1. На главную
  2. Электронные версии
  3. Генетика
  4. T. 57, № 1, 2021

Генетика, 2021, T. 57, № 1, стр. 108-111

Тест-система для in vitro скрининга кандидатов в антимикобактериальные препараты на устойчивость, опосредованную MMPS5-MMPL5-транспортерами

К. В. Шур 1, С. Г. Фролова 1, 2, Н. И. Акимова 1, В. Н. Даниленко 1, Д. А. Маслов 1, *

1 Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова Российской академии наук
119333 Москва, Россия

2 Московский физико-технический институт (национальный исследовательский университет)
141701 Московская обл., Долгопрудный, Россия

* E-mail: maslov_da@vigg.ru

Поступила в редакцию 05.02.2020
После доработки 11.03.2020
Принята к публикации 19.03.2020

Полный текст (PDF)

Аннотация

Возникновение лекарственной устойчивости к противотуберкулезным препаратам является глобальным вызовом и требует разработки новых лекарств, активных в отношении устойчивых штаммов Mycobacterium tuberculosis. Одной из задач, возникающей при разработке, является определение механизмов возникновения или осуществления такой устойчивости к кандидату в лекарство. Система эффлюкса MmpS5-MmpL5 способна обеспечивать лекарственную устойчивость микобактерий к широкому спектру антибиотиков, в том числе к бедаквилину, клофазимину, тиацетазонам, азолам и имидазо[1,2-b][1,2,4,5]тетразинам. Нами сконструирован рекомбинантный штамм M. smegmatis Δmmp5, делеционный по генам mmpS5-mmpL5 оперона и являющийся гиперчувствительным к имидазо[1,2-b][1,2,4,5]тетразинам. Сравнение чувствительности пары штаммов M. smegmatis mc2 155 и M. smegmatis Δmmp5 к кандидатам в антимикобактериальные соединения может быть использовано в качестве тест-системы для установления возможного участия системы эффлюкса MmpS5-MmpL5 в формировании устойчивости на ранних стадиях скрининга.

Ключевые слова: Mycobacterium smegmatis, тест-система, лекарственная устойчивость, противотуберкулезные препараты.

Туберкулез является одним из наиболее опасных социально-значимых заболеваний человека. В связи с постоянным ростом числа штаммов Mycobacterium tuberculosis, устойчивых к существующим противотуберкулезным препаратам (ПТП), актуальным подходом в борьбе с туберкулезом является создание принципиально новых, высокоактивных в отношении возбудителя ПТП, способных преодолевать лекарственную устойчивость [1]. По последним данным в различных фазах клинических испытаний находится около 23 новых препаратов и схем терапии туберкулезной инфекции. Однако к последнему разработанному и внедренному в клиническую практику ПТП – бедаквилину (TMC 207) [2] – уже известны случаи возникновения лекарственной устойчивости [3, 4]. Таким образом, разработка новых кандидатных противотуберкулезных препаратов требует более внимательного подхода и должна включать в себя исследование механизмов возникновения устойчивости у бактерий как вызванной мутациями (приобретенная устойчивость), так и вследствие имеющихся у бактерии систем защиты (природная лекарственная устойчивость) [5].

Один из механизмов, обеспечивающих лекарственную устойчивость микобактерий к широкому спектру антибиотиков, обусловлен клеточными транспортерами, осуществляющими обратный транспорт (эффлюкс) антибиотиков из клетки. Белки эффлюкса подразделяются на пять семейств в зависимости от их структуры, используемой энергии и субстрат-специфичности: суперсемейство АТФ-связывающих кассет (ATP-binding cassette superfamily, ABC), суперсемейство основных помощников (major facilitator superfamily, MSF), семейство малых белков множественной лекарственной устойчивости (small multidrug resistance family, SMR), семейство экструзии лекарств и токсичных соединений (multidrug and toxic compound extrusion family, MATE) и семейство белков устойчивости-клубнеобразования-деления (resistance-nodulation-division family, RND). Системы эффлюкса могут обусловливать высокий уровень устойчивости микобактерий к рифампицину, офлоксацину, этамбутолу, стрептомицину и другим антимикробным агентам [6].

Клеточные помпы микобактерий класса RND консервативны и отличаются от других транспортеров этого же класса у других бактерий. Им было присвоено отдельное название – Mmp (mycobacterial membrane proteins) [7]. Одним из представителей Mmp-транспортеров микобактерий является система MmpS5-MmpL5 [8]. Данная система кодируется генами mmpS5-mmpL5 оперона, который присутствует в геноме микобактерий, как медленно- (M. tuberculosis, M. marinum, M. bovis, M. ulcerans, M. africanum), так и быстрорастущих (M. aurum, M. smegmatis, M. intracellulare, M. abscessus, M. avium). У медленнорастущих представителей рода экспрессию оперона регулирует транскрипционный фактор семейства MarR [9], в то время как у быстрорастущих – транскрипционный регулятор TetR [10]. Мутации в гене-репрессоре приводят к сверхэкспрессии mmpS5-mmpL5 оперона, вызывая резистентность микобактерий к различным препаратам: азолам [11], клофазимину и бедаквилину у M. tuberculosis [3], производным тиоацетазона у M. abscessus [10] и имидазо[1,2-b][1,2,4,5]тетразинам у M. smegmatis [12].

Таким образом, исследование возможного участия системы MmpS5-MmpL5 в формировании лекарственной устойчивости микобактерий к разрабатываемым препаратам на ранних этапах скрининга позволит повысить качество создаваемых препаратов, активных как в отношении M. tuberculosis, так и других представителей микобактерий, обладающих опероном mmpS5-mmpL5.

В данной работе мы описываем создание диагностической пары: M. smegmatis mc2 155 и M. smegmatis с делетированным опероном mmpS5-mmpL5 (M. smegmatis Δmmp5), а также работоспособность системы с использованием перспективных противотуберкулезных препаратов класса имидазо[1,2-b][1,2,4,5]тетразинов [13]. Выбор данного организма для создания тест-системы обусловлен тем, что M. smegmatis mc2 155 является быстрорастущей непатогенной бактерией, несущей в составе своего генома (NC_008596.1) данный оперон (гены MSMEG_1381-MSMEG_1382).

M. smegmatis Δmmp5 получен методом гомологичной рекомбинации с использованием суицидной системы p2NIL/pGOAL19 [14]. Фрагмент генов MSMEG_1381-MSMEG_1382, содержащий плечи для гомологичной рекомбинации длинной 1253 и 2665 пн, был амплифицирован с использованием праймеров pN-1381-2-del-f1 5'-TTTTAAGCTTCGAAGAGAAGCGGACGTGTA-3' и pN-1381-2-d-r4 5'-TTTTGGATCCTCGGTCTCCGCATACTGTTG-3', при этом в него была внесена делеция в 2828 пн методом сайт-направленного мутагенеза по Р.М. Нельсону [15] с использованием праймеров pN-1381-2-del-r1 5'-ATGCGCGAGAACGACCTTCGGGTTGAAGTC-3' и pN-1381-2-del-f2 5'-CGAAGGTCGTTCTCGCGCATGAAAGAGGAA-3'. Амплифицированный фрагмент был клонирован в плазмиду p2NIL по сайтам рестрикции HindIII и BamHI, после чего в полученную конструкцию по сайту рестрикции PacI была лигирована кассета из плазмиды pGOAL19. Итоговой конструкцией электропорировали клетки M. smegmatis mc2 155, после чего проводили отбор единичных кроссоверов на триптон-соевом агаре (M290, Himedia, Индия), содержащем канамицин (50 мкг/мл), гигромицин (50 мкг/мл) и X-Gal (50 мкг/мл), отбирая синие колонии. Синие колонии выращивали ночь в жидкой среде Middlebrook 7Н9 c добавлением ADC (Himedia, Индия), Tween-80 и глицерина, затем высевали серийные десятикратные разведения на триптон-соевый агар, содержащий X-Gal (50 мкг/мл) и 2%-ную сахарозу. Отбирали белые колонии двойных кроссоверов и тестировали их на чувствительность к канамицину. Для отбора мутантов, несущих желаемую делецию, проводили ПЦР-скрининг с фланкирующими делецию праймерами s-13812-f 5'-ACAAAGGTGCTCGGTCGAAT-3' и s-13812-r 5'-GGACGACCAGTGTGTCGAA-3'. Делецию подтверждали севенированием по Сэнгеру.

Затем определили уровень лекарственной чувствительности сконструированного делеционного мутанта M. smegmatis Δmmp5 в сравнении со штаммом дикого типа M. smegmatis mc2 155. Анализ лекарственной чувствительности был проведен с использованием метода определения минимальных ингибирующих концентраций (МИК). Для определения МИК культуры клеток исследуемых штаммов M. smegmatis культивировали в среде Middlebrook 7Н9 ADC, содержащей полисорбат-80 и глицерин (Himedia, Индия) в течение суток при 37°С и периодическом помешивании (250 об./мин). Далее культуры уравнивали до OD600 = 0.05 средой 7H9 и вносили в ячейки 96-луночного планшета, содержащие серийные двукратные разведения исследуемых соединений. Для проведения тестирования лекарственной чувствительности были использованы имидазо[1,2-b][1,2,4,5]тетразины – 3a, 3h, 3n и 3c, описанные нами ранее [13], основной механизм устойчивости к которым обеспечен системой MmpS5-MmpL5 [12]. Оценку роста клеточных культур проводили визуально после двух суток инкубации при 37°С и периодического помешивания (290 об./мин), рис. 1.

Рис. 1.

Рост культур клеток M. smegmatis mc2 155 и M. smegmatis Δmmp5 в присутствии серийных двукратных разведений соединений 3a, 3c, 3h, 3n. Концентрации соединений указаны в мкг/мл, в каждой лунке 200 мкл: 196 мкл клеточной суспензии и 4 мкл соединений, растворенных в 2%-ном диметилсульфоксиде (ДМСО). Положительный контроль (0) содержит 2%-ный ДМСО.

Анализ результатов тестирования МИК у M. smegmatis Δmmp5 показал повышение лекарственной чувствительности к веществам класса имидазо[1,2-b][1,2,4,5]тетразины: в два раза к соединению 3а, более, чем в четыре раза – к 3с, в четыре раза – к 3h и в два раза – к 3n (табл. 1).

Таблица 1.

МИК соединений 3a, 3c, 3h и 3n у M. smegmatis mc2 155 и M. smegmatis Δmmp5

Соединение МИК, мкг/мл
M. smegmatis mc2 155 M. smegmatis Δmmp5
3a 128 64
3c >128 32
3h 64 16
3n 64 32

Результаты определения МИК соединений класса имидазо[1,2-b][1,2,4,5]тетразинов подтвердили возможность использования пары штаммов M. smegmatis mc2 155 и M. smegmatis Δmmp5 в качестве тест-системы для установления участия системы MmpS5-MmpL5 в формировании лекарственной устойчивости к разрабатываемым ПТП. Созданная и протестирована тест-система in vitro-скрининга перспективных антимикобактериальных агентов позволит проводить ранний скрининг разрабатываемых хит-соединений на предмет участия оперона mmpS5-mmpL5 в реализации лекарственной устойчивости к ним. Ввиду того, что система эффлюкса MmpS5-MmpL5 может обеспечивать устойчивость микобактерий к соединениям совершенно различных химических классов, что осложняет in silico предсказание подверженности разрабатываемых соединений MmpS5-MmpL5-опосредованному эффлюксу, использование созданной in vitro тест-системы, можно рекомендовать при исследовании всех новых классов ПТП. Также штамм M. smegmatis Δmmp5 может стать основой для выявления механизмов действия (получение спонтанных лекарственно-устойчивых мутантов) перспективных ПТП, устойчивость к которым обеспечивается данными транспортерами.

Авторы выражают благодарность В.Н. Чарушину и Г.Л. Русинову за предоставленные соединения класса имидазо[1,2-b][1,2,4,5]тетразинов.

Исследование выполнено за счет гранта Российского научного фонда (проект РНФ № 17-75-20060 “Поиск биомишеней потенциальных противотуберкулезных препаратов класса азоло [1,2,4,5]тетразинов”).

Настоящая статья не содержит каких-либо исследований с использованием в качестве объекта животных.

Настоящая статья не содержит каких-либо исследований с участием в качестве объекта людей.

Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов.

Список литературы

  1. World Health Organization. Global Tuberculosis Report 2019. Geneva: WHO, 2019. 297 р.

  2. Deoghare S. Bedaquiline: A new drug approved for treatment of multidrug-resistant tuberculosis // Indian J. Pharmacol. 2013. V. 45. № 5. P. 536–537. https://doi.org/10.4103/0253-7613.117765

  3. Andries K., Villellas C., Coeck N. et al. Acquired resistance of Mycobacterium tuberculosis to bedaquiline // PLoS One. 2014. V. 9. № 7. P. e102135. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0102135

  4. Pym A.S., Diacon A.H., Tang S.-J. et al. Bedaquiline in the treatment of multidrug- and extensively drug-resistant tuberculosis // Eur. Respir. J. 2016. V. 47. № 2. P. 564–574. https://doi.org/10.1183/13993003.00724-2015

  5. Nguyen L. Antibiotic resistance mechanisms in M. tuberculosis: An update // Arch. Toxicol. 2016. V. 90. № 7. P. 1585–1604. https://doi.org/10.1007/s00204-016-1727-6

  6. Gygli S.M., Borrell S., Trauner A. et al. Antimicrobial resistance in Mycobacterium tuberculosis: Mechanistic and evolutionary perspectives // FEMS Microbiol. Rev. 2017. V. 41. № 3. P. 354–357. https://doi.org/10.1093/femsre/fux011

  7. Li X.Z., Zhang L., Nikaido H. Efflux pump-mediated intrinsic drug resistance in Mycobacterium smegmatis // Antimicrob. Agents Chemother. 2004. V. 48. № 7. P. 2415–2423. https://doi.org/10.1128/AAC.48.7.2415-2423.2004

  8. Briffotaux J., Huang W., Wang X. et al. MmpS5/MmpL5 as an efflux pump in Mycobacterium species // Tuberculosis. 2017. V. 107. P. 13–19. https://doi.org/10.1016/j.tube.2017.08.001

  9. Radhakrishnan A., Kumar N., Wright C.C. et al. Crystal structure of the transcriptional regulator Rv0678 of Mycobacterium tuberculosis // J. Biol. Chem. 2014. V. 289. № 23. P. 16526–16540. https://doi.org/10.1074/jbc.M113.538959

  10. Halloum I., Viljoen A., Khanna V. et al. Resistance to thiacetazone derivatives active against Mycobacterium abscessus involves mutations in the MmpL5 transcriptional repressor MAB-4384 // Antimicrob. Agents Chemother. 2017. V. 61. № 4. P. e02509–16. https://doi.org/10.1128/AAC.02509-16

  11. Milano A., Pasca M.R., Provvedi R. et al. Azole resistance in Mycobacterium tuberculosis is mediated by the MmpS5-MmpL5 efflux system // Tuberculosis (Edinb). 2009. V. 89. № 1. P. 84–90. https://doi.org/10.1016/j.tube.2008.08.003

  12. Maslov D.A., Shur K.V., Vatlin A.A. et al. MmpS5-MmpL5 transporters provide Mycobacterium smegmatis resistance to imidazo[1,2-b][1,2,4,5]tetrazines // Pathogens 2020. V. 9. № 3. P. 166. https://doi.org/10.3390/pathogens9030166

  13. Maslov D.A., Korotina A.V., Shur K.V. et al. Synthesis and antimycobacterial activity of imidazo[1,2-b][1,2,4,5]tetrazines // Eur. J. Med. Chem. 2019. V. 178. P. 39–47. https://doi.org/10.1016/j.ejmech.2019.05.081

  14. Parish T., Stoker N.G. Use of a flexible cassette method to generate a double unmarked Mycobacterium tuberculosis tlyA plcABC mutant by gene replacement // Microbiology (Reading, Engl.). 2000. V. 146. № 8. P. 1969–1975. https://doi.org/10.1099/00221287-146-8-1969

  15. Nelson R.M., Long G.L. A general method of site-specific mutagenesis using a modification of the Thermus aquaticus polymerase chain reaction // Anal. Biochem. 1989. V. 180. № 1. P. 147–151. https://doi.org/10.1016/0003-2697(89)90103-6

Дополнительные материалы отсутствуют.

Инструменты

следующая статья выпуска предыдущая статья выпуска содержание выпуска

Генетика

Архивы выпусков Информация о журнале Отправить рукопись в журнал