Генетика, 2021, T. 57, № 12, стр. 1423-1437

МЕТОДОЛОГИЯ МАСШТАБНОГО ПАРАЛЛЕЛЬНОГО СЕКВЕНИРОВАНИЯ

В основе масштабного параллельного секвенирования лежит несколько различных методологических подходов: секвенирование путем синтеза после амплификации ДНК [6], секвенирование отдельной молекулы в реальном времени на ячейке [7] или с использованием нанопор [8]. Большинство платформ секвенирования второго поколения используют метод секвенирования путем синтеза. Эта технология основана на клональной амплификации ДНК ферментом полимеразой. При мономолекулярном секвенировании этап предварительной амплификации отсутствует.

К основным существенным характеристикам различных методов МПС относятся длина прочтений, производительность и частота ошибок секвенирования. Обзор данных характеристик для трех поколений методов секвенирования приведен в табл. 1. Длина прочтения, производительность и время рабочего процесса каждой из платформ в настоящее время изменяются быстрыми темпами в связи с постоянным совершенствованием методологий, поэтому данные, представленные в табл. 1, показывают только общее представление о каждом из поколений методов и платформах для секвенирования. Несмотря на то что уровень ошибок, получаемых при использовании всех существующих платформ секвенирования нового поколения, выше по сравнению с секвенированием методом Сэнгера, этот недостаток преодолевается в технологиях МПС путем многократного прочтения каждого локуса, т.е. высоким покрытием [2].

В настоящее время в сфере судебной генетики наибольшее применение нашли настольные варианты секвенаторов – это прибор MiSeq (и его модификация ForenSeq), разработанный компанией Illumina,а также секвенаторы от компании ThermoFisher Scientific – Ion Torrent PGM и Ion S5 [5].

Платформа Illumina реализует технологию циклического секвенирования в сочетании со стратегией обратимой терминации флуоресцентно меченных модифицированных дизоксирибонуклеотидтрифосфатов, концептуально аналогичной секвенированию методом Сэнгера. Замены оснований – это наиболее частая ошибка, возникающая во время секвенирования на машинах Illumina.

Платформы Ion Torrent (PGM и S5) представляют собой полупроводниковый секвенатор, который измеряет изменения pH, как следствие выделения ионов водорода при синтезе ДНК [9]. Для платформы Ion Torrent наиболее частыми ошибками являются инсерции и делеции гомополимерных участков длиной более 6 пн, поскольку корреляция между включенными нуклеотидами и изменением детектируемого напряжения не пропорциональна размеру гомополимера [8, 10]. Количество ошибок, генерируемых при секвенировании на платформе Ion Torrent (≥1%), выше, чем на платформе Illumina [11]. Однако отсутствие оптического сканирования и циклического секвенирования на платформе Ion Torrent значительного снижает время секвенирования ДНК по сравнению с платформой Illumina [12]. Протоколы ручной подготовки библиотеки ДНК для платформ Ion Torrent PGM и Ion S5 более трудоемки и громоздки по сравнению с рабочим процессом Illumina, но наличие автоматизированной станции подготовки библиотек Ion Torrent (Ion Chef System) значительно упрощает и стандартизирует рабочий процесс. Недавно аналогичные решения по автоматизации пробоподготовки были предложены и для платформы Illumina [13].

МПС КАК ИНСТРУМЕНТ ДЛЯ ГЕНОТИПИРОВАНИЯ STR- И SNP-МАРКЕРОВ

Первыми маркерами, которые стали использоваться для идентификации личности, стали маркеры ДНК, на основе семейств так называемых минисателлитных или гипервариабельных повторов ДНК. Такой тип повторов ДНК в геноме характеризуется высокой аллельной вариабельностью числа тандемных повторов (VNTR, variable number of tandem repeats). На первых этапах внедрения методов ДНК-идентификации в судебную практику для получения индивидуального профиля ДНК человека (ДНК-фингерпринт) использовали достаточно трудоемкую технологию, которая включала расщепление геномной ДНК специальными ферментами на короткие фрагменты, которые разделяли электрофоретически по размеру и гибридизовали с радиоактивно меченными пробами, соответствующими отдельным VNTR-маркерам [14, 15].

Благодаря быстрому развитию методов молекулярной биологии, в частности появлению метода полимеразной цепной реакции (ПЦР) анализа ДНК, а также разработкам платформ Applied Biosystems для капиллярного эдектрофореза, используемых для прямого определения последовательности ДНК (секвенирования ДНК) или фрагментного анализа ПЦР-продуктов, ДНК-типирование стало широко использоваться в практике судебных экспертиз. Одним из первых стандартизированных наборов, получившим международное применение в области криминалистики, стал набор базовых STR (short tandem repeats)-локусов CODIS (Combined DNA Index System). Этот набор был разработан по заказу ФБР при совместном усилии корпорации Promega и Applied Bio systems для создания стандартов ДНК-идентификации для национальной базы ДНК США, с целью увеличения эффективности идентификации прежде всего военных лиц, преступников, а также лиц, пропавших без вести. В 1997 г. был утвержден набор CODIS, состоящий из 13 базовых STR-локусов: CSF1PO, FGA, TH01, TPOX, VWA, D3S1358, D5S818, D7S820, D8S1179, D13S317, D16S539, D18S51, D21S11 и амелогенинового маркера пола. Также был создан набор локусов STR-маркеров для территории Евросоюза (ESS): FGA, TH01, D1S1656, D2S441, D3S1358, D8S1179, D10S1248, D12S391, D18S51, D21S11, D22S1045. Локусы, входящие в данные наборы, стали мировым стандартом и были рекомендованы для использования во всех криминалистических лабораториях мира [16].

Традиционный метод STR-анализа при помощи гель- или капиллярного электрофореза (КЭ) основан на выявлении количества повторяющихся “единиц” STR-маркера по размеру ПЦР-ампликона. Анализ таких маркеров с использованием платформ МПС позволяет получить больше информации – определить не только длину повторяющегося участка ДНК, но и полную последовательность как самой области повторов, так и фланкирующих ее регионов, которые часто содержат дополнительные полиморфные варианты. Многочисленные исследования продемонстрировали, что анализ STR-маркеров на основе полной последовательности локуса приводит к значительному увеличению дискриминационного потенциала маркеров по сравнению с анализом, основанным только на длине этих маркеров [17–21]. Также было отмечено, что выявляемые при этом дополнительные полиморфные варианты могут быть популяционно-специфическими. Например, в исследовании четырех основных популяционных групп США было показано, что все локусы стандартных STR-маркеров, за исключением маркера TPOX, содержат дополнительные варианты последовательности [20]. Для каталогизации новых данных вариабельных последовательностей STR-маркеров создан проект STRSeq, который суммирует все наблюдаемые “дополнительные” аллели последовательностей основных локусов STR-маркеров, используемых в судебной экспертизе [21].

Возможность выявить дополнительные вариации в последовательности ДНК при анализе STR-маркеров с использованием методологии масштабного параллельного секвенирования имеет и ряд других преимуществ. Во-первых, увеличивается точность предсказания при использовании этих маркеров для прямого сопоставления или вычислений родственных взаимосвязей. Во-вторых, более удачно решается проблема так называемых “статтер-аллелей” (или “статтер-пиков”) – наиболее распространенного артефакта, наблюдаемого при анализе STR-маркеров и вызванного проскальзыванием ДНК во время амплификации. Образование статтер-аллеля может встречаться в 6–10% продуктов амплификации. Если в копируемой нити наблюдается “проскальзывание”, то некоторые из амплифицированных цепей получаются короче, чем должен быть продукт ПЦР. C помощью масштабного параллельного секвенирования было показано, что статтер-аллели маркера зависят от нуклеотидной последовательности основного аллеля и, таким образом, уровень статтер-аллелей может быть различным для аллелей одинаковой длины, имеющих различные нуклеотидные составы. Это дает дополнительное преимущество МПС по сравнению с методом фрагментного анализа STR-маркеров, в частности позволяет дифференцировать аллели в смешанных образцах [22]. В-третьих, при работе со смесью образцов ДНК выявление дополнительных аллелей, которые ранее были бы замаскированы из-за одинаковой длины различных аллелей STR-маркера, снижает вероятность случайного совпадения профилей ДНК разных индивидов, присутствующих в смешанном образце. Использование дополнительных вариаций в локусе STR-маркера было успешно продемонстрировано для анализа смеси образцов в работе Phillips и др. [23]. Кроме того, было показано, что число прочтений, полученных при секвенировании, позволяет точно определить пропорции, в которых смешаны образцы [19].

Разделение фрагментов ДНК по размеру при проведении исследования методом МПС не является необходимым условием анализа STR-маркеров, как при использовании фрагментного анализа. Все маркеры могут быть амплифицированы с получением фрагментов наименьшей возможной длины, что важно для анализа деградированной ДНК, а количество одновременно исследуемых маркеров не ограничивается количеством флуоресцентных красителей, которые могут быть детектированы электрофоретическими системами капиллярного электрофореза. Это открывает возможность одновременного использования большего числа STR-маркеров, что, например, было продемонстрировано при использовании большой панели Y‑хромосомных и аутосомных STR, применение которых значительно повышает эффективность анализа смешанных образцов мужской и женской ДНК в образцах, полученных после сексуального насилия [24].

Современная судебно-медицинская экспертиза анализа образцов ДНК не ограничивается STR-маркерами. Однонуклеотидные полиморфные варианты (SNP или SNV) имеют ряд преимуществ при анализе деградированных криминалистических образцов ДНК по сравнению с STR-маркерами, потому что для их определения можно использовать более короткие фрагменты ДНК [25]. Например, была показана возможность определения полного профиля из 20 однонуклеотидных маркеров на ДНК из пятнен крови после длительного хранения образцов (243 дня), тогда как только 9% STR-маркеров было возможно типировать на этих же образцах. В случае образцов ДНК, выделенной из слюны после длительного хранения (147 дней), были определены 16 однонуклеотидных маркеров (81%) и 18% STR-маркеров [26].

Также на основании анализа криминалистических образцов различных тканей разной степени деградации была продемонстрирована возможность получения качественного профиля на основании SNP-панелей, тогда как генотипирование микросателлитных маркеров почти не дало положительных результатов [27]. Из 36 различных криминалистических образцов, для которых не смогли получить STR-профили или они были низкого качества, для 16 образцов (45%) были получены полные SNP-профили [28].

За последние несколько лет был опубликован ряд работ, посвященных разработке высокоинформативных SNP-маркеров, эффективных для ДНК-идентификации индивида [29, 30]. В них была показана возможность предсказаний вероятного цвета глаз, волос, кожи, а также этнического происхождения на основании анализа сочетаний гаплотипов SNP-маркеров. Наборы ДНК-маркеров для определения внешности HirisPlex [29], этногеографического происхождения AISNP [30] и идентификации личности [31] в настоящее время лежат в основе большинства коммерческих панелей для ДНК-идентификации методами масштабного параллельного секвенирования (табл. 2).

Преимущества анализа SNP-маркеров для судебных целей с помощью МПС, по сравнению с альтернативными технологиями, такие как SNaPshot и системы чипов, заключаются в первую очередь в том, что можно одновременно определять большее количество маркеров на малых количествах ДНК [32–35]. Кроме того, технология МПС позволяет дополнительно к выявлению индивидуальных генетических вариантов определять также микрогаплотипы, т.е. наборы SNP-маркеров, расположенных в непосредственной близости друг от друга (менее 100 пн). Такие микрогаплотипы демонстрируют большой потенциал в криминалистических исследованиях как для целей идентификации неизвестного индивида, так и для определения вероятного этнического происхождения [36–38].

Анализ полной последовательности ампликонов ПЦР при типировании SNP-маркеров с помощью технологии МПС дает также возможность использовать любой наблюдаемый полиморфизм в исследуемом участке ДНК для увеличения дискриминационного потенциала целевого SNP-маркера. Так, при анализе фланкирующих областей локусов, входящих в панель ForenSeq™ DNA Signature Prep Kit, в одной из популяций коренных американцев было обнаружено, что из 94 ампликонов, полученных с помощью набора Forenseq DNA Signature Prep Kit, 22 содержали дополнительные полиморфные варианты, из которых 14 оказались информативными, т.е. не были полностью сцеплены с аллелем основного маркера [36].

КОММЕРЧЕСКИЕ НАБОРЫ ДЛЯ КРИМИНАЛИСТИКИ

Одним из первых коммерчески доступных наборов для криминалистического анализа с использованием платформы для масштабного параллельного секвенирования Ilumina MiSeq FGx стал набор реагентов ForenSeq DNA Signature Prep Kit (Verogen, CA), который позволяет одновременно анализировать до 231 маркера. Этот набор реагентов содержит два набора праймеров (набор А и набор В), в состав каждого из которых входят праймеры для анализа используемых в криминалистике 27 аутосомных STR-маркеров, 24 STR-маркера Y-хромосомы, 7 STR-маркеров Х-хромосомы, маркеры пола и 94 SNP-маркера для индивидуальной идентификации (набор праймеров А). Набор праймеров B дополнительно включает праймеры для 22 фенотипических маркеров и 56 маркеров этногеографического происхождения [39].

Первая версия этого набора была протестирована Churchill et al. в 2016 г. с помощью секвенатора MiSeq (Illumina) [40]. В работе использовали образцы стандартной ДНК: 2800M (Promega^® Corporation, Madison, WI) и AmpFlSTR® Control DNA 9947A (Life Technologies Corporation), а также 10 образцов ДНК индивидов из разных мировых популяций. Чувствительность набора ForenSeq DNA Signature Prep Kit оценивали путем изменения количества ДНК, взятой в анализ: от 1 нг до 50 пг в двух контрольных образцах. При использовании 1 нг были получены полные профили по всем SNP- и STR-маркерам, совпавшие с профилями контрольных образцов ДНК. С уменьшением количества ДНК (500, 250 и 100 пг) наблюдалось “выпадение” некоторых аллелей (0.5, 1.7 и 5.6% от всех аллелей соответственно). При использовании 50 пг ДНК были успешно генотипированы только 69.4% от всех маркеров. Таким образом была показана относительная нечувствительность к колебаниям количества ДНК в диапазоне от 1 нг до 100 пг. При проведении сравнительного анализа 10 образцов с помощью ForenSeq DNA Signature Prep Kit и наборов Identifiler Plus и Yfiler (Thermo Fisher Scientific) было показано полное совпадение аллелей, полученных для каждого из образцов двумя методами, за исключением двух локусов: при анализе методом капиллярного электрофореза наблюдалось выпадение аллелей в локусах DYS392 и DYS635, а при использовании МПС – в локусе DYS392 [40].

При анализе смешанных ДНК образцов изменения в гомо- и гетерозиготности маркеров обнаруживались, если второстепенная (минорная) ДНК присутствовала в образце даже на уровне 5%. Авторы [41] считают, что при числе прочтений менее 85 000 на образец возможно увеличение количества неоднозначно определенных генотипов, что является достоверным наблюдением и может использоваться в качестве руководства в судебно-медицинской практике. Независимая проверка набора ForenSeq DNA Signature Prep Kit была проведена в работах Xavier et al. (набор праймеров А) [41] и Silvia et al. (набор праймеров B) [42]. В обоих исследованиях для всех стандартных контрольных образцов, использованных в работах, были получены полные профили STR-маркеров, за исключением двух случаев “выпадения” аллелей маркера Penta E при использовании смеси праймеров B [41]. Также в обеих работах профили всех STR-маркеров совпали с таковыми, полученными методом капиллярного электрофореза, за исключением ранее упомянутого маркера DXS10148 [20]. Заметим, что этот маркер позже был удален из панели.

При анализе чувствительности набора реагентов с использованием смеси праймеров A было выявлено “выпадение” аллеля для маркера DX10103 при использовании 250 пг ДНК. При использовании 50 пг для 93% STR-маркеров генотип образцов совпал с контрольным вариантом [42]. При этом были выявлены случаи отсутствия ампликонов (2.8%), низкого покрытия (0.6%), некорректное определение генотипа было получено для 0.6% маркеров. Для маркера D22S1045 было отмечено уменьшение среднего числа прочтений по мере увеличения размера аллеля, что наблюдалось и в других исследованиях [21, 43, 44]. Предполагают, что причиной этому мотив повтора – последовательность ATT [45]. Также сообщалось о проблемах с покрытием маркера DYS392, имеющего аналогичный мотив повтора – ATA [43, 45]. Результаты генотипирования аутосомных SNP-маркеров совпадали в трех повторностях с покрытием от 1072 до 21 чтений на локус, с правильным и полным генотипированием при использовании более 100 пг матрицы ДНК [46]. В целом эти исследования показали, что некоторые аутосомные SNP-маркеры в этом наборе, включая rs6955448 [46, 47], rs7041158 [45] и rs2920816 [45], некорректно генотипируются и в дальнейшем они были исключены из набора реагентов.

С помощью набора ForenSeq DNA Signature Prep Kit также исследовали смеси мужской и женской ДНК, выделенной из буккальных соскобов [41]. Были исследованы смеси образцов буккального эпителия мужчины и женщины. SNP-маркеры мужчины были выявлены в количестве 3.3% (смесь мужского и женского образца 1 : 20), 4.4% (смесь 1 : 10) и 34.8% (смесь 1 : 1). Недопредставленность мужских SNP-маркеров в смесях связана с совпадением некоторых аллелей мужчины с женскими аллелями [41]. Silvia и др. проанализировали образцы ДНК, выделенные из пятен крови, слюны или спермы, с выстиранной или ношенной одежды из хлопка, нейлона и джинсовой ткани [42]. Для испытаний набора использовали 1 нг ДНК. При использовании прибора ForenSeq, 13 из 15 образцов дали полные STR-профили, совпадающие с контрольным типированием (AmpFISTR Identifiler PCR Amplification Kit Life Technologies/3130xl Genetic Analyzer). В шести образцах наблюдалось место выпадения маркера Penta E. Надо отметить, что длина ампликона Penta E составляет от 362 до 467 пн, он является одним из самых длинных STR-маркеров. В образце ДНК, полученной с ношенной футболки, также три маркера (CSF1PO, D16S539, D2S1338) не были типированы корректно ни одной системой. В образце ДНК с выстиранной футболки уже девять маркеров не были генотипированы (CSF1PO, D13S317, D16S539, D18S51, D2S1338, TH01, TPOX, D7S820a, vWAa). Вероятная причина этого – деградация ДНК, полученной из образцов исследуемого материала. Для 16 образцов были получены полные профили SNP-маркеров, соответствующие профилю ДНК донора. Один локус (rs1426654) в образце ДНК с ношенных джинс был по-разному генотипирован системой MiSeqFGx (по сравнению с контрольным типированием в фирме 23andMe), вероятно из-за того, что порог гетерозиготности в MiSeq FGx был установлен на уровне 25% [42].

Вторая лидирующая на современном рынке компания, выпускающая приборы МПС для криминалистических лабораторий, – это ThermoFisher Scientific. Эта компания разработала и выпустила целый ряд панелей Precision ID для использования на платформе Ion Torrent: панель идентификационных STR-маркеров, панель идентификационных SNP-маркеров, панель SNP-маркеров для определения этногеографического происхождения, панель SNP-маркеров для определения цвета радужной оболочки глаз и цвета волос, а также для определения последовательности митохондриальной ДНК, включая отдельную панель для анализа гипервариабельных регионов митохондриальной ДНК. За последние годы большое число публикаций было посвящено тестированию этих панелей [48–51]. Например, при работе с панелью маркеров, включающей 165 маркеров для определения происхождения индивида (Precision ID Ancestry Panel), все группы исследователей отмечали, что рекомендованное фирмой-производителем число циклов амплификации (21 цикл) недостаточно для получения полных профилей по включенным в состав набора маркерам в случае использовании малых количеств (менее 1 нг) ДНК – в таких условиях 30% локусов имеют покрытие менее 100 [48–51]. При этом увеличение циклов амплификации до 25 приводит к значительному улучшению результатов, хотя и повышает аллельный дисбаланс за счет предпочтительной амплификации более коротких фрагментов ДНК. Во всех исследованиях было отмечено низкое покрытие маркера rs1296819. Pereira и др. [48] пришли к выводу, что три SNP-маркера (rs7722456, rs459929 и rs7251928) работали настолько плохо, что их следует исключить из панели (см. табл. 3). По результатам описанных выше работ как в дизайн панелей Precision ID, так и в программное обеспечение был внесен ряд изменений [52–54].

В настоящее время основной набор для анализа STR-маркеров (панель Precision ID GlobalFiler NGS STR) включает все локусы расширенной панели CODIS, а также девять дополнительных аутосомных STR-локусов, четыре маркера пола, включая DYS391. Этот набор был протестирован на приборах Ion PGM [55] и Ion S5 [56]. Значительный дисбаланс в покрытии между разными маркерами все равно сохраняется. При этом Müller et al. [55] продемонстрировали, что дисбаланс воспроизводимо изменялся, когда панель использовалась в разных лабораториях. Wang et al. [57] предложили некоторые модификации, чтобы уменьшить разницу в уровнях покрытия маркеров.

При работе с панелями STR-маркеров наблюдаемые коэффициенты статтер-аллелей различались между исследованиями [55, 57]. Wang et al. сообщают о 8%-ном проскальзывании для всех (кроме трех) маркеров. В то время как Müller et al. сообщают о более высоких коэффициентах – до 15–21% для некоторых маркеров (в обеих работах использовали 1 нг ДНК). Причина такой большой разницы между исследованиями не очевидна, хотя использование разных типов инструментов – одна из возможных причин. При этом в обоих исследованиях набор продемонстрировал хорошую чувствительность, и большинство аллелей детектировались и корректно определялись при количествах ДНК-матрицы ниже 100 пг [55, 57].

В качестве сравнительного анализа использования платформ IonTorrent и MiSeq в криминалистике можно рассматривать исследования панелей маркеров, разработанных различными фирмами. Так, панель идентификационных маркеров фирмы Qiagen, содержащая 140 аутосомных SNP, была протестирована с использованием платформ MiSeq [33] и Ion Torrent [58]. Было обнаружено, что из 140 маркеров один (rs1058083) дает стабильно низкое покрытие на обеих платформах во всех исследованиях, и в целом одни и те же SNP работают плохо во всех лабораториях, что указывает на низкую эффективность амплификации в начальной ПЦР. Покрытие, получаемое для некоторых маркеров, вероятно может зависеть от применяемой для секвенирования платформы. Так, покрытие маркера rs9951171 при секвенировании на платформе Ion Torrent в работе [58] было в 4 раза ниже, чем при использовании платформы MiSeq [33]. Типирование маркера rs1029047 оказалось проблематичным во всех исследованиях как с гомозиготными, так и с гетерозиготными генотипами; для него был выявлен значительный аллельный дисбаланс. Примечательно, что проблемы с генотипированием данного маркера также были описаны при его анализе с помощью панели от ThermoFisher [57]. Это, вероятно, связано с расположением вблизи маркера rs1029047 полиА тракта.

Аллельный дисбаланс также наблюдался во всех работах при анализе маркера rs2399332. Авторы интерпретируют этот результат по-разному: наличием полиморфизма в сайте связывания праймера [33], включением лишнего основания [47, 58], соседством с полиТ трактом, секвенирование которого приводит к ошибочной гетероплазмии в этом участке [57].

Некоторые SNP-маркеры также характеризуются менее выраженным аллельным дисбалансом (преимущественно в случае использования платформы MiSeq) или высокими показателями неправильного включения. К сожалению, на сегодняшний день нет единого стандарта параметров для анализа полученных данных. Один из примеров – порог гомозиготного генотипа, рекомендованный в трех различных исследованиях: 95% в работе [47], 90% [22] или 85% [49].

Помимо фирмы Qiagen, многие коммерческие компании, например такие как Promega (США) и NimaGene (Нидерланды), также выпустили панели для ДНК-идентификации с использованием технологии МПС.

Набор PowerSeq Auto Kit (Promega) включает 23 стандартных аутосомных STR-маркеров из системы CODIS, один Y-STR и амелогениновый маркер пола. При валидационных исследованиях PowerSeq на платформе MiSeq [59, 60], маркер D22S1045 не вызвал замечаний, в отличие от ранее упомянутых проблем в наборе ForenSeq DNA Signature Prep Kit (Verogen). Исследования чувствительности с помощью системы PowerSeq Auto демонстрируют “выпадение” аллелей только при использовании менее 62 пг ДНК [60]. Parson и др. провели эксперименты по оптимизации системы PowerSeq Auto/Y и указали на целый ряд усовершенствований лабораторного процесса путем удаления, модификации или автоматизация различных шагов [61].

Для использования дополнительных информативных полиморфных вариантов в STR-маркерах также требуется коррекция номенклатуры этих маркеров. Были предложены различные системы номенклатуры STR-аллелей, содержащих дополнительные SNP [17, 61, 62]; кроме того, комиссия ДНК Международного общества судебной генетики опубликовала ряд своих рекомендаций [63]. Тем не менее на сегодняшний день общепризнанных рекомендаций для номенклатуры STR еще не выпущено. Одна из причин этой задержки – недостаточный объем популяционных данных для создания единой номенклатуры. Эта проблема частично решается в последние годы – уже представлены результаты крупных популяционных исследований [20, 21, 64, 65] и разработана база STRseq для каталогизации вариантов STR-маркеров [20].

ТЕХНОЛОГИЧЕСКИЕ ПЕРСПЕКТИВЫ СЕКВЕНИРОВАНИЯ НА ДРУГИХ ПЛАТФОРМАХ

Компания MGI Tech Co., Ltd. (Шэньчжэнь, Китай) недавно запустила серию новых машин МПС, основанных на технологии комбинаторного синтеза зонд-якорь (cPAS, сombinatorial Probe-Anchor Synthesis) “наношариков” ДНК (DNB, DNA Nanoballs) [66]. При подготовке библиотек для секвенирования ДНК расщепляют до фрагментов длиной около 500 пн, к ней лигируют специальные адаптеры, обеспечивающие последующую циркуляризацию фрагментов ДНК и амплификацию их по типу катящегося кольца с укладкой длинной цепи ДНК в компактные “наношарики”. Использование такого типа клональной амплификации исключает накопление ошибок ДНК-полимеразы в ходе ПЦР, так как матрицей в каждом цикле служит только исходный фрагмент ДНК. Дальнейшее секвенирование происходит с использованием подхода комбинаторного синтеза зонд-якорь, при этом генерируются считывания парных концов длиной 50–150 нуклеотидов.

На сегодняшний день опубликованы лишь единичные работы, представляющие использование платформы MGI при проведении судебно-медицинской экспертизы. Первая работа была посвящена определению отцовства с использованием SNP-маркеров в исследовании Chang и др. [67].

Совсем недавно компания MGIEasy (MGI Tech, Шэньчжэнь, Китай) разработала криминалистическую панель для использования на платформе MGI [68]. Указанная панель позволяет проводить одновременный анализ 362 генетических маркеров, включая маркеры ядерного и митохондриального геномов. Панель включает маркеры пола, 52 аутосомных STR-маркера, 27 STR-маркеров X-хромосомы, 48 STR-маркеров Y-хромосомы и 227 SNP-маркеров для идентификации личности, определения вероятного этногеографического происхождения и вероятной внешности, а также позволяет анализировать все гипервариабельные регионы мтДНК. В качестве преимущества системы MGIEasy разработчики выделяют малый размер ампликонов для маркеров, входящих в панель (около 150 пн), при этом для 210 SNP-маркеров он составляет меньше 90 пн. В работе Ran Li представлены первые результаты валидации этого набора и самой платформы MGI для криминалистики [68].

Хотя секвенирование с помощью технологии синтеза (SBS) в настоящее время все же доминирует в области МПС, предпринимается множество попыток ввести другие подходы и преодолеть недостатки секвенирования 2-го поколения [2].

В настоящее время наиболее перспективной технологией является нанопоровое секвенирование, основанное на детекции изменения ионного тока при прохождении молекулы ДНК через белковую пору. Эта технология представляет собой секвенирование в реальном времени с возможностью определять последовательность ДНК длиной несколько сотен тысяч нуклеотидов.

Недавно был представлен портативный секвенатор на основе нанопор MinION (Oxford Nanopore Technologies). Cornelis et al. впервые исследовали возможность его использования в криминалистике для анализа SNP-маркеров [69]. Авторы проанализировали контрольный образец 9947 А (Promega, Madison, US) по 52 SNP-маркерам, разработанным консорциумом SNPforID [27], и сопоставили данные с генотипами, полученными с помощью секвенирования на платформе Illumina. Для анализа использовали 2.5 нг ДНК, полученные ампликоны лигировали друг с другом случайным образом для создания более длинных фрагментов ДНК, необходимых для нанопорового секвенирования. Среднее полученное в результате секвенирования покрытие локуса составило 17 933, что достаточно для генотипирования SNP-маркеров. Для маркера rs1029047 было получено наименьшее количество чтений, вероятно из-за расположения в участке поли-A тракта. Об аналогичных трудностях секвенирования гомополимерных областей также сообщали в работе Loman et al. [70]. Для двух локусов SNP (rs143232 и rs1031825), один из которых соседствует, а второй находится внутри гомополимерного участка (см. табл. 3 ), наблюдался значительный аллельный дисбаланс. В результате анализа при помощи пакета программ Metrichor service, разработанного Oxford Nanopore Technologies, генотип для маркера rs1031825 в гомозиготном образце был неправильно определен как гетерозиготный. Очевидно, при разработке панелей маркеров, ориентированных на систему MinION, следует особенно строго избегать гомополимерных участков.

В настоящий момент к основным недостаткам системы MinION относятся высокая частота ошибок при секвенировании (до 15%, по сравнению с 0.5% у Illumina) и несовместимость с существующими криминалистическими базами данных, содержащими в основном STR-профили индивидов [71, 72], что однако относится и к SNP-панелям для других платформ. Тем не менее недавние исследования [72, 73], в которых проверялась применимость этой технологии для идентификации ДНК, демонстрируют хорошие перспективы для использования системы MinION в судебно-медицинских исследованиях. Так, Zaaijer et al. [72] разработали специальный модуль для биоинформационной обработки данных, полученных с помощью MinION, и показали, что этот подход позволяет достичь совпадение профилей ДНК для 91–195 SNP с точностью 99.9%, при этом сам процесс секвенирования занимает всего 3 минуты. Хотя подход, использованный в этом исследовании, пока не совместим с существующими методологиями судебной экспертизы и базами данных, он демонстрирует прекрасный потенциал для оперативной ДНК-идентификации в полевых условиях, когда доступ к стандартным технологиям профилирования ДНК ограничен, а также в критически ограниченных по времени случаях, когда надо повторно идентифицировать неизвестного индивида или сделать анализ близкого родства у жертв катастроф непосредственно на месте происшедшего [73].

ПЕРСПЕКТИВЫ И НАПРАВЛЕНИЯ РАЗВИТИЯ

К преимуществам использования МПС можно отнести возможность анализировать и другие типы нуклеотидных последовательностей. Например, анализ статуса метилирования определенных регионов ДНК для определения возраста индивида [74], использование РНК-маркеров для идентификации жидкостей организма [75]. Интересно, что уже апробируются для криминалистических целей недавно разработанные протоколы МПС, которые позволяют использовать образцы с малым количеством геномного материала для одновременного анализа РНК и ДНК. Использование новых видов маркеров актуально для особенных случаев идентификации, например дифференцирования одного из монозиготных близнецов [76].

В связи с тем, что современные генетические технологии уже широко применются в криминалистике, возникла необходимость создания на основе результатов генетических экспертиз судебных баз данных. На данный момент уже более 60 стран мира создали национальные базы данных судебно-медицинской экспертизы ДНК на основе STR-маркеров, среди которых, например, общепринятая база данных CODIS и Национальная база данных ДНК Великобритании. Количество и объемы информации, содержащиеся в этих базах данных, продолжают быстро расти. Например, национальная база данных судебной экспертизы Китая насчитывает более 27 миллионов записей об индивидуальных STR-профилях. Совместить уже имеющиеся базы данных и профили ДНК, полученные с использованием МПС, – задача, которую необходимо решить. Разработаны программы и веб-приложения, чтобы помочь судебным экспертам просто и эффективно работать с данными MPS, особенно при типировании STR маркеров [77, 78]. Разрабатываются алгоритмы, которые генерируют имена для секвенированных аллелей STR на основе старой номенклатуры, но с учетом новых SNP, в соответствии с рекомендациями Международного общества судебной генетики (ISFG) [61], например программа STRNaming [79].

Кроме того, уже сейчас возникает необходимость внесения изменений в международные и национальные законодательства с целью хранения и использования в судебной практике генетических данных, определенных с помощью как традиционных методов судебно-генетического анализа, так и новых видов геномных данных, полученных с помощью методов и платформ МПС [80, 81]. В Российской Федерации в настоящее время рассматриваются изменения закона “О государственной геномной регистрации в Российской Федерации”, с целью формирования федеральной базы данных геномной информации (ФБДГИ) для более эффективного использования данных полного генома для раскрытия и предотвращения преступления, в том числе особо тяжких (террористических актов, убийств и изнасилований) [82].

Еще одна немаловажная проблема, стоящая на пути массового внедрения МПС в область судебной медицины и криминалистики, – необходимость подготовки большого количества профильных специалистов высокого уровня.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

На сегодняшний день среди платформ для масштабного параллельного секвенирования приборы Illumina имеют значительные преимущества перед другими платформами благодаря высокой точности анализа, большой пропускной способности, а также широкого диапазона доступных коммерческих панелей. Тем не менее высокая степень кросс-платформенной совместимости позволяет предположить, что в будущем возможна успешная адаптация разработанных криминалистических панелей для использования на любых платформах для масштабного параллельного секвенирования.

Технологии секвенирования ДНК совершенствуются очень быстрыми темпами: модернизируются новые методы МПС (секвенирование 3-го поколения), разрабатываются полностью автоматизированные системы (конвейеры), в которых весь процесс подготовки образцов и секвенирования происходит без вмешательства человека. Очевидно, что уже в ближайшем будущем платформы МПС будут использоваться при проведении рутинных судебно-медицинских исследований ДНК.

Работа поддержана Государственным контрактом № 011-17 от 26.09.2017 г.

Настоящая статья не содержит каких-либо исследований с использованием в качестве объекта животных.

Настоящая статья не содержит каких-либо исследований с участием в качестве объекта людей.

Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов.