Генетика, 2020, T. 56, № 3, стр. 338-346

Исследование ассоциации полиморфных маркеров генов антиоксидантов с репродуктивными потерями

Е. В. Машкина 1*, К. А. Коваленко 1, А. В. Миктадова 1, М. А. Шкурат 1

1 Южный федеральный университет
344090 Ростов-на-Дону, Россия

* E-mail: lenmash@mail.ru

Поступила в редакцию 03.04.2019
После доработки 20.04.2019
Принята к публикации 30.05.2019

Полный текст (PDF)

Аннотация

В результате исследования определены частоты генотипов и аллелей по полиморфным вариантам генов, контролирующих уровень активных форм кислорода (SOD1, SOD2, СAT, GPX4) и функционирование эндотелия (EDN1, NOS3) у женщин с различным характером течения первого триместра беременности. Выявлена ассоциация аллеля 7958А гена SOD1 с увеличением риска спонтанной потери беременности в первом триместре (OR = 2.17, 95% CI 1.14–4.13). Женщины с генотипом AsnAsn гена EDN1 имеют повышенный относительный риск остановки развития эмбриона в первом триместре (OR = 7.18, 95% CI 1.4–36.75). Для аллеля –786Т гена NOS3 выявлена ассоциация с повышенным риском потери беременности в первом триместре (OR = 1.68, 95% CI 1.04–2.72). Выявлены значимые модели взаимодействия исследуемых генов, изменяющие риск невынашивания беременности в первом триместре.

Ключевые слова: полиморфизм генов, антиоксиданты, невынашивание беременности, межгенные взаимодействия, SOD1, SOD2, NOS3, EDN1.

DOI: 10.31857/S001667582003011X

Анеуплоидия эмбриональных клеток является основной генетической причиной невынашивания беременности на ранних сроках. Однако большая часть абортусов первого триместра имеет нормальный кариотип и этиология потери беременности остается не идентифицирована. Анализ генетического материала более 3000 абортусов методом хромосомного микроматричного анализа показал, что клинически значимые варианты полиморфизма числа тандемных повторов характерны для 1.6% абортусов, тогда как частота редких вариантов неопределенного клинического значения колебалась от 1 до 40% случаев [16]. Таким образом, на сегодняшний день причина эуплоидных выкидышей полностью не определена и продолжает изучаться как путем поиска новых генетических маркеров, так и путем анализа аллельных вариантов генов-кандидатов.

Немаловажную роль в генезе ранних репродуктивных потерь играет влияние системы редокс-гомеостаза, одним из основных компонентов которой является сеть ферментов антиоксидантной системы. Активные формы кислорода (АФК) в физиологических концентрациях обеспечивают протекание важнейших процессов, таких как транскрипция генов, деление клетки, детоксикация ксенобиотиков, реакции апоптоза и др. Однако избыточная продукция свободных радикалов оказывает повреждающее воздействие на различные компоненты клетки, вызывая перекисное окисление липидов, окислительные модификации белков, повреждения в молекуле ДНК.

Активные формы кислорода и антиоксиданты являются одними из ключевых факторов, определяющих физиологический метаболизм женской репродуктивной системы; баланс между АФК и антиоксидантами значительно влияет на изменения эндометрия в зависимости от фазы цикла, на фолликулогенез, овуляцию, оплодотворение, рост плаценты, эмбриогенез и имплантацию [7, 8]. Уровень АФК в процессе эмбриогенеза функционально сопряжен с процессами формирования и функционирования плаценты, обеспечивающей кровоснабжение зародышевых клеток. До 12 нед. беременности плацента человека формируется в условиях гипоксии. В конце первого триместра вторая волна инвазии трофобласта приводит к существенному увеличению концентрации плацентарного кислорода, что усиливает окислительно-восстановительные реакции в клетках трофобласта. То есть формирование плацентарного кровообращения связано с резким увеличением уровня кислорода в клетках плаценты [9]. Изменения концентрации кислорода модулируют уровень АФК, которые могут действовать как сигнальные молекулы. Это особенно важно для тканей, требующих больших затрат энергии и содержащих большое число митохондрий, в том числе плаценты [10]. По мере развития беременности и метаболических потребностей растущего плода наблюдаются увеличение числа плацентарных митохондрий и активация их функционирования. Это способствует увеличению уровня АФК [11]. Таким образом, повышение уровня АФК в процессе беременности является физиологически обоснованным процессом, однако требует строго контроля со стороны системы антиоксидантов.

Совокупность ферментативных и низкомолекулярных антиоксидантов контролирует интенсивность образования в клетке высокореактивных свободных радикалов кислорода. Супероксиддисмутаза (SOD), каталаза (СAT) и глутатионпероксидаза (GPX) являются тремя важнейшими антиоксидантными ферментами. Супероксиддисмутаза катализирует реакцию дисмутации супероксиданиона с образованием пероксида водорода. У млекопитающих известны три формы SOD: цитозольная (Cu/Zn-SOD, SOD1), митохондриальная (Mn-SOD, SOD2) и внеклеточная (SOD3). Фермент SOD1 локализуется в ядре, цитоплазме и митохондриях. SOD2 функционирует в митохондриях. Внеклеточная супероксиддисмутаза SOD3, например в кровеносных сосудах, связана с поверхностью эндотелиальных клеток и внеклеточным матриксом [12].

Образовавшаяся в результате реакции дисмутации перекись водорода может быть инактивирована до воды каталазой или глутатионпероксидазой. GPX присутствует как в митохондриях, так и в цитоплазме, тогда как каталаза обнаруживается только в пероксисомах.

Изменение активности и/или уровня антиоксидантных ферментов как в меньшую, так и в большую сторону оказывает негативное воздействие на процессы эмбриогенеза. Показано, что сверхэкспрессия Cu/Zn-SOD нарушает процессы слияния и дифференцировки клеток трофобласта, что сопровождается снижением уровня таких соединений как хорионический гормон человека, плацентарный лактоген, а также гормона роста плаценты [13].

Как в реакциях окислительного стресса, так и в механизмах антиоксидантной защиты клетки от действия АФК непосредственное участие может принимать оксид азота. Оксид азота является одним из наиболее важных биологических медиаторов, который вовлечен во множество физиологических и патофизиологических процессов. В организме NO синтезируется из аминокислоты L-аргинин в ходе реакции, катализируемой NO-синтазой (NOS). Известны три изоформы NOS: NOS1 – нейрональная (nNOS); NOS2 – индуцибельная, или макрофагальная (iNOS); NOS3 – эндотелиальная (eNOS). Во время беременности NOS3 влияет на имплантацию, децидуализацию, регуляцию кровотока в плаценте. В оптимальной концентрации фермент важен для стимуляции процессов внутриутробного развития; в то же время отклонения его концентрации приводят к нарушениям в развитии эмбриона [1416].

Большую роль в регуляции гемодинамических процессов играет эндотелин 1. Эндотелин 1 стимулирует выработку вазодилататоров и факторов роста, в том числе и NO, обладает вазоконстрикторным действием, участвует в регуляции сосудистого тонуса [17, 18]. Существуют различные механизмы, с участием которых эндотелин 1 оказывает свой эффект, такие как индукция воспаления и окислительного стресса, увеличение выработки факторов роста, синтез коллагена и внеклеточного матрикса и стимуляция пролиферации гладкомышечных клеток. Эндотелин 1 способен усиливать сосудосуживающие эффекты других нейрогуморальных и эндокринных факторов.

Генетически обусловленные изменения в уровне и/или активности антиоксидантов и белков системы гемостаза являются потенциальными причинами нарушения репродуктивной функции человека. Полиморфные варианты генов антиоксидантов в результате экспрессии изоформ белков оказывают влияние на широкий спектр метаболических процессов и риск развития патологических состояний. Данные литературы об ассоциации аллельных вариантов генов антиоксидантов с репродуктивными потерями в первом триместре беременности немногочисленны и противоречивы.

Целью данной работы было исследование ассоциации полиморфных вариантов генов, контролирующих уровень активных форм кислорода (SOD1, SOD2, СAT, GPX4) и функционирование эндотелия (EDN1, NOS3), с невынашиванием беременности в первом триместре.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Для молекулярно-генетического исследования использовали образцы ДНК, выделенной из лейкоцитов периферической крови 127 женщин с невынашиванием беременности в первом триместре (средний возраст 29 лет). Среди них – 58 женщин с неразвивающейся беременностью и 53 женщины со спонтанным абортом на сроке 5–10 нед. гестации. В контрольную группу вошли 125 женщин (средний возраст 30 лет) с физиологически протекающей беременностью, у которых в анамнезе отсутствовали спонтанный аборт и/или неразвивающаяся беременность. Все женщины подписали письменное информированное согласие об участии в исследовании. Исследование одобрено комитетом по биоэтике Академии биологии и биотехнологии Южного федерального университета.

Критериями исключения из исследования были ранее диагностированные артериальная гипертензия, диабет, заболевания щитовидной железы и аутоиммунная патология, а также инфекционные заболевания во время беременности. Кроме того, были исключены женщины с аномалиями матки и синдромом поликистозных яичников. В сравниваемых группах отсутствовали женщины с экзогенными факторами риска – злоупотребление алкоголем, контакт с вредными факторами производства (электромагнитное излучение, шум, вибрация, химическое производство).

ДНК из клеток крови выделяли термокоагуляционным методом с использованием реагента “ДНК-экспресс-кровь” (Литех, Россия). Аллельные варианты 7958G>A (rs4998557) гена SOD1, 47C>T (Ala16Val) (rs4880) гена SOD2, –262C>T (rs1001179) гена CAT, 718C>T (rs713041) гена GPX4, 5665G>T (Lys198Asn) (rs5370) гена ЕDN1, –786Т>С (rs2070744) гена NOS3 исследовали с использованием наборов реагентов SNP-экспресс (Литех, Россия). Анализ основан на проведении реакций амплификации с двумя парами аллель-специфичных праймеров. Разделение продуктов амплификации проводили методом горизонтального электрофореза в 3%-ном агарозном геле.

Соответствие распределения частот генотипов равновесию Харди–Вайнберга определяли с использованием Hardy–Weinberg equilibrium calculator в программе www.oege.org/software/Hardy-Weinberg [19]. Оценку различий в распределении аллельных вариантов генов в обследованных группах осуществляли по критерию χ2. О риске развития невынашивания беременности судили по отношению шансов (odds ratio – OR). OR указан с 95%-ным доверительным интервалом (CI).

Для анализа межгенных взаимодействий использовали биоинформатический подход – Multifаctor Dimensionаlity Reduction (программа MDR, v.1.1.0 www.epistаsis.org/mdr.html) для моделирования геномных взаимодействий.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Результаты исследования частот генотипов и аллелей по полиморфным вариантам генов супероксиддисмутазы SOD1 и SOD2 среди женщин европеоидной расы с нарушением репродуктивной функции представлены в табл. 1. Распределение частот генотипов и аллелей в лейкоцитах периферической крови по исследованным вариантам аллелей в трех группах женщин соответствует равновесию Харди–Вайнберга.

Таблица 1.  

Частота аллелей и генотипов (абс. (%)) по полиморфным вариантам генов супероксиддисмутазы в клетках крови женщин

Генотип, аллель Контроль Невынашивание беременности
СА χ2 (р) НБ χ2 (р)
7958G>A, ген SOD1
GG 102 (82.3) 35 (66.0) 5.64 (0.06) 46 (79.3) 1.45 (0.49)
GA 20 (16.1) 16 (30.2) 12 (20.7)
AA 2 (1.6) 2 (3.8) 0
Аллель 7958A 0.097 0.189 5.76 (0.02) 0.103 0.04 (0.84)
Ala16Val (47C>T), ген SOD2
AlaAla 26 (20.8) 14 (26.4) 0.7 (0.7) 15 (25.9) 0.84 (0.66)
AlaVal 60 (48.0) 23 (43.4) 28 (48.3)
ValVal 39 (31.2) 16 (30.2) 15 (25.9)
Аллель 16Val 0.552 0.519 0.33 (0.57) 0.5 0.86 (0.35)

Примечание. СА – спонтанный аборт; НБ – неразвивающаяся беременность; χ2 – сравнение частот генотипов и аллелей с контролем.

По полиморфизму 7958G>A (rs4998557) гена SOD1 в исследуемых группах женщин преобладают гомозиготы по аллелю 7958G. Доля гетерозигот по исследуемому аллельному варианту гена SOD1 колеблется от 16 до 30% (табл. 1). Среди женщин со спонтанным прерыванием беременности и неразвивающейся беременностью в первом триместре характер распределения частот генотипов по полиморфизму 7958G>A соответствует контрольной группе.

Частота аллеля 7958A в контрольной группе составила 0.097. В группе женщин со спонтанным прерыванием беременности данный показатель составил 0.189, что статистически значимо выше по сравнению с контрольной группой (табл. 1). Выявлена ассоциация аллеля 7958А гена SOD1 с увеличением риска спонтанной потери беременности в первом триместре (OR = 2.17, 95% CI 1.14–4.13). Для аллеля 7958G гена SOD1 выявлена ассоциация со снижением риска потери беременности в первом триместре (OR = 0.46, 95% CI 0.24–0.88).

В контрольной группе преобладают гетерозиготы по полиморфизму Ala16Val гена SOD2. Доля гомозигот по аллелю 16Val гена SOD2 составляет 31.2%. Среди женщин со спонтанным абортом и неразвивающейся беременностью в первом триместре характер распределения частот генотипов и аллелей по полиморфизму Ala16Val гена SOD2 соответствует контролю (табл. 1).

Результаты исследования частот генотипов и аллелей по полиморфному варианту –262C>T гена CAT представлены в табл. 2. Распределение частот генотипов и аллелей по исследованному полиморфизму в лейкоцитах периферической крови женщин трех групп соответствует равновесию Харди–Вайнберга. Во всех исследуемых группах преобладают гомозиготные носители по аллелю –262C гена CAT. Частота аллеля –262T в контрольной группе составила 0.168. Среди женщин с прерыванием беременности в первом триместре частоты генотипов и аллелей по полиморфизму –262C>T гена CAT не отличаются от контрольной группы.

Таблица 2.  

Частота аллелей и генотипов (абс. (%)) по полиморфным вариантам генов CAT и GPX4 в клетках крови женщин

Генотип, аллель Контроль Невынашивание беременности
СА χ2 (р) НБ χ2 (р)
262С>T, ген CAT
СС 87 (69.6) 35 (66.0) 1.64 (0.44) 32 (56.1) 3.26 (0.2)
СТ 34 (27.2) 14 (26.4) 23 (40.4)
TT 4 (3.2) 4 (7.5) 2 (3.5)
Аллель –262Т 0.168 0.208 0.79 (0.37) 0.237 2.42 (0.12)
718C>T, ген GPX4
CC 46 (37.1) 17 (32.1) 1.96 (0.38) 16 (28.1) 1.66 (0.44)
62 (50.0) 32 (60.4) 31 (54.4)
ТТ 16 (12.9) 4 (7.5) 10 (17.5)
РХВ (р) >0.05 <0.05   >0.05  
Аллель 718Т 0.379 0.377 0 (0.98) 0.447 1.52 (0.22)

Примечание. СА – спонтанный аборт; НБ – неразвивающаяся беременность; χ2 – сравнение частот генотипов и аллелей с контролем; РХВ – равновесие Харди–Вайнберга.

По полиморфизму 718C>T гена GPX4 во всех трех группах преобладают женщины с генотипом 718CT (табл. 2). Доля гомозигот по аллелю 718Т гена GPX4 составляет от 7.5 до 17.5%. Среди женщин со спонтанным абортом и неразвивающейся беременностью в первом триместре характер распределения частот генотипов и аллелей по полиморфизму 718C>T гена GPX4 не отличается от контрольной группы (табл. 2). Однако в группе женщин со спонтанным прерыванием беременности распределение частот генотипов не соответствует равновесию Харди–Вайнберга.

По полиморфизму Lys198Asn гена EDN1 в исследуемых группах женщин преобладают гомозиготные носители по аллелю Lys198. Доля гетерозиготных носителей по исследуемому аллельному варианту гена EDN1 колеблется от 17.5 до 26% (табл. 3). Среди женщин с неразвивающейся беременностью в анамнезе равновесие Харди–Вайнберга по частотам генотипов не соблюдается, при этом доля гомозигот по аллелю 198Asn гена EDN1 в 6 раз выше по сравнению с контролем и в 2.8 раза выше по сравнению с группой женщин со спонтанным абортом в анамнезе (табл. 3). Распределение частот генотипов по полиморфизму Lys198Asn гена EDN1 среди женщин с неразвивающейся беременностью статистически значимо отличается от контрольной группы. Женщины с генотипом AsnAsn гена EDN1 имеют повышенный относительный риск остановки развития эмбриона в первом триместре (OR = 7.18, 95% CI 1.4–36.75).

Таблица 3.  

Частота аллелей и генотипов (абс. (%)) по полиморфным вариантам генов EDN1 и NOS3 в клетках крови женщин

Генотип, аллель Контроль Невынашивание беременности
СА χ2 (р) НБ χ2 (р)
Lys198Asn, ген EDN1
LysLys 92 (74.2) 37 (69.8) 0.94 (0.63) 41 (71.9) 7.83 (0.02)
LysAsn 30 (24.2) 14 (26.4) 10 (17.5)
AsnAsn 2 (1.6) 2 (3.8) 6 (10.5)
РХВ (р) >0.05 >0.05 <0.05
Аллель 198Asn 0.137 0.17 0.63 (0.43) 0.193 1.87 (0.17)
786T>C, ген NOS3
TT 42 (33.9) 28 (52.8) 5.6 (0.06) 25 (43.1) 1.8 (0.41)
TC 57 (46.0) 17 (32.1) 21 (36.2)
CC 25 (20.2) 8 (15.1) 12 (20.7)
Аллель –786С 0.431 0.311 4.48 (0.03) 0.388 0.62 (0.43)

Примечание. СА – спонтанный аборт; НБ – неразвивающаяся беременность; χ2 – сравнение частот генотипов и аллелей с контролем; РХВ – равновесие Харди–Вайнберга.

Распределение частот генотипов и аллелей по полиморфизму –786Т>С гена NOS3 в лейкоцитах периферической крови женщин трех групп соответствует равновесию Харди–Вайнберга. В контрольной группе преобладают гетерозиготные носители по полиморфизму –786Т>С гена NOS3 (46%). Среди женщин со спонтанным абортом и неразвивающейся беременностью выявлено увеличение доли гомозигот по аллелю –786Т (52.8 и 43.1% соответственно) (табл. 3).

Частота аллеля –786С в контрольной группе составила 0.431. В группе женщин со спонтанным прерыванием беременности данный показатель составил 0.311, что статистически значимо ниже по сравнению с контрольной группой (табл. 3). Выявлена ассоциация аллеля –786С гена NOS3 с уменьшением риска спонтанной потери беременности в первом триместре (OR = 0.6, 95% CI 0.37–0.96). Для аллеля –786Т гена NOS3 выявлена ассоциация с повышенным риском потери беременности в первом триместре (OR = 1.68, 95% CI 1.04–2.72).

Физиологическое течение беременности требует согласованной работы генов нескольких функциональных групп, в том числе генов антиоксидантов, генов, контролирующих работу эндотелия сосудов. Сочетанное присутствие нескольких аллельных вариантов генов, кодирующих функционально связанные белковые молекулы, может приводить к формированию нового фенотипа за счет незначительных, но многочисленных взаимосвязанных изменений в функционировании генома и протеома. Поэтому мы провели анализ межгенных взаимодействий аллельных вариантов генов-кандидатов при невынашивании беременности первого триместра.

Анализ межгенных взаимодействий показал, что максимальный синергетический эффект для двух локусов характерен для комбинации NOS3 и GPX4. Данная двухлокусная модель взаимодействия генов имеет воспроизводимость 90% и точность предсказания 62%. Генотип –786СС NOS3/718CC GPX4 с возможным протективным эффектом статистически значимо чаще регистрируется в контрольной группе женщин (χ2 = 4.51, р = 0.034 (OR = 0.078, 95% CI 0.004–1.34)).

Модель трехлокусной комбинации NOS3 × × GPX4 × EDN1 характеризуется воспроизводимостью 80% и точностью предсказания 61%. Женщины с генотипом 198LysLys EDN1/–786TT NOS3/718CC GPX4 имеют повышенный риск спонтанного прерывания беременности в первом триместре (OR = 3.92, p = 0.013, 95% CI 1.4–10.9).

При анализе четырехлокусной модели взаимодействия исследуемых локусов (NOS3, GPX4, EDN1, SOD1) выявлен генотип низкого риска спонтанного прерывания беременности в первом триместре: 198 LysLys EDN1/–786TС NOS3/718CC GPX4/7958GG SOD1 (OR = 0.11, 95% CI 0.014–0.82 p = 0.021).

Значимые модели взаимодействия исследуемых генов при неразвивающейся беременности в первом триместре следующие: NOS3, SOD2, EDN1 × SOD1 (воспроизводимость модели 80%, точность предсказания 58%); а также NOS3, SOD2, EDN1, SOD1, GPX4 (воспроизводимость модели 100%, точность предсказания 63%). При этом выявлены генотипы высокого риска неразвивающейся беременности (табл. 4).

Таблица 4.  

Генотипы по исследуемым аллельным вариантам генов с высоким риском неразвивающейся беременности в первом триместре

Генотип Частота, % OR (95% CI) р
К НБ
–786TT NOS3/16AlaVal SOD2/198LysLys EDN1/7958GG SOD1 5.6 17.5 3.56 (1.28–9.83) 0.023
–786TT NOS3/16ValVal SOD2/198LysLys EDN1/7958GG SOD1 8.1 22.8 3.37 (1.38–8.24) 0.01
–786TC NOS3/16AlaVal SOD2/198LysLys EDN1/7958GG SOD1/718CT GPX4 5.6 19.3 3.99 (1.46–10.95) 0.009

Примечание. К – контроль; НБ – неразвивающаяся беременность.

ОБСУЖДЕНИЕ

Запрограммированный “окислительный взрыв” в конце первого триместра беременности предполагает наличие хорошо развитой антиоксидантной системы в зародышевых клетках. Показана высокая концентрация ряда антиоксидантов в экстра-эмбриональной жидкости на пятой неделе развития [20]. Другое исследование показало связанное с гестацией увеличение экспрессии каталазы, Cu/Zn-SOD и Mn-SOD в ворсинках плаценты на 12-й нед. беременности. В этом же исследовании выявлен быстрый рост уровня кислорода в плаценте между 10–13 нед. беременности, который при нормальных условиях компенсируется повышением антиоксидантной емкости тканей [9]. Таким образом, в процессе нормального формирования плаценты повышение уровня кислорода в плацентарном ложе сопровождается ростом уровня мРНК и активности антиоксидантных ферментов.

В исследовании плацентарного кровотока при нормальной беременности и при невынашивании беременности первого триместра Jauniaux с коллегами [21] обнаружили, что в группе женщин с потерей беременности плацентарный кровоток часто формировался раньше по сравнению с контрольной группой. При этом в образцах плаценты, полученных после спонтанного прерывания беременности, выявлены маркеры развития окислительного стресса. Sugino с коллегами [22] определяли содержание малонового диальдегида и простагландина F2α в децидуальной ткани после спонтанного аборта. Выявлено повышенное содержание обоих соединений, а также повышение активности Mn-SOD, что может отражать реакцию на окислительный стресс (хотя активность Cu/Zn-SOD была значительно снижена) [22].

Ген SOD1 локализуется на хромосоме 21. Полиморфизм 7958G>A (rs4998557) обусловливает снижение активности фермента SOD1 на 50%. Ген SOD2 локализуется на хромосоме 6. Полиморфизм 47С>T (rs4880) (Ala16Val) влияет на вторичную структуру сигнального пептида. Полиморфная изоформа белка характеризуется нестабильным альфа-спиральным участком сигнального домена, что влияет на транспорт фермента из цитоплазмы в матрикс митохондрий. В результате данный полиморфизм может обусловливать дефицит фермента в митохондриях [23].

Данные литературы об ассоциации полиморфных вариантов генов супероксиддисмутаз с невынашиванием беременности первого триместра немногочисленны. Было проведено исследование ассоциации полиморфизма Ala16Val гена SOD2 со спонтанным прерыванием беременности среди женщин Северного Ирана. По результатам исследования выявлено некоторое повышение частоты генотипа ValVal среди женщин со спонтанным прерыванием беременности по сравнению с контрольной группой (р = 0.059). Однако статистически значимой ассоциации исследуемого полиморфизма с повышением риска спонтанного прерывания беременности не выявлено [24]. В настоящей работе исследование полиморфизма 7958G>A гена SOD1 выявило ассоциацию аллеля 7958А с повышенным риском спонтанного прерывания беременности. В то же время полиморфизм Ala16Val гена SOD2 не ассоциирован с невынашиванием беременности.

В результате функционирования SOD образуется пероксид водорода, который относится к активным формам кислорода. Концентрация пероксида водорода в клетке поддерживается на физиологическом уровне благодаря функционированию таких антиоксидантов как каталаза и ферменты семейства глутатионпероксидаз. Показано, что ингибирование каталазы приводит к повреждению ДНК в ядре ооцита, нарушению расхождения хромосом в мейозе [25]. Каталаза кодируется геном, локализованным на хромосоме 11. Известны несколько аллельных вариантов гена CAT, обусловливающих снижение каталитической активности фермента. Одним из них является SNP –262C>T (rs1001179), который изменяет экспрессию гена каталазы за счет модификации сайта связывания фактора транскрипции. Показано, что данная замена приводит к снижению уровня активности каталазы [26]. Анализ геномной ДНК 105 женщин со спонтанным абортом из Северного Ирана и 90 здоровых женщин выявил ассоциацию SNP –262C>T гена каталазы с риском потери беременности [27].

Глутатионпероксидазы наряду с каталазой обеспечивают детоксикацию перекисных радикалов. Существуют восемь изоформ глутатионпероксидаз (GPx1–GPx8), которые различаются локализацией в клетке и субстратной специфичностью. Генетическая изменчивость глутатионпероксидаз обусловливает индивидуальную вариабельность метаболизма продуктов свободно-радикального окисления. Фермент GPx4 имеет большое значение в метаболизме пероксидов липидов. GPx4 метаболизирует Н2О2 и гидроперекиси липидов, т.е. защищает мембраны от окисления фосфолипидов и липопротеинов. Кроме того, данный фермент принимает участие в процессах апоптоза, модуляции реакций воспаления путем регуляции цитокиновых сигнальных путей [28, 29]. Ген данного фермента (GPX4) локализован на хромосоме 19 и экспрессируется практически во всех клетках млекопитающих. Полиморфизм rs713041 локализован в 3'-UTR в позиции 718; может влиять на синтез фермента, изменяя афинность для молекул, взаимодействующих с 3'-UTR [30]. В настоящем исследовании не выявлено ассоциации SNPs –262C>T гена САТ и 718C>T гена GPX4 c невынашиванием беременности первого триместра.

NO участвует в расслаблении гладкой мускулатуры сосудов, регуляции роста сосудов, передаче нервных импульсов, в иммунных реакциях и др. [31]. Оксид азота также защищает стенки сосудов за счет ингибирования окисления липидов и инактивации свободных радикалов кислорода [32]. Но известно, что эффект NO зависит от его концентрации, а также от наличия и концентрации кислорода, АФК, концентрации и активности антиоксидантов. Ферменты синтеза оксида азота, в частности NOS3, способны образовывать не только NO, но и активные формы кислорода, особенно в условиях недостатка коферментов или аргинина. Таким образом, система оксида азота в клетках тесно связана с наличием молекулярного кислорода и компонентов окислительного стресса.

Ген NOS3 кодирует фермент эндотелиальную синтазу окиси азота 3. Нокаут гена оказывает негативное влияние на развитие и жизнеспособность эмбриона [33]. Известно несколько мутаций в гене NOS3, одна из них – SNP в промоторной части гена (–786T>C). Эта замена приводит к снижению синтеза эндотелиального NO, что может влиять на состояние гладкомышечных клеток сосудистой стенки. Некоторые данные указывают на то, что оптимальная концентрация оксида азота формируется у гетерозиготных носителей по полиморфизму –786T>C гена NOS3. В частности, показана более высокая эффективность имплантации яйцеклетки у женщин с таким генотипом [34].

Большая часть выявленных нами генотипов высокого риска невынашивания беременности в первом триместре характеризуется наличием аллеля –786Т гена NOS3 в гомозиготном состоянии. Такой генотип обусловливает высокий уровень транскрипции гена NOS3. Риск неразвивающейся беременности повышается при сочетании в генотипе аллеля –786Т гена NOS3 в гомозиготном состоянии с гетерозиготностью или гомозиготностью по аллелю 16Val гена SOD2. Наличие аллеля 16Val формирует условия для возникновения избытка супероксидных радикалов, который может быть результатом более низкой эффективности SOD2. Супероксид может реагировать с NO, образуя пероксинитрит, что приводит к разрушению клеточных мембран, повреждению ДНК, модификации различных белковых и липидных молекул. В результате развивается оксидативно-нитратный стресс, индуцирующий гибель клеток.

Одним из факторов, стимулирующих eNOS для синтеза оксида азота, является эндотелин. С другой стороны, NO может ингибировать синтез и гемодинамические эффекты EDN1. Полиморфизм 5665G>T гена EDN1 приводит к замене в аминокислотной последовательности (Lys198Asn). Для лиц с генотипом AsnAsn характерен более высокий уровень эндотелина в плазме по сравнению с носителями генотипа LysLys [35]. Была показана ассоциация полиморфизма Lys198Asn с уровнем вазоконстрикции и артериальным давлением. Данные литературы об ассоциации полиморфных вариантов гена эндотелина 1 с невынашиванием беременности первого триместра практически отсутствуют. Показано, что уровень экспрессии гена EDN1 в плаценте у женщин с преэклампсией был существенно выше по сравнению с контрольной группой. Для полиморфизма rs5370 показано снижение частоты генотипа GG и увеличение частоты аллеля Т для женщин с преэклампсией [36]. В другом исследовании не выявлено ассоциации rs5370 гена EDN1 c преэклампсией [37]. В настоящем исследовании установлено, что среди женщин с неразвивающейся беременностью частота гомозигот Asn/Asn гена EDN1 в 3 раза выше ожидаемой. Для женщин с данным генотипом выявлен повышенный риск остановки развития зародыша.

Таким образом, выявленные нами различия в частотах генотипов и аллелей по исследуемым аллельным вариантам генов антиоксидантов и белков, контролирующих функционирование эндотелия, а также данные, полученные MDR-методом, свидетельствуют о значимом вкладе SNP данных генов в формирование риска репродуктивных потерь у человека. Специфичная для стадии эмбрионального развития экспрессия и ткане-специфичная активация данных генов-кандидатов являются одними из ключевых компонентов на ранних этапах беременности. Однако характер экспрессии генов, особенно во взаимодействии с другими компонентами генной сети при нормально развивающейся беременности и невынашивании беременности требует дальнейших исследований.

Работа выполнена при финансовой поддержке Министерства науки и высшего образования Российской Федерации (проект № 6.6762.2017).

Все процедуры, выполненные в исследовании с участием людей, соответствуют этическим стандартам институционального и/или национального комитета по исследовательской этике и Хельсинкской декларации 1964 г. и ее последующим изменениям или сопоставимым нормам этики.

От каждого из включенных в исследование участников было получено информированное добровольное согласие.

Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов.

Список литературы

  1. Larsen E., Christiansen O., Kolte A. et al. New insights into mechanisms behind miscarriage // BMC Med. 2013. V. 11. P. 154. https://doi.org/10.1186/1741-7015-11-154

  2. Levy B., Sigurjonsson S., Pettersen B. et al. Genomic imbalance in products of conception: single-nucleotide polymorphism chromosomal microarray analysis // Obstet. Gynecol. 2014. V. 124. P. 202–209. https://doi.org/10.1097/AOG.0000000000000325

  3. Bug S., Solfrank B., Schmitz F. et al. Diagnostic utility of novel combined arrays for genome-wide simultaneous detection of aneuploidy and uniparental isodisomy in losses of pregnancy // Mol. Cytogenet. 2014. V. 7. P. 43. https://doi.org/10.1186/1755-8166-7-43

  4. Rajcan-Separovic E., Diego-Alvarez D., Robinson W. et al. Identification of copy number variants in miscarriages from couples with idiopathic recurrent pregnancy loss // Hum. Reprod. 2010. V. 25(11). P. 2913–2922. https://doi.org/10.1093/humrep/deq202

  5. Viaggi C., Cavani S., Malacarne M. et al. First-trimester euploid miscarriages analysed by array-CGH // J. Appl. Genet. 2013. V. 54(3). P. 353–359. https://doi.org/10.1007/s13353-013-0157-x

  6. Bagheri H., Mercier E., Qiao Y. et al. Genomic characteristics of miscarriage copy number variants // Mol. Hum. Reprod. 2015. V. 21(8). P. 655–661. https://doi.org/10.1093/molehr/gav030

  7. Sugino N. Reactive oxygen species in ovarian physiology // Reproductive Medicine and Biology. 2005. V. 4. P. 31–44. https://doi.org/10.1111/j.1447-0578.2005.00086.x

  8. Agarwal S., Gupta L., Sekhon L. et al. Redox considerations in female reproductive function and assisted reproduction: from molecular mechanisms to health implications // Antioxidants & Redox Signaling. 2008. V. 10. P. 1375–1403. https://doi.org/10.1089/ars.2007.1964

  9. Jauniaux E., Watson A., Hempstock J. et al. Onset of maternal arterial blood flow and placental oxidative stress. A possible factor in human early pregnancy failure // Am. J. Pathology. 2000. V. 157. P. 2111–2122. https://doi.org/10.1016/S0002-9440(10)64849-3

  10. Wang Y., Walsh S. Placental mitochondria as a source of oxidative stress in pre-eclampsia // Placenta. 1998. V. 19. P. 581–586. https://doi.org/10.1016/S0143-4004(98)90018-2

  11. Myatt L., Cui X. Oxidative stress in the placenta // Histochemistry and Cell Biology. 2004. V. 122. P. 369–382. https://doi.org/10.1007/s00418-004-0677-x

  12. Nozik-Grayck E., Suliman H., Piantadosi C. Extracellular superoxide dismutase // Int. J. Biochem. Cell Biol. 2005. V. 37. P. 2466–2471. https://doi.org/10.1016/j.biocel.2005.06.012

  13. Frendo J., Therond P., Bird T. et al. Overexpression of copper zinc superoxide dismutase impairs human trophoblast cell fusion and differentiation // Endocrinology. 2001. V. 142. P. 3638–3648. https://doi.org/10.1210/endo.142.8.8329

  14. Suryanarayana V., Rao L., Kanakavalli M. et al. Recurrent early pregnancy loss and endothelial nitric oxide synthase gene polymorphisms // Arch. Gynecol. Obstet. 2006. V. 274. P. 119–124. https://doi.org/10.1007/s00404-005-0107-x

  15. Khalil A., Hardman L., Brien P. The role of arginine, homoarginine and nitric oxide in pregnancy // Amino Acids. 2015. V. 47. P. 1715–1727. https://doi.org/10.1007/s00726-015-2014-1

  16. Pallares P., Gonzalez-Bulnes A. Intrauterine growth retardation in endothelial nitric oxide synthase-deficient mice is established from early stages of pregnancy // Biol. Reprod. 2008. V. 78. P. 1002–1006. https://doi.org/10.1095/biolreprod.107.066159

  17. Kawanabe Y., Nauli S. Endothelin // Cell Mol. Life Sci. 2011. V. 68. P. 195–203. https://doi.org/10.1007/s00018-010-0518-0

  18. Davenport A., Hyndman K., Dhaun N. et al. Endothelin // Pharmacol. Rev. 2016. V. 68. № 2. P. 357–418. https://doi.org/10.1124/pr.115.011833

  19. Rodriguez S., Gaunt T., Day I. Hardy–Weinberg equilibrium testing of biological ascertainment for Mendelian randomization studies // Am. J. Epid. Adv. Acc. 2009. https://doi.org/10.1093/aje/kwn359

  20. Jauniaux E., Hempstock J., Greenwold N. et al. Trophoblastic oxidative stress in relation to temporal and regional differences in maternal placental blood flow in normal and abnormal early pregnancies // Am. J. Pathol. 2003. V. 162. P. 115–125. https://doi.org/10.1016/S0002-9440(10)63803-5

  21. Jauniaux E., Greenwold N., Hempstock J. et al. Comparison of ultrasonographic and Doppler mapping of the intervillous circulation in normal and abnormal early pregnancies // Fertility and Sterility. 2003. V. 79. P. 100–106. https://doi.org/10.1016/S0015-0282(02)04568-5

  22. Sugino N., Nakata M., Kashida S. et al. Decreased superoxide dismutase expression and increased concentrations of lipid peroxide and prostaglandin F(2alpha) in the decidua of failed pregnancy // Mol. Hum. Reprod. 2000. V. 6. P. 642–647.

  23. Sutton A., Khoury H., Prip-Buus C. et al. The Ala16Val genetic dimorphism modulates the import of human manganese superoxide dismutase into rat liver mitochondria // Pharmacogenetics. 2003. V. 13. P. 145–157. https://doi.org/10.1097/01.fpc.0000054067.64000.8f

  24. Sabet E., Salehi Z., Khodayari S. et al. Spontaneous abortion and functional polymorphism (Val16Ala) in the manganese SOD gene // J. Obstet. Gynaecol. 2015. V. 35(2). P. 159–162. https://doi.org/10.3109/01443615.2014.937330

  25. Park Y., You S., Cho S. et al. Eccentric localization of catalase to protect chromosomes from oxidative damages during meiotic maturation in mouse oocytes // Histochem. Cell Biology. 2016. V. 146. P. 281–288. https://doi.org/10.1007/s00418-016-1446-3

  26. Nadif R., Mintz M., Jedlicka A. et al. Association of CAT polymorphisms with catalase activity and exposure to environmental oxidative stimuli // Free Radic. Res. 2005. V. 39(12). P. 1345–1350. https://doi.org/10.1080/10715760500306711

  27. Sabet E., Salehi Z., Khodayari S. et al. Polymorphisms of glutathione peroxidase 1 (GPX1 Pro198Leu) and catalase (CAT C-262T) in women with spontaneous abortion // Syst. Biol. Reprod. Med. 2014. V. 60(5). P. 304–307. https://doi.org/10.3109/19396368.2014.892651

  28. Brigelius-Flohé R., Maiorino M. Glutathione peroxidases // Biochim. Biophys. Acta. 2013. V. 1830(5). P. 3289–3303. https://doi.org/10.1016/j.bbagen.2012.11.020

  29. Crosley L., Bashir S., Nicol F. et al. The single-nucleotide polymorphism (GPX4c718t) in the glutathione peroxidase 4 gene influences endothelial cell function: interaction with selenium and fatty acids // Mol. Nutr. Food Res. 2013. V. 57(12). P. 2185–2194. https://doi.org/10.1002/mnfr.201300216

  30. Du X., Dai X., Xia Song R. et al. SNP and mRNA expression for glutathione peroxidase 4 in Kashin-Beck disease // Br. J. Nutr. 2012. V. 107(2). P. 164–169. https://doi.org/10.1017/S0007114511002704

  31. Krause J., Hanson M., Casanello P. Role of nitric oxide in placental vascular development and function // Placenta. 2011. V. 32. P. 797–805. https://doi.org/10.1016/j.placenta.2011.06.025

  32. Galluccio E., Cassina L., Russo I. et al. A novel truncated form of eNOS associates with altered vascular function // Cardiovasc. Res. 2014. V. 101. P. 492–502. https://doi.org/10.1093/cvr/cvt267

  33. Pallares P., Gonzalez-Bulnes A. The effect of embryo and maternal genotypes on prolificacy, intrauterine growth retardation and postnatal development of Nos3-knockout mice // Reprod. Biol. 2010. V. 10. P. 241–248. https://doi.org/10.1016/S1642-431X(12)60044-8

  34. Maul H., Longo M., Saade G. et al. Nitric oxide and its role during pregnancy: from ovulation to delivery // Curr. Pharm. Des. 2003. V. 196. P. 359–380. https://doi.org/10.2174/1381612033391784

  35. Pousada G., Baloira A., Vilarino C. et al. Estudio del polimorfismo K198N en el gen EDN1 en pacientes afectados de hipertension arterial pulmonar // Med. Clin. (Barc). 2015. V. 144. № 8. P. 348–352. https://doi.org/10.1016/j.medcli.2013.11.037

  36. Aggarwal P., Jain V., Srinivasan R. et al. Maternal EDN1 G5665T polymorphism influences circulating endothelin-1 levels and plays a role in determination of preeclampsia phenotype // J. Hypertens. 2009. V. 27(10). P. 2044–2050. https://doi.org/10.1097/HJH.0b013e32832f7f3f

  37. Galaviz-Hernandez C., Arámbula-Meraz E., Medina-Bastidas D. et al. The paternal polymorphism rs5370 in the EDN1 gene decreases the risk of preeclampsia // Pregnancy Hypertens. 2016. V. 6(4). P. 327–332. https://doi.org/10.1016/j.preghy.2016.07.002

Дополнительные материалы отсутствуют.