Генетика, 2019, T. 55, № 9, стр. 1064-1070

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Исследование одобрено биоэтическим комитетом ФГБНУ МГНЦ (протокол № 5/1 от 09.02.2015).

Выборка и исследуемый материал. Исследование проведено на материале ткани АМЛ и периферической крови пациентов с клиническим диагнозом “спорадическая ангиомиолипома почки”, предоставленных НИИ уронефрологии и репродуктивного здоровья человека Первого МГМУ им. И.М. Сеченова. Соотношение мужчин и женщин составило 1 : 19 соответственно, возраст пациентов варьировал от 31 до 72 лет.

Принадлежность исследуемых опухолей к АМЛ была подтверждена гистологически, материал получен при помощи лапароскопической резекции, микродиссекцию образцов не выполняли. После резекции ткань АМЛ хранили при температуре –20°С.

Для поиска соматических мутаций использовали опухолевую ткань, для подтверждения соматического статуса выявленных генетических вариантов проводили их валидацию на материале ДНК лимфоцитов периферической крови.

Выделение ДНК из свежезамороженной ткани и периферической крови проводили с помощью стандартного протокола фенол-хлороформной экстракции.

Подготовка библиотек и их секвенирование. Для мутационного профилирования сАМЛ почки использовали панель праймеров Ion AmpliSeq Comprehensive Cancer Panel (ThermoFisher, США), покрывающую экзоны и фланкирующие их участки интронов 409 генов, участвующих в опухолеобразовании.

Для создания библиотек фрагментов ДНК использовали набор Ion AmpliSeq Library Kit 2.0 (ThermoFisher, США). Клональную эмульсионную ПЦР проводили с помощью системы Ion Chef, секвенирование проводили на приборе Ion S5 согласно протоколу производителя (ThermoFisher, США).

Анализ данных. Результаты секвенирования анализировали с использованием программного обеспечения Torrent Suite в составе: Base Caller (преобразование сигнала в нуклеотидную последовательность); Torrent Mapping Alignment Program – TMAP (выравнивание последовательностей на референсный геном, сборка GRCh37 – hg19, NCBI); Variant Caller (поиск отличий анализируемых последовательностей от референсного генома).

Распространенные генетические полиморфные варианты отсеивали на основании данных о популяционной частоте, представленных в базах данных gnomAD и ExAC [9] с использованием программного обеспечения ANNOVAR [10].

Для оценки клинической значимости генетических вариантов использовали базы данных LOVD [11], HGMD [12] и ClinVar [13].

Визуальный анализ данных и ручную фильтрацию артефактов секвенирования осуществляли с использованием программы Integrative Genomics Viewer – IGV [14].

Анализ потери гетерозиготности в генах TSC1 и TSC2 проводили по алгоритму Dubbink et al. [15], адаптированному к используемому протоколу NGS [16]. Для оценки аллельного дисбаланса использовали полиморфные генетические варианты в участках с глубиной прочтения не менее 150×.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

В результате секвенирования 20 образцов сАМЛ почки нами были выявлены патогенные соматические мутации в гене TSC2 в 13 случаях (65%), в 4 образцах (20%) патогенные мутации были локализованы в других генах, в 3 случаях (15%) не было зарегистрировано генетических вариантов, способных иметь отношение к фенотипу (табл. 1).

Высокая встречаемость мутаций в гене TSC2 (65%) хорошо коррелирует с международными данными. Однако в различных исследованиях частоты встречаемости тех или иных типов мутаций различны. Так, в исследовании Giannikou et al. [8] наиболее часто встречаются нонсенс-мутации (7), а в исследовании Qin et al. [7] – короткие делеции (6). В исследуемой нами выборке наиболее часто встречающимися мутациями в гене TSC2 являются делеции (рис. 1).

Рис. 1.

Распределение мутаций в гене TSC2 по типу в исследуемой выборке в сравнении с результатами Giannikou et al. [8] и Qin et al. [7]. АД – аллельный дисбаланс.

В образцах № 4, 7, 9 и 17 нами было обнаружено второе мутационное событие в рамках двухударной модели опухолеобразования для гена TSC2 в виде аллельного дисбаланса. В итоге биаллельная инактивация гена TSC2 подтверждена в семи случаях.

В отличие от предыдущих исследований нами впервые определены мутации в генах SETD2, PDGFRA и STK36 в опухолевом материале ангиомиолипом почки при отсутствии мутаций в генах TSC2 или TSC1, а также в генах SYNE1, PIK3CD, NF1, TOP1, ITGB3 в образцах с наличием только одной мутации гена TSC2.

Образец № 3 содержал мутации в двух генах – PDGFRA и STK36. Ген PDGFRA кодирует тирозинкиназный рецептор, участвующий во взаимосвязанных сигнальных путях Ras/MAPK и PI3K/akt/mTOR (рис. 2), регулирующих фундаментальные клеточные функции, такие как транскрипция, трансляция, пролиферация, рост и выживаемость клеток [17]. Мутации в гене PDGFRA часто встречаются при потенциально злокачественных (гастроинтестинальные стромальные опухоли), а также при доброкачественных (фиброзные полипы) новообразованиях [18–20].

Рис. 2.

Сигнальные пути, в которые вовлечены гены PDGFRA, MET и STK36.

Продукт гена STK36 является членом семейства серин-треонинпротеинкиназ, участвующим в регуляции пролиферации и ангиогенеза через сигнальный путь hedgehog, опосредовано приводящим к активации транскрипционных факторов семейства GLI (GLI1, GLI2, GLI3) [21, 22] (рис. 2).

В отличие от белков PDGFRA и STK36, SETD2 не относится к классу протеинкиназных рецепторов и кодирует белок метилтрансферазу гистонов, который триметилирует гистон H3K36. Инактивирующие мутации SETD2 коррелировали со снижением метилирования H3K36 в материале светлоклеточного рака почки [23]. Потеря функции SETD2 может приводить к геномной нестабильности, что является одним из признаков рака.

В образцах № 4 и 7, в которых зафиксирована биаллельная инактивация гена TSC2, были также обнаружены “пассажирские” мутации в генах SYNE1, PIK3CD, NF1 и TOP1, ITGB3 соответственно. Моноаллельная инактивация гена TSC2 была зафиксирована в образцах № 5, 8, 10, 12, 16, 20.

В образцах № 13 и 18, в которых не выявлено ни одного мутационного события для гена TSC2, нами были определены мутации других генов, позволившие уточнить первичный клинико-морфологический диагноз.

У пациента № 13 методами лучевой и ультразвуковой диагностики (МСКТ с контрастированием, УЗИ, МРТ) были выявлены двусторонние опухоли почек со степенью дедифференцировки T1aN0M0, одна из которых была подвержена лапароскопической резекции по достижении диаметра 40 мм.

Синхронные ангиомиолипомы почек в подавляющем большинстве случаев ассоциированы с туберозным склерозом, однако также могут наблюдаться и спорадически, хотя и редко [24]. Лапароскопическая резекция опухоли у пациента № 13 была проведена только для одной опухоли, достигшей размеров 4 см, так как АМЛ размером более чем 4 см включительно имеют тенденцию к более быстрому росту, что может привести к угрожающему жизни состоянию пациента [25]. Гистология показала присутствие большого количества жировых клеток в препарате, что соответствует картине ангиомиолипомы почки.

Проведенное нами генотипирование образца опухолевого материала выявило мутацию CDC73:c.G3A:p.M1I в гомозиготном состоянии при отсутствии каких-либо молекулярных событий, инактивирующих ген TSC2. В образце периферической крови того же пациента мутация CDC73:c.G3A:p.M1I выявлена в гетерозиготном состоянии. Ген CDC73 (также известен как HRPT2) кодирует белок парафибромин, который вовлечен в регуляцию транскрипции и является супрессором опухолевого роста. Мутации в гене CDC73 ассоциированы с наследственными опухолевыми синдромами – семейным изолированным гиперпаратиреозом, карциномой паращитовидной железы и синдромом гиперпаратиреоза с опухолью челюсти. У 20% носителей мутации CDC73 развиваются кисты и гамартомы почек.

В образце № 18, где также отсутствовали мутационные события в генах TCS1/TSC2, нами была найдена мутация c.G406A:p.V136I в гене МЕТ в гетерозиготном состоянии. Ген МЕТ является протоонкогеном и соответственно активация одного аллеля укладывается в картину возникновения опухоли. Активирующие мутации в гене MET ассоциированы со злокачественными опухолями почки, наиболее часто – с папиллярным раком. Несмотря на то, что классическая ангиомиолипома состоит из трех компонентов – кровеносных сосудов, гладких мышц и жировых клеток, известны случаи, когда АМЛ почки содержит малое количество жировой ткани, тем самым мимикрируя злокачественный рак почки или наоборот [26, 27].

Таким образом, в двух случаях широкое генотипирование образцов опухолей почки, имевших первичный клинико-морфологический диагноз сАМЛ, позволило уточнить диагноз и диагностировать в одном случае злокачествнную опухоль, а в другом – доброкачественную, входящую в симптомокомплекс наследственного опухолевого синдрома, ассоциированного с герминальными мутациями CDC73.

Из 18 образцов, для которых генотипирование по 409 генам, вовлеченным в опухолеобразование, не исключило диагноз сАМЛ, биалелльная инактивация гена TSC2 выявлена в семи (39%), что согласуется с международными данными [7, 8]. Моноаллельная инактивация гена TSC2 определена в 6/18 случаях (33%). По данным исследования Martin et al. [28] представленность “второго удара” у пациентов с туберозным склерозом в опухолевых образцах составляет 65%. В нашем исследовании частота выявления второго молекулярного события, инактивирующего ген TSC2 в образцах АМЛ от пациентов без туберозного склероза, несколько ниже, что может объясняться невыясненными пока особенностями молекулярного этиопатогенеза сАМЛ, в частности, особенностями спектра мутаций TSC2, которые могут быть расположены в глубоко интронных и регуляторных участках гена. В качестве альтернативной причины можно рассматривать крайне низкую частоту второго мутантного аллеля в материале опухоли, требующую применения специальных высокочувствительных методов и/или микродиссекции опухолевого материала для его выявления.

В двух случаях (2/18) нами впервые определены мутации в генах SETD2, PDGFRA и STK36 в опухолевом материале сАМЛ почки без каких-либо мутационных явлений в генах TSC1 или TSC2.

На данный момент вопрос о причинах возникновения АМЛ остается не до конца изученным. Необходимость генетического анализа таких опухолей в рамках дифференциальной диагностики является очевидной, так как мимикрирование некоторых опухолей под АМЛ и наоборот усложняет постановку диагноза только на основании клинических и морфологических данных. Более детальный и углубленный анализ данной нозологии будет способствовать лучшему пониманию молекулярно-генетических механизмов этиопатогенеза опухоли, а также определению новых молекулярных мишеней для таргетной терапии ангиомиолипомы почки.

Работа выполнена в рамках государственного задания Минобрнауки России на выполнение НИР в 2019 г.

Все процедуры, выполненные в исследовании с участием людей, соответствуют этическим стандартам институционального и/или национального комитета по исследовательской этике и Хельсинкской декларации 1964 г. и ее последующим изменениям или сопоставимым нормам этики.

От каждого из включенных в исследование участников было получено информированное добровольное согласие.

Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов.