Генетика, 2019, T. 55, № 9, стр. 1054-1063

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Материалом для исследования послужили образцы периферической крови носителей АРТ (n = = 49) и образцы пуповинной крови плодов (n = 52) при проведении пренатальной диагностики в этих семьях. Во всех случаях были получены данные о кариотипе и исходах зарегистрированных беременностей.

Длины центрических и транслоцированных сегментов дериватных хромосом (ЦС и ТС), а также длины отдельных хромосом измеряли в миллионах пар нуклеотидов (млн пн) в соответствии с положением о цитогенетических бэндах на физической карте генома человека (assembly 19) геномного браузера UCSС.

Степень асимметрии квадривалента определяли по отношению длин транслоцированных и центрических сегментов (наибольший ТС/наименьший ТС, наибольший ЦС/наименьший ЦС), рассчитываемых раздельно. Квадривалент считался умеренно асимметричным, если отношения длин ТС или ЦС были меньше 2, и сильно асимметричным, когда оба соотношения были 2 и более [9].

Оценку расположения точек разрывов проводили по количественному критерию, определяемому как отношение длин ТС к размерам плеча хромосом, вовлеченных в транслокацию. Транслокация с терминальным расположением точек разрывов считалась таковой, если хотя бы одно из двух таких соотношений было менее 0.2 [7].

Идентификацию специфических факторов, влияющих на риск рождения жизнеспособного ребенка с хромосомным дисбалансом при носительстве АРТ, проводили при логистическом регрессионном анализе (бинарная логистическая регрессия). Для статистической обработки данных использована статистическая среда R (https:// www.CRAN.R-project.org) и пакеты для обработки данных (https://cran.gis-lab.info).

РЕЗУЛЬТАТЫ

Для оценки факторов, ассоциированных с риском рождения жизнеспособного ребенка с хромосомным дисбалансом, был использован метод бинарной логистической регрессии, позволяющий исследовать зависимость дихотомических (бинарных) переменных от независимых переменных (предикторов) и предсказать значения бинарной зависимой переменной по набору независимых переменных [15]. Дихотомической (бинарной) переменной, определяющей бинарный исход, являлся статус потомка носителя АРТ: 1 – жизнеспособный ребенок с МВПР и/или установленным хромосомным дисбалансом, 0 – нежизнеспособный плод/ребенок или ребенок с нормальным фенотипом. В качестве независимых переменных (предикторов – Pr) были выбраны следующие характеристики, оказывающие влияние на мейотическое поведение квадривалента и выживаемость зигот:

Pr1 –пол носителя транслокации женский;

Pr2 – на транслоцированных сегментах преобладают G-позитивные бэнды (характеристики АРТ по количественному содержанию G-негативных и G-позитивных бэндов в транслоцированных сегментах представлены в табл. 1);

Pr3 – в транслокации задействована хромосома 9;

Pr4 – в транслокации задействованы акроцентрические хромосомы (13–15, 21 и 22);

Pr5 – квадривалент сильно асимметричен;

Pr6 – хотя бы одна из точек разрывов расположена терминально (характеристики АРТ по степени асимметрии квадривалента и локализации точек разрывов, рассчитанные по предложенным критериям соответственно [7, 9], представлены в табл. 2).

Анализируемые независимые переменные для всех 49 АРТ представлены в табл. 3.

Результаты регрессионного анализа для каждого предиктора представлены в табл. 4. По значениям статистической ошибки первого рода (p) для коэффициентов регрессии можно видеть, что статистически значимым, т.е. независимо связанным с риском рождения жизнеспособного ребенка с МВПР и/или хромосомным дисбалансом, является только один из предикторов, а именно терминальность точек разрывов (p = 0.01).

Статистически значимой связи между риском рождения жизнеспособного ребенка с МВПР и/или хромосомным дисбалансом и полом носителя транслокации, обогащенностью транслоцированных сегментов структурными генами, вовлеченностью в транслокацию акроцентрических хромосом и хромосомы 9, а также со степенью асимметрии квадривалента не выявлено, т.е. эти предикторы не вносят значимого вклада в нашу модель логистической регрессии.

Такое заключение позволило сформировать еще одну модель логистической регрессии (логит-модель 2) с включением только статистически значимого предиктора – терминальное расположение точек разрывов (табл. 5). В данной модели статистическая значимость данного предиктора возрастает (p = 0.007).

Для сравнения альтернативных моделей с разным числом параметров, когда требуется выбрать наилучший набор независимых переменных, используется информационный критерий Акаике. Чем меньше этот критерий, тем лучше модель [16]. Как видно из данных табл. 4 и 5, логит-модель 2 является более предпочтительной, поскольку имеет меньший критерий Акаике.

Для оценки общей значимости логит-моделей было проведено сравнение отклонений остатков обеих логит-моделей между собой и с отклонением нулевой модели по критерию хи-квадрат с использованием теста ANOVA (однофакторный дисперсионный анализ – Analysis Of Variance) (табл. 6). Как видно из представленных данных, логит-модель 2 статистически значимо лучше, чем нулевая модель, т.е. модель без независимых переменных (p < 0.005). Незначимая величина критерия хи-квадрат (p = 0.33) свидетельствует о том, что сокращенная модель с одной независимой переменной (логит-модель 2) соответствует этим данным так же хорошо, как и модель, созданная на основе восьми независимых переменных (логит-модель 1), и ее использование является целесообразным.

Поскольку в логистической регрессии в качестве моделируемых значений бинарной переменной используется логарифм отношения шансов, который сложно интерпретировать, можно потенцировать коэффициенты регрессии, чтобы представить их в виде отношения шансов [15]. Отношение шансов является одним из способов описать в численном выражении связь (отсутствие или наличие) определенного исхода с присутствием или отсутствием определенного фактора в конкретной статистической группе, т.е. оценить связь между определенным исходом и фактором риска. Отношение шансов не только определяет статистическую значимость связи между фактором и исходом, но и позволяет дать количественную оценку этой связи.

Отношение шансов для логит-модели 2, в которой статистически значимым предиктором является терминальное расположение точек разрывов на хромосомах, вовлеченных в АРТ, представлено в табл. 7. Как видно из представленных в таблице данных, шансы рождения жизнеспособного ребенка с МВПР и/или хромосомным дисбалансом возрастают в 6 раз при носительстве аутосомных реципрокных транслокаций, в которых хотя бы один из дериватов имеет терминальное расположение точки разрыва. Наблюдаемая зависимость является статистически значимой, так как 95%-ный доверительный интервал не включает 1, а значения его нижней и верхней границ больше 1.

ОБСУЖДЕНИЕ

Метод логистической регрессии как статистический инструмент для оценки риска рождения жизнеспособного ребенка с хромосомным дисбалансом при носительстве АРТ уже применялся ранее некоторыми исследователями [17, 18]. В пионерской работе Cans c соавт. провели оценку модели логистической регрессии, сформированной при анализе 1252 АРТ и включающей 25 предикторов, в том числе размер центрических и транслоцированных сегментов, локализацию точек разрывов, возраст и пол родителей, а также вовлеченность в транслокацию различных морфологических групп хромосом. Авторы показали ассоциацию пола носителя транслокации с хромосомами, вовлеченными в формирование дериватов (хромосома 9 и акроцентрические хромосомы), а также длиной ТС [17]. Однако критерии определения длины ТС были нечеткими и субъективными, основанными на непосредственном измерении хромосом в фотографиях метафазных пластинок.

Почти два десятилетия спустя Aguilar с соавт. [18] показали, что с риском рождения потомства с несбалансированным кариотипом ассоциированы такие признаки как вовлеченность в АРТ хромосом 9, 21 и 22, а также локализация точек разрывов на коротких плечах хромосом, однако не показали подобной ассоциации с размерами ТС, которые определялись по тем же критериям, что и в вышеупомянутой работе [17]. В нашей модели впервые был использован такой показатель как терминальное расположение точек разрывов на хромосомах, вовлеченных в АРТ. Выбор данного предиктора был обусловлен фактом, что транслокации с терминально расположенными точками разрывов ассоциированы со значительным увеличением частоты эмбрионов с хромосомным дисбалансом [7]. При исследовании характеристик АРТ, влияющих на частоту формирования эмбрионов со сбалансированным кариотипом, пригодных для переноса in utero при ПГД, Dul с соавт. [8] показали, что относительный размер транслоцированных сегментов не является независимым предиктором, ассоциированным с формированием сбалансированных зигот. Это позволило авторам предположить, что данный независимый признак является предиктором жизнеспособности эмбрионов с хромосомным дисбалансом [8]. В нашей выборке критерий терминального расположения точек разрывов, основанный на относительном размере транслоцированного сегмента, также оказался статистически значимо связанным с риском рождения жизнеспособного ребенка с МВПР и/или хромосомным дисбалансом.

На сегрегационное поведение квадривалента оказывают влияние многие факторы. Так, например, геометрическая конфигурация квадривалента сама по себе может влиять на сегрегацию. Показано, что на мейотическую сегрегацию оказывает влияние степень симметрии квадривалента: в асимметричных квадривалентах отмечается тенденция к патологическим типам сегрегации, тогда как в более симметричных квадривалентах – к альтернативному типу [9]. Удивительно, что такой критерий как степень асимметрии квадривалента, а именно сильно асимметричный квадривалент оказался статистически незначимым. Действительно, было показано, что при наличии сильно асимметричного квадривалента повышается риск формирования аномальных зигот, приводящих к развитию эмбрионов с хромосомным дисбалансом, который оценивался для всех возможных типов сегрегации [8, 9]. Такое несоответствие данных можно объяснить тем фактом, что в цитируемых работах авторы исследовали варианты всех возможных паттернов мейотической сегрегации у эмбрионов при ПГД в семьях с носительством АРТ и, по-видимому, значительная доля таких эмбрионов не является жизнеспособной.

В качестве одного из возможных критериев АРТ, ассоциированных с риском рождения жизнеспособного ребенка с МВПР и/или хромосомным дисбалансом, рассматривался генный контент транслоцированных сегментов, а именно содержание в них G-бэндов.

Такой выбор был обусловлен фактом, что качество хромосомного материала, определяемое содержанием G(R)-бэндов, может быть предиктором патологической сегрегации мейотического квадривалента у носителей АРТ, приводящей к формированию зигот с несбалансированным кариотипом [17]. G-негативные (R-позитивные) бэнды являются сайтами более интенсивной транскрипции, чем другие регионы генома [19] и, следовательно, дисбаланс по этим районам может быть летальным. Кроме того, мейотическое спаривание может быть различным в более поздних (G-позитивные (R-негативные) бэнды) и более ранних (G-негативные (R-позитивные) бэнды) реплицирующихся сайтах, что может вносить дополнительный вклад в преимущественную патологическую сегрегацию [20]. Поэтому оценка такого фактора, как преобладание в транслоцированных сегментах G-позитивных бэндов, содержащих АТ-богатую поздно реплицирующуюся ДНК, бедную генами (что может обусловливать жизнеспособность эмбриона при патологических типах мейотической сегрегации квадривалента), казалась необходимой. Однако генный контент транслоцированных сегментов, оценивающийся как их обогащенность G-позитивными бэндами, в первоначальной логит-модели 1 оказался статистически незначимым предиктором, не ассоциированным с рождением жизнеспособного потомства с хромосомным дисбалансом.

Таким образом, регерессионный анализ показал, что меньший информационный критерий Акаике и достигнутый уровень значимости логит-модели 2 позволяют считать фактор терминального расположения точек разрывов независимо связанным с риском рождения жизнеспособного ребенка с МВПР и/или хромосомным дисбалансом. Шансы рождения такого ребенка в 6 раз выше при носительстве АРТ, в которых хотя бы один из дериватов имеет терминально расположенную точку разрыва (0.2 и менее размера соответствующего плеча хромосомы), по сравнению с АРТ, в которых точки разрывов не являются терминальными.

Все процедуры, выполненные в исследовании с участием людей, соответствуют этическим стандартам институционального и/или национального комитета по исследовательской этике и Хельсинкской декларации 1964 г. и ее последующим изменениям или сопоставимым нормам этики.

От каждого из включенных в исследование участников было получено информированное добровольное согласие.

Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов.