Генетика, 2020, T. 56, № 3, стр. 321-327
Метилирование локуса AR человека не коррелирует с наличием инактивированной Х-хромосомы в клетках с индуцированной плюрипотентностью
А. В. Панова 1, 2, *, А. Н. Богомазова 1, 3, М. А. Лагарькова 1, 3, **, С. Л. Киселёв 1
1 Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова Российской академии наук
119991 Москва, Россия
2 Эндокринологический научный центр
117036 Москва, Россия
3 Федеральный научно-клинический центр физико-химической медицины
Федерального медико-биологического агенства
119435 Москва, Россия
* E-mail: a.panova@vigg.ru
** E-mail: maryalag@yahoo.com
Поступила в редакцию 11.02.2019
После доработки 10.04.2019
Принята к публикации 24.06.2019
Аннотация
В женских клетках млекопитающих в раннем эмбриональном развитии происходит процесс дозовой компенсации генов: одна из двух Х-хромосом становится транскрипционно неактивной, и в дальнейшем во всех соматических клетках находится в неактивном состоянии. Эмбриональные стволовые клетки (ЭСК), так же, как и клетки с индуцированной плюрипотентностью (ИПСК), являются моделью для изучения раннего развития. В женских ИПСК и ЭСК человека одна из Х-хромосом всегда активна, состояние второй вариабельно: может быть полностью активна, так и иметь частичную инактивацию, или же, аналогично соматическим, может быть полностью неактивной. Определение состояния инактивации Х-хромосомы в плюрипотентных стволовых клетках человека (ПСК) является непростой и актуальной задачей, однако различные методы определения состояния инактивации зачастую приводят к противоречивым результатам. Широко используемый в клинических лабораториях метод анализа метилирования гена AR позволяет определить соотношение аллелей инактивированной Х-хромосомы в клетках крови и тканях пациентов. Также этот метод ранее был предложен для определения статуса инактивации в ИПСК человека. В данной работе мы проанализировали состояние инактивации Х-хромосомы в линии ИПСК человека стандартными методами (экспрессия гена XIST, метилирование промотора XIST, модификации гистонов и др.), а также по уровню метилирования гена AR с фрагментным анализом. Оказалось, что метилирование локуса AR не коррелирует с состоянием инактивации Х-хромосомы в женских ИПСК. Таким образом, мы предполагаем, что этот маркерный ген не может служить индикатором инактивации Х-хромосомы в женских линиях ИПСК человека.
В женских соматических клетках млекопитающих одна из двух Х-хромосом транскрипционно неактивна и находится в гетерохроматинизированном состоянии. Выбор Х-хромосомы для инактивации происходит случайным образом на ранних этапах эмбрионального развития, поэтому женские соматические клетки мозаичны по экспрессии генов Х-хромосомы. В плюрипотентных стволовых клетках (ПСК) человека, как в эмбриональных стволовых клетках (ЭСК), так и в индуцированных плюрипотентных стволовых клетках (ИПСК), состояние инактивации Х-хромосомы вариабельно: в клетке могут присутствовать две транскрипционно активные Х-хромосомы или одна из Х-хромосом может быть полностью инактивирована аналогично соматическим клеткам. Также встречаются клеточные линии, где одна из Х-хромосом может иметь частично инактивированное состояние [1]. Для инактивированной Х-хромосомы характерны экспрессия гена XIST, запускающего инактивацию в раннем эмбриональном развитии, а также обогащение Х-хромосомы меткой неактивного хроматина H3K27me3. Однако наличие или отсутствие определенных гистоновых модификаций и экспрессия гена XIST – косвенные признаки неактивной Х-хромосомы, в то время как непосредственным подтверждением активности Х-хромосомы является ее транскрипционная активность. Подтверждение транскрипционной активности генов обеих Х-хромосом – довольно непростая техническая задача. Для этого нужно показать активность обоих аллелей в каждой отдельной клетке. В случае анализа экспрессии двух аллелей в выделенной РНК из всей культуры клеток возможна ситуация, когда на самом деле в части клеток экспрессируется один аллель, а в части – другой, т.е. в каждой отдельной клетке экспрессия моноаллельная. Идеальным способом показать моно или биаллельность в каждой клетке является проведение РНК-секвенирования отдельных клеток (single-cell RNA-seq) [2, 3]. Однако данная технология была разработана не так давно и на сегодняшний день остается дорогостоящей и пока не может использоваться для анализа большого числа клеточных линий на разных пассажах. Поэтому чаще используются другие методы: сравнение общего уровня транскрипции с Х-хромосом и аутосом [4], модель “смещенной” инактивации из-за крупных делеций на Х-хромосоме [5], гибридизации кДНК на олигонуклеотидном циточипе, предназначенном для выявления структурных перестроек в геноме [6]. Наиболее часто используемый метод определения транскрипционной активности (моноаллельной/биаллельной экспресиии генов Х-хромосомы) – метод РНК гибридизации in situ [5, 7]. После гибридизации с меченой пробой может наблюдаться один точечный сигнал в ядре в случае моноаллельной экспрессии, биаллельная экспрессия будет видна как два сигнала гибридизации. Недостатком метода является то, что он характеризует активность одного локуса, не давая информации об активности по всей длине Х-хромосомы. Мы впервые предложили использовать такую характеристику состояния активности Х-хромосомы в ПСК человека как время репликации. Поздняя репликация характерна для транскрипционно-молчащих участков, при этом районы Х-хромосомы, избегающие инактивации, реплицируются в ранней S-фазе и синхронно на обеих Х-хромосомах [8, 9]. Инактивация Х-хромосомы сопровождается метилированием CpG-островков в промоторах большинства генов. Широко используемый в клинических лабораториях метод анализа метилирования промотора гена AR позволяет определить наличие инактивированной Х-хромосомы, а также соотношение аллелей инактивированной Х-хромосомы в клетках крови и тканях пациентов [10]. Этот метод был предложен и как удобный и универсальный способ для определения статуса инактивации Х-хромосомы в клетках ИПСК человека [11]. Метод основан на определении метилирования района с CAG-повторами в первом экзоне гена андрогенового рецептора (AR), локализованного на Х-хромосоме. Этот район является высокополиморфным из-за вариабельности количества CAG-повторов. При использовании метил-чувствительной рестриктазы HpaII или HhaI разрезается лишь неметилированная геномная ДНК, в том числе и участок, соответствующий активному аллелю гена AR. Далее данный район амплифицируется и ПЦР-продукт наблюдается лишь для метилированного неактивного аллеля. Затем проводится фрагментный анализ: ПЦР-продукты анализируются по длине. Высота пиков каждого из фрагментов пропорциональна количеству метилированного аллеля в исходной клеточной популяции. В отсутствие отклонений в статусе инактивации Х-хромосомы в клетках крови наблюдается соотношение 50/50, так как процесс инактивации происходит случайно. В случае же отклонения от данного соотношения или отсутствия одного из аллелей можно говорить о нарушениях в случайной инактивации, что во многих случаях ассоциировано с различными заболеваниями [12, 13].
В настоящей работе мы проанализировали состояние инактивации Х-хромосомы в женской линии ИПСК человека с помощью стандартных методов: экспрессии гена XIST, метилирования промотора гена XIST, наличия гистоновой модификации неактивного хроматина и времени репликации районов Х-хромосомы, а также проанализировали метилирование гена AR с последующим фрагментным анализом.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Получение и культивирование линий ИПСК на матригеле
Линия ИПСК человека iPSHD22 была получена из фибробластов кожи человека и культивировалась, как описано ранее [14].
Приготовление препаратов метафазных хромосом и определение времени репликации
Препараты метафазных хромосом были приготовлены как описано ранее [9]. Определение времени репликации проводили с помощью пульс-мечения и клик-реакции с 5-этинил-2'-дезоксиуридином (EdU) – аналогом тимидина, встраивающимся вместо него в новую цепь ДНК во время репликации. Клетки были помечены EdU в течение 20 мин в конечной концентрации 1 мкМ. Клетки фиксировали спустя 7 ч после мечения, используя стандартную метанол-уксусную фиксацию, как описано ранее [9]. Встроившийся в цепь ДНК EdU выявлялся с помощью клик-реакции с азидом, меченным Alexa Fluor 555. Клик-реакцию проводили на препаратах метафазных хромосом с помощью набора Click-It Kit (Invitrogen) по инструкции производителя. Х-хромосома выявлялась с помощью метода флуоресцентной гибридизации in situ с пробой DXZ1 (Kreatech), специфичной к центромерному участку Х-хромосомы. Гибридизацию проводили в соответствии с рекомендациями производителя.
Иммуноцитохимическое окрашивание
Иммуноцитохимический анализ проводили как описано ранее [9, 15]. В работе использовали первичные кроличьи поликлональные антитела anti-H3K27me3 в разведении 1 : 5000 (Abcam), вторичные козьи антитела к иммуноглобулинам кролика Alexa Fluor 488-conjugated goat IgG в разведении 1 : 1000 (Invitrogen).
Флуоресцентная РНК-гибридизация in situ (РНК-FISH)
РНК-FISH проводили по ранее описанному протоколу [16], используя меченные ДНК-пробы, полученные из BAC-клонов (Empire Genomics, США): RP11-42 M11 для гена ATRX, RP11-13 M9 для гена XIST, RP11-1104 L9 для гена POLA1, RP11-160 F21 для гена CTPS2.
Выделение геномной ДНК
Клетки промывали в PBS (Панэко), добавляли лизирующий буфер (25 мМ ЭДТА, 0.6% SDS, 20 мМ Tris-HCl, pH 8.0) из расчета 600 мкл на 35-мм чашку Петри. Добавляли 0.1 мг/мл протеиназы К. Инкубировали в течение ночи при 56°С. ДНК экстрагировали равным объемом фенола/хлороформа, затем равным объемом хлороформа, центрифугируя по 5 мин при 10 000 g. Далее к раствору добавляли ацетат натрия до конечной концентрации 0.15 М, затем изопропанол в соотношении 1 : 1, инкубировали 1 ч при –20°С, центрифугировали 10 мин при 10 000 g. Осадок ДНК дважды промывали 70%-ным этанолом, высушивали и растворяли в TE-буфере.
Анализ метилирования гена AR и фрагментный анализ
Анализ метилирования гена AR проводили по протоколу, описанному ранее [10]. В работе использовали метил-чувствительную рестриктазу HhaI (NEB). Для ПЦР использовали праймеры, один из которых был мечен флуоресцентной меткой FAM. ПЦР-продукты c обработанной и не обработанной рестриктазой матрицей визуализировали в агарозном геле, выделяли из геля, и для дальнейшего фрагментного анализа смешивали с формамидом в соотношении ПЦР-продукт/формамид, равном 1/3. Фрагментный анализ амплифицированных продуктов проводили в ЦКП ИМБ РАН “Геном”.
Бисульфитное секвенирование
Бисульфитную конвертацию геномной ДНК осуществляли с помощью набора EZ DNA methylation™ Kit (Zymo Research). В результате бисульфитной конвертации неметилированные C в CpG-сайтах конвертировались в U, а затем в ходе ПЦР в T, а метилированные С конвертации не подвергались.
Амплификацию интересующего фрагмента размером 150 пн, содержащего CpG-островок, проводили с помощью набора Gene Pak PCR (Изоген) с соответствующими праймерами. Праймеры для амплификации конвертированной геномной ДНК были подобраны с использованием ресурса http://www.urogene.org/methprimer/в соответствии с рекомендациями по подбору праймеров для бисульфитного секвенирования [17] с конечным размером продукта в 150 пн:
праймер 1: AAAAAGTGTAGATATTTTAGAGAGTGTAAT;
праймер 2: AATACCTACTTTAATTTTTATTTTTCTAAC.
Далее ПЦР-продукт клонировали в плазмиду pGEMTeasy (Promega) и отбирали по 8–10 клонов для проведения секвенирования.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Характеристика инактивации
Для анализа инактивации Х-хромосомы была выбрана линия ИПСК человека iPSHD22 с генотипом 46XX, охарактеризованная подробно ранее [14]. Эта линия ИПСК экспрессирует маркеры плюрипотентного состояния и способна к дифференцировке в клетки-производные трех зародышевых листков. Ключевым геном, отвечающим на запуск инактивации Х‑хромосомы в раннем эмбриональном развитии, является ген длинной некодирующей РНК XIST. Этот ген экспрессируется на неактивной Х-хромосоме. РНК XIST покрывает неактивную Х-хромосому, и в клетках с инактивированной Х-хромосомой при помощи метода флуоресцентной гибридизации in situ c РНК (РНК-FISH) можно детектировать “облако” РНК XIST. В клетках линии ИПСК iPSHD22 “облако” XIST не было выявлено, что косвенно свидетельствует об отсутствии инактивации Х-хромосомы (рис. 1,а). Для подтверждения отсутствия работы гена XIST мы проанализировали метилирование промотора гена XIST для подтверждения неактивного статуса гена XIST. При отсутствии инактивации обеих Х-хромосом в клетке наблюдается метилирование промоторов XIST на обеих Х-хромосомах. Методом бисульфитной конвертации ДНК с последующими амплификацией, клонированием и секвенированием ампликонов был проанализирован участок промотора гена XIST размером в 150 пн, содержащий пять CpG-сайтов. В данном районе наблюдалось практически полное метилирование CpG-сайтов. Полное метилирование предотвращает экспрессию гена XIST и инактивацию одной из Х-хромосом (рис. 1,б). Таким образом, полное метилирование промотора гена XIST свидетельствует об отсутствии классической XIST-зависимой инактивации Х-хромосомы в линии ИПСК iPSHD22. Далее мы проанализировали наличие на Х-хромосоме гистоновой модификации неактивного хроматина H3K27me3, характерной для гетерохроматина. Методом иммуноцитохимического окрашивания в клетках исследуемой линии обогащение Х-хромосомы по H3K27me3 не детектировалось, что также свидетельствует об отсутствии инактивированной Х-хромосомы (рис. 1,а).
Для оценки транскрипционной активности Х‑хромосомы была исследована экспрессия трех X-сцепленных генов: POLA1, CTPS2, ATRX. При наличии двух активных Х-хромосом оба аллеля генов транскрипционно активны, и с помощью метода РНК-FISH мы можем выявить в каждом ядре два точечных сигнала РНК для каждого гена. Оказалось, что для линии ИПСК iPSHD22 в интерфазном ядре детектировалось по два точечных сигнала для генов POLA1 и CTPS2 (рис. 1,а), что свидетельствует о биаллельной экспрессии этих двух генов. При этом в этой же клеточной линии при РНК-FISH с пробой к гену ATRX присутствовал лишь один точечный сигнал в каждой клетке (рис. 1,а), что свидетельствует о моноаллельной экспрессии гена ATRX.
Ранее нами было показано, что время и паттерн репликации являются надежным методом, отражающим состояние инактивации Х-хромосомы [8]. Для изучения репликации Х-хромосомы клетки линий ИПСК iPSHD22 были помечены с помощью EdU. Две Х-хромосомы одной метафазной пластинки сравнивали между собой по паттерну включения EdU. В линии iPSHD22 паттерн включения EdU в цепи ДНК обеих Х-хромосом одной клетки очень схож, т.е. репликация обеих Х-хромосом происходила практически синхронно. Поздно и асинхронно реплицировались два района одной из Х-хромосом: дистальная часть q-плеча и перицентромерный район (рис. 1,в). Итак, в линии iPSHD22 наблюдается практически синхронная репликация двух Х-хромосом, за исключением двух районов одной из Х-хромосом: перицентромерного и дистального q-плеча. При этом в синхронно реплицирующихся районах (на р-плече) наблюдается биаллельная экспрессия генов POLA1 и CTPS2, а в позднореплицирующемся перицентромерном районе локализован ген ATRX, экспрессия которого моноаллельна.
Метилирование гена AR и фрагментный анализ
Для определения инактивации Х-хромосомы по метилированию промотора гена AR была проведена ПЦР с геномной ДНК. В ПЦР использовали нативную геномную ДНК и ДНК, обработанную метил-зависимой рестриктазой HhaI. Был амплифицирован полиморфный по количеству CAG-повторов участок, находящийся в промоторе гена AR. При использовании нативной геномной ДНК линии ИПСК iPSHD22 в ПЦР получили фрагменты различной длины: 260 и 278 пн (рис. 1,г). После обработки геномной ДНК метил-чувствительной рестриктазой HhaI во фрагментном анализе ПЦР-продуктов детектировали лишь один пик, соответствующий аллелю в 260 пн. Это свидетельствует о том, что во всей популяции клеток данной клеточной линии присутствует один и тот же метилированный аллель гена AR и, следовательно, одна из Х-хромосом в клеточной линии ИПСК iPSHD22 инактивирована.
ОБСУЖДЕНИЕ
Ген AR находится в перицентромерном районе Х-хромосомы, который можно признать инактивированным, так как у одной из Х-хромосом исследуемой клеточной линии он поздно реплицировался, в этом же районе локализован ген ATRX, который экспрессировался моноаллельно. То есть, несмотря на наличие почти полностью активной Х-хромосомы, анализ метилирования локуса AR свидетельствовал о полностью инактивированной Х-хромосоме в исследуемой клеточной линии. Нужно отметить, что данная ситуация с инактивированным перицентромерным районом, содержащим ген AR, характерна не только для данной клеточной линии. Ранее неоднократно было показано, что на Х-хромосоме присутствуют два типа хроматина: обогащенный H3K27me3 – легко реактивируемый на неактивной Х-хромосоме при репрограммировании, и обогащенный H3K9me3 – район, устойчиво находящийся в неактивном состоянии на неактивной Х-хромосоме [18, 19]. В предыдущей работе нами показано, что позднореплицирующиеся домены Х-хромосомы в данной клеточной линии обогащены гистоновой модификацией H3К9me3 [8]. В недавних работах показано, что H3K9me3-обогащенные районы генома препятствуют связыванию транскрипционных факторов при репрограммировании, а при удалении модификации H3K9me3 получаются полностью репрограммированные ИПСК [20, 21]. Расположение локуса AR в неактивном и позднореплицирующемся районе не является исключительной особенностью изученной нами клеточной линии ИПСК, а представляет собой достаточно частое явление среди ИПСК, получаемых в различных лабораториях мира.
Таким образом, метод анализа метилирования гена AR, предложенный ранее для характеристики статуса инактивации Х-хромосмы в ИПСК [11], не отражает реального состояния активности Х-хромосомы в линиях ИПСК. Для рутинной работы в клинической диагностике были предложены альтернативные локусы для анализа инактивации Х-хромосомы [22]. Применение альтернативных районов или комбинации локусов позволит точнее анализировать состояние инактивации Х-хромосомы как в клинической диагностике, так и при исследованиях на клеточных линиях ИПСК человека.
Работа выполнена в рамках темы государственного задания № 0112-2019-0002.
Все процедуры, выполненные в исследовании с участием людей, соответствуют этическим стандартам институционального и/или национального комитета по исследовательской этике и Хельсинкской декларации 1964 г. и ее последующим изменениям или сопоставимым нормам этики. От каждого из включенных в исследование участников было получено информированное добровольное согласие.
Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов.
Список литературы
Богомазова А.Н., Васина Е.М., Киселев С.Л. и др. Генетическое репрограммирование клеток: новая технология для фундаментальных исследований и практического использования // Генетика. 2015. Т. 51. № 4. С. 466–478.
Petropoulos S., Edsgärd D., Reinius B. et al. Single-cell RNA-seq reveals lineage and X chromosome dynamics in human preimplantation embryos // Cell. 2016. V. 5. № 165(4). P. 1012–1026. https://doi.org/10.1016/j.cell.2016.08.009
Sahakyan A., Kim R., Chronis C. et al. Human naive pluripotent stem cells model X chromosome dampening and X inactivation // Cell Stem Cell. 2017. V. 20. № 1. P. 87–101. https://doi.org/10.1016/j.stem.2016.10.006
Bruck T., Benvenisty N. Meta-analysis of the heterogeneity of X chromosome inactivation in human pluripotent stem cells // Stem Cell Res. 2010. V. 6. № 2. P. 187–193. https://doi.org/10.1016/j.scr.2010.12.001
Barakat T.S., Ghazvini M., de Hoon B. et al. Stable X chromosome reactivation in female human induced pluripotent stem cells // Stem Cell Reports. 2015. V. 4. № 2. P. 199–208. https://doi.org/10.1016/j.stemcr.2014.12.012
Медведев С.П., Сметанина М.А., Шевченко A.И. и др. Характеристика индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека с помощью ДНК-микрочипов // Клеточные технологии в биологии и медицине. 2013. № 1. С. 3–10.
Tchieu J., Kuoy E., Chin M.H. et al. Female human iPSCs retain an inactive X chromosome // Cell Stem Cell. 2010. V. 7. № 3. P. 329–342. https://doi.org/10.1016/j.stem.2010.06.024
Bogomazova A.N., Lagarkova M.A., Panova A.V. et al. Reactivation of X chromosome upon reprogramming leads to changes in the replication pattern and 5hmC accumulation // Chromosoma. 2014. V. 123. № 1–2. P. 117–128. https://doi.org/10.1007/s00412-013-0433-x
Panova A.V., Bogomazova A.N., Lagarkova M.A., Kiselev S.L. Epigenetic reprogramming by naïve conditions establishes an irreversible state of partial X chromosome reactivation in female stem cells // Oncotarget. 2018. V. 9. № 38. P. 25136–25147. https://doi.org/10.18632/oncotarget.25353
Allen R.C., Zoghbi H., Moseley A. et al. Methylation of HpaII and HhaI sites near the polymorphic CAG repeat in the human androgen-receptor gene correlates with X chromosome inactivation // Am. J. Hum. Genet. 1992. V. 51. № 6. P. 1229.
Kiedrowski L.A., Raca G., Laffin J.J. et al. DNA methylation assay for X-chromosome inactivation in female human iPS cells // Stem Cell Reviews and Reports. 2011. V. 7. № 4. P. 969–975. https://doi.org/10.1007/s12015-011-9238-6
Brix T.H., Knudsen G.P., Kristiansen M. et al. High frequency of skewed X-chromosome inactivation in females with autoimmune thyroid disease: a possible explanation for the female predisposition to thyroid autoimmunity // The J. Clin. Endocrinol. Metabolism. 2005. V. 90. № 11. P. 5949–5953. https://doi.org/10.1210/jc.2005-1366
Шевченко А.И. Феномен инактивации Х-хромосомы и заболевания человека // Гены и клетки. 2016. Т. 11. № 2. С. 61–68.
Nekrasov E.D., Vigont V.A., Klyushnikov S.A. et al. Manifestation of Huntington’s disease pathology in human induced pluripotent stem cell-derived neurons // Mol. Neurodegenerat. 2016. V. 11. № 1. P. 27. https://doi.org/10.1186/s13024-016-0092-5
Панова А.В., Некрасов Е.Д., Лагарькова М.А. и др. Поздняя репликация инактивированной Х-хромосомы в плюрипотентных стволовых клетках человека не зависит от степени компактизации ее хромосомной территории // Acta Naturae. 2013. Т. 5. № 2(17). С. 55–63.
Bacher C.P., Guggiari M., Brors B. et al. Transient colocalization of X-inactivation centres accompanies the initiation of X inactivation // Nat. Cell Biol. 2006. V. 8. № 3. P. 293. https://doi.org/10.1038/ncb1365
Li L.C., Dahiya R. MethPrimer: designing primers for methylation PCRs // Bioinformatics. 2002. V. 18. № 11. P. 1427–1431. https://doi.org/10.1093/bioinformatics/18.11.1427
Vallot C., Ouimette J.F., Makhlouf M. et al. Erosion of X chromosome inactivation in human pluripotent cells initiates with XACT coating and depends on a specific heterochromatin landscape // Cell Stem Cell. 2015. V. 16. № 5. P. 533–546. https://doi.org/10.1016/j.stem.2015.03.016
Chadwick B.P., Willard H.F. Multiple spatially distinct types of facultative heterochromatin on the human inactive X chromosome // Proc. Natl Acad. Sci. USA. 2004. V. 101. № 50. P. 17450–17455. https://doi.org/10.1073/pnas.0408021101
Chen J., Liu H., Liu J. et al. H3K9 methylation is a barrier during somatic cell reprogramming into iPSCs // Nat. Genet. 2013. V. 45. № 1. P. 34. https://doi.org/10.1038/ng.2491
Soufi A., Donahue G., Zaret K.S. Facilitators and impediments of the pluripotency reprogramming factors’ initial engagement with the genome // Cell. 2012. V. 151. № 5. P. 994–1004. https://doi.org/10.1016/j.cell.2012.09.045
Bertelsen B., Tümer Z., Ravn K. Three new loci for determining X chromosome inactivation patterns // The J. Mol. Diagnostics. 2011. V. 13. № 5. P. 537–540. https://doi.org/10.1016/j.jmoldx.2011.05.003
Дополнительные материалы отсутствуют.