nod-гены (nodABC) и структурные гены нитрогеназы nifHDK, которые кодируют наиболее консервативные компоненты симбиоза. Наибольший полиморфизм обнаружен в генах fixB, fixC, fixX, которые являются гомологами электрон-транспортной цепи митохондрий [5]. Высокий полиморфизм обнаружен в гене nodU, кодирующем 6-О-карбамоилтрансферазу, модифицирующую Nod-фактор [6].

Важно отметить, что bv. orientalis превосходит bv. officinalis по размаху варьирования (коэффициентам вариации) уровней полиморфизма симбиотических генов, но уступает ему по размаху варьирования полиморфизма sym-генов (табл. 2). Данное явление может быть связано с разной экологической стратегией этих биотипов ризобий в Северокавказском регионе, который является центром происхождения и разнообразия именно для козлятника восточного [3]. В частности, можно предположить, что у симбионтов козлятника восточного (G. orientalis) взаимодействие с хозяевами занимает большую часть жизненного цикла, чем у симбионтов козлятника лекарственного (G. officinalis), распространение которого в Северокавказском регионе ограничено.

Крайне интересная тенденция прослеживается при анализе различий между bv. orientalis и bv. officinalis по разным группам генов: наибольшая дивергенция биотипов наблюдается по генам фиксации азота (nif/fix), тогда как по nod-генам различия между биотипами минимальные (рис. 1,в). Эти данные согласуются с фенотипическими различиями биотипов, выявляемыми при перекрестной инокуляции, указывая на ключевую роль хозяин-специфичной N₂-фиксации в дивергентной эволюции вида N. galegae. Ранее было показано, что для биотипов вида Rhizobium leguminosarum характерна значительная дивергенция по генам клубенькообразования, связанная с тем, что bv. viciae образует клубеньки на вике, горохе и чине, а bv. trifolii – на клевере, тогда как перекрестная инокуляция между ними не приводит к образованию клубеньков [7]. Четких различий этих биотипов по генам домашнего хозяйства выявлено не было [8]. Поэтому можно предположить, что генетические механизмы дивергентной эволюции у видов R. leguminosarum и N. galegae существенно различаются.

Работа поддержана грантом РНФ 14-26-00094П и проводилась с использованием оборудования ЦКП “Геномные технологии, протеомика и клеточная биология” ФГБНУ ВНИИСХМ. Геномное секвенирование было выполнено в ЦКП “Геномика” СО РАН (ИХБФМ СО РАН, Новосибирск).