Генетика, 2021, T. 57, № 5, стр. 536-543

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Растительный материал и ДНК-экстракция. В исследовании использовали 17 сортов и один перспективный сортообразец люцерны российской селекции (табл. 1), принадлежащих к разным видам: Medicago varia Mart. (N = 15), Medicago sativa L. (N = 2), Medicago lupulina L. (N = 1). Экспериментальная работа по генотипированию сортов проводилась на семидневных проростках (по 30 шт. на образец), выращенных в чашках Петри. Тотальную геномную ДНК выделяли с помощью модифицированного SDS метода [13] и разбавляли до концентрации 20 нг/мкл.

SRAP-анализ. В исследовании использовали пять прямых и пять обратных SRAP-праймеров, образующих в общей сложности 25 комбинаций (табл. 2).

Реакционная смесь объемом 25 мкл содержала 10× Taq Turbo buffer, 50× dNTP mix, 5 U Taq-ДНК полимеразы, а также по 0.2 мкМ каждого праймера и 20 нг ДНК. Амплификация осуществлялась на приборе “Bio-Rad iCycler, USA” в соответствии с условиями, предложенными Li и Quiros [7] с внесением некоторых модификаций. Детекция результатов ПЦР проводилась путeм электрофореза в 1.6%-ном агарозном геле. Для оценки размера фрагментов продуктов амплификации использовался молекулярный маркер 1kb DNA Ladder (“Евроген”, Россия). Визуализация фрагментов амплификации проводилась на приборе “Gel Doc™ XR+” (Bio-Rad, USA).

Анализ данных. Размер продуктов амплификации определяли с использованием программы Image Lab. Для каждой праймерной пары были составлены бинарные матрицы. Показатели генетического разнообразия рассчитывали с помощью программы PopGene. Определяли: эффективное число аллелей на локус, индекс Шеннона, индекс генетического разнообразия, индекс генетического сходства и дистанции Нея. На основе данных генетических дистанций Нея составлена дендрограмма методом невзвешенной попарной группировки с усреднением UPGMA.

РЕЗУЛЬТАТЫ

SRAP-анализ. В нашем исследовании семь из 25 протестированных комбинаций SRAP-праймеров генерировали чeткие и воспроизводимые продукты амплификации на большинстве тестируемых сортов люцерны.

Показатели генетического разнообразия сортового материала, полученные с помощью семи информативных праймерных пар, представлены в табл. 3. В общей сложности с использованием SRAP-маркеров удалось выявить 129 воспроизводимых ПЦР-продуктов длиной от 50 до 708 пн, из которых 41 оказался полиморфным. Количество полученных ПЦР-фрагментов на одну комбинацию SRAP-маркеров варьировало от девяти до 27 при среднем показателе 18.4 ампликона на праймерную пару. Число полиморфных бэндов составляло от 3 до 9, в среднем 5.9 – на комбинацию праймеров. Наибольшее количество полиморфных продуктов (9) было получено с праймерами F13-R7. Уровень полиморфизма при использовании данной комбинации составил 50%. Эффективное число аллелей (N_e) находилось в диапазоне от 1.2637 до 1.4367. Коэффициент генетического разнообразия по Нею составил от 0.1941 (F13-R7) до 0.2716 (F13-R9) со средним значением 0.2503. Индекс разнообразия Шэннона варьировал от 0.3357 до 0.4305 со средней 0.4038.

На рис. 1 представлена электрофореграмма ПЦР-продуктов, полученных с использованием пары праймеров F10-R7, где черной стрелкой обозначен специфический ампликон для сорта Селена (316 пн), белой стрелкой – для сорта Мира (275 пн).

Рис. 1.

Электрофореграмма продуктов амплификации ДНК сортов люцерны с комбинацией SRAP-праймеров F10-R7. Расшифровка аббревиатур дана в табл. 1.

На базе бинарных матриц подсчитали индексы генетического сходства и дистанции Нея для выявления филогенетических отношений между сортами (табл. 4). Наименьший коэффициент генетического сходства (0.6667) был обнаружен между сортами Сарга и Лада, а также Пастбищная и Тамбовчанка. Наибольший (0.8837) – между образцами Камелия и Воронежская 9. Наименьшие генетические дистанции (0.1236) наблюдались между сортами Камелия и Воронежская.

Дендрограмма, полученная по методу UPGMA (рис. 2), позволила выявить пять кластеров и подгрупп. В первую группу вошли сорта Луговая 67 и Вега 87. Вторая группа представлена тремя подгруппами, а именно: 2a – Лада, Агния и Тамбовчанка; 2б – Камелия, Воронежская, 2в – Влада, Таисия и Селена. В третью группу вошел сорт люцерны хмелевидной Мира. Четвертая группа включает такие сорта как Вела и Сарга, выделившиеся в подгруппу 4a, Пастбищная 88 и А2 – подгруппа 4б. Пятая группа представлена тремя сортами – Узень, Находка, Благодать. Проведенный анализ позволил выявить специфические продукты амплификации для 14 из 18 исследуемых сортов (рис. 3).

Рис. 2.

UPGMA-дендрограмма, основанная на значениях генетических дистанций Нея для исследуемых сортов люцерны.

Рис. 3.

Информативные комбинации SRAP-праймеров, выявляющие специфические ампликоны в сортах люцерны.

Так, наибольшим числом комбинаций SRAP-праймеров (N = 5) удалось идентифицировать сорта Мира и Луговая 67. Для сортов Агния, Камелия, Воронежская и сортообразца А2 протестированные комбинации не образовали специфических продуктов. Две пары праймеров (F9-R9 и F10-R8) обнаружили различия в шести исследуемых сортах. Комбинация F13-Em2 позволила идентифицировать два сорта: Луговая 67 и Вега 87. Для некоторых сортов с использованием одной комбинации праймеров одновременно было получено от двух (F13-Em2 и F13-R7 на сорте Луговая 67; F9-R9 на сорте Тамбовчанка; F10-R7 на сорте Благодать; F10-R8 на сорте Лада) до трех специфических продуктов амплификации (F13-R7 на сорте Вега 87).

ОБСУЖДЕНИЕ

В настоящее время исследования с использованием SRAP-маркеров проведены на большом количестве сельскохозяйственных культур [14, 15]. В частности, этот вид ДНК-маркеров применялся для изучения генетического разнообразия зарубежных видов и сортов люцерны [16–20].

По результатам настоящей работы на сортах люцерны российской селекции уровень полиморфизма равнялся 31.7%. При этом его максимальное значение зафиксировано на комбинации праймеров F13-R7 (50%), а минимальное – на F9-R9 (28%), что свидетельствует о различной эффективности праймерных пар на исследуемых сортах. Эти показатели различаются с данными других авторов. В частности, при изучении генетического разнообразия 15 популяций люцерны [16] уровень полиморфизма составил 90%. В исследованиях H.B. Rhouma с соавт. [17] анализировались сорта и естественные популяции из Туниса, Казахстана, Сербии, Австралии и США с помощью SRAP-маркеров. В этом случае процент полиморфизма достигал 100%. При изучении сортов люцерны из Саудовской Аравии уровень полиморфизма равнялся 98.3% [18]. В работах 2011 г., проведенных на иранских [19] и китайских [20] сортах люцерны, уровень полиморфизма составил 49 и 40.93% соответственно. Полученные различия по-видимому могут быть связаны с высоким уровнем генетического сходства большинства исследуемых сортов (оригинатор ФНЦ “ВИК им. В.Р. Вильямса”).

Исходя из значения коэффициента генетического сходства, можно сделать вывод о наибольшей степени ДНК-полиморфизма между сортами Сарга и Лада, а также между Пастбищная 88 и Тамбовчанка (0.6667). При этом наибольшее сходство (0.8837) наблюдалось между сортами Камелия и Воронежская 9.

По значениям генетических дистанций Нея наиболее отдаленными оказались сорта Находка (ФНЦ “ВИК им. В.Р. Вильямса”) и Тамбовчанка (ОНО “Моршанская селекционная станция”). Это может быть обусловлено видовой принадлежностью этих сортов и различиями в происхождении. Наименьшая генетическая дистанция выявлена между сортами Камелия и Воронежская 9 (оба сорта отличаются повышенной зимостойкостью). Из 18 анализируемых образцов с использованием маркерной системы SRAP удалось выявить специфические продукты амплификации для 14 сортов. Это свидетельствует о высокой информативности тестируемой маркерной системы. Таким образом, маркерная система SRAP может использоваться для ДНК-идентификации российских сортов люцерны с целью их последующей паспортизации.

Настоящая статья не содержит каких-либо исследований с использованием в качестве объекта животных.

Настоящая статья не содержит каких-либо исследований с участием в качестве объекта людей.

Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов.