Генетика, 2022, T. 58, № 4, стр. 463-469

Дрозофила широко используется в качестве модельного объекта в исследованиях молекулярно-генетических механизмов ответа на воздействие на организм различных ксенобиотиков, в том числе ответа на инсектициды [1]. Метаболизм инсектицидов, как и других ксенобиотиков, происходит в ходе трех последовательных фаз: фаза I осуществляется цитохромами P450, фаза II осуществляется глутатион-S-трансферазами, UPD-глюкоронозилтрансферазами и карбоксилэстеразами, фазу III осуществляют ABC-транспортеры, которые выводят продукты метаболизма ксенобиотиков из клетки [2]. Активация отдельных цитохромов в ответ на ксенобиотики может быть ткане- и полоспецифична, основными структурами, в которых происходит метаболизм ксенобиотиков, являются жировое тело, средняя кишка и мальпигиевы сосуды [3, 4].

Борная кислота является одним из распространенных инсектицидов. Ее действие на гистологическом уровне было продемонстрировано на Blatella germanica: при содержании борной кислоты в корме в больших концентрациях (20%) происходит полное разрушение эпителия средней кишки рыжего таракана [5]. При этом происходит активация глутатион-S-трансфераз в ответ на окислительный стресс, а также снижение активности ацетилхолинтрансферазы – мишени нейротоксичных инсектицидов, что свидетельствует о влиянии борной кислоты на нервную систему [5]. Борная кислота приводит к аномалиям средней кишки и мальпигиевых сосудов у муравьев-листорезов [6], аргентинских муравьев [7] и личинок медоносной пчелы [8], а также к дефектам средней кишки и жирового тела у восковой моли [9]. Конкретные физиологические механизмы воздействия борной кислоты на организм насекомых пока не изучены.

Drosophila melanogaster широко используется в качестве модельного объекта в исследованиях, касающихся различных окислителей, мутагенов и ксенобиотиков, в том числе борной кислоты [10, 11]. В ходе исследования [11] с использованием более 200 инбредных линий из коллекции DGRP (Drosophila Genetic Reference Panel) было проведено QTL-картирование локусов, связанных с метаболизмов борной кислоты у D. melanogaster, в ходе которого был выявлен единственный ген-кандидат – Cyp9b2, кодирующий цитохром семейства P450, нокдаун которого приводил к снижению примерно в 1.5 раза выживаемости восьмидневных самок на среде, содержащей полуторапроцентную борную кислоту [11].

Ген Cyp9b2 расположен в одном кластере с геном Cyp9b1. Гены образовались в результате дупликации: выравнивание нуклеотидных и аминокислотных последовательностей генов Cyp9b1 и Cyp9b2 показывает, что нуклеотидные последовательности генов Cyp9b1 и Cyp9b2 идентичны на 81%, а аминокислотные последовательности – на 75% (сходство составляет 86%). Следующий ближайший гомолог гена Cyp9b2, ген Cyp9f2, имеет с ним 62% сходства по аминокислотной последовательности продукта. Таким образом, гены Cyp9b1 и Cyp9b2 с большой вероятностью имеют сходную функцию, и оба могли бы вносить вклад в устойчивость к борной кислоте, взаимодействуя по типу полимерии. В исследовании [11] для инактивации гена Cyp9b2 использовали метод РНК-интерференции, что могло не исключать перекрестного выключения в данном эксперименте гена Cyp9b1.

Исследуя транскриптом лабораторной линии SS7K, мы обнаружили нонсенс-мутацию в первом экзоне гена Cyp9b1 (С91Т), причем линия оказалась гомозиготной по этой мутации [12]. Проведя анализ имеющихся лабораторных линий дикого типа, в том числе D32 (Д32), Canton-S, Oregon, методом аллель-специфичной-ПЦР, мы обнаружили, что данная мутация присутствует в некоторых линиях, но гомозиготные по мутации линии обнаружены не были. Так, линия Сanton-S полиморфна по этой же точковой мутации, и, по нашим подсчетам, частота мутантного аллеля Cyp9b1 в этой линии составляет около 10%. Таким образом, мутация в линии SS7K скорее всего не возникла в процессе культивирования в лаборатории, а присутствует в природных популяциях D. melanogaster.

Мы решили проверить, влияет ли инактивация гена Cyp9b1 на устойчивость к борной кислоте. В качестве контроля использовали линию дикого типа D32 из коллекции кафедры генетики МГУ, не содержащего мутацию в гене Cyp9b1. Поскольку сравниваемые линии имеют различный генетический фон, выживаемость исследовали и у их гибридов первого и второго поколений. В эксперименте использовали самок возрастом семь дней (по 100 особей каждой линии, по 25 особей в пробирке) инкубировали на среде, содержащей борную кислоту (1%), количество умерших мух подсчитывалось через 72, 96 и 120 часов после начала эксперимента. Последняя точка – 120 ч – максимальная продолжительность жизни на среде с борной кислотой для линии дикого типа в нашем эксперименте. В результате было выявлено, что выживаемость у особей линии SS7K несколько выше, чем у особей линии D32, но не очень значительно. Однако у гибридов линий SS7K и D32 как первого, так и второго поколения, наблюдалась значительно повышенная выживаемость на борной кислоте: через 96 ч инкубации выживаемость гибридов составляла 70–75% (рис. 1, p < 0.03 для всех сравнений в этой точке, кроме SS7K×D32_F2).

Рис. 1.

Выживаемость на среде, содержащей борную кислоту (верхняя часть рисунка), и уровень экспрессии генов Сyp9b1 и Cyp9b2 (нижняя часть рисунка) у самок линий SS7K, несущей мутацию в гене Cyp9b1, дикого типа D32, а также их гибридов первого и второго поколений (* – p < 0.5, ** – p < 0.01, *** – p < 0.001 по критерию Манна–Уитни; ns, not significant – незначимое изменение).

Чтобы ответить на вопрос, связана ли каким-то образом повышенная выживаемость гибридов с функцией гена Cyp9b1, мы провели генотипирование гибридных особей, выживших на борной кислоте через 120 ч инкубации, на наличие мутации в гене Cyp9b1. Выяснилось, что выживаемость гибридов не зависит от наличия мутации в гене Cyp9b1: расщепление по генотипу среди выживших особей составило 1/4 Cyp9b1+/Cyp9b1+ : : 1/2 Cyp9b1+/Cyp9b1 : 1/4 Cyp9b1/Cyp9b1. Таким образом, обнаруженный эффект повышения устойчивости к борной кислоте у гибридов не связан с мутацией в гене Cyp9b1, и может быть объяснен формированием нового генотипа у гибридов, что привело либо к активации функции неизвестных генов, участвующих в формировании устойчивости к борной кислоте у гибридов, либо к изменению регуляции экспрессии генов Cyp9b1 и Cyp9b2. Далее мы проверили, зависит ли повышение выживаемости от уровня экспрессии генов Cyp9b1 и Cyp9b2.

Выделение тотальной РНК из целых мух производили с помощью реактива ExtractRNA (Евроген) после 48-часовой инкубации на среде с борной кислотой в четырех биологических повторах. Перед постановкой реакции обратной транскрипции образцы РНК обрабатывали ДНКазой I (Fermentas). Для обратной транскрипции использовали набор MMLV-RT Kit (Евроген). ПЦР-РВ в присутствии SYBR Green I (Синтол) ставили в амплификаторе MiniOpticon Real-Time PCR System (Bio-Rad). В опыте анализировали относительную экспрессию генов Cyp9b1 и Cyp9b2, нормированную на экспрессию генов αTub84D, Rpl40 и Elo-B. Для аллель-специфичной ПЦР использовали праймеры к гену Cyp9b1 (5'-CCTTAAAGGTGCCAGTACTC/Т-3' и 5'-CAGTTAGCATTAATACATCAGGTG-3'), для ОТ-ПЦР использовали праймеры к генам: Cyp9b1 (5'-TGCAGCCATGTTACCTAAA-3' и 5'-CAGTTAGCATTAATACATCAGGTG-3'), Cyp9b2 (5'-GGAAGCACATGAGAAACAC-3' и 5'-GTTGGAGAGCTTGTTGCACA-3'), RpL40 5'‑CTGCGTGGTGGTATCATTG-3' и 5'-CAGGTTGTTGGTGTGTCC-3'), Elo-B (5'-GCACAAACATACACACTCACG-3' и 5'-TTTCCTACTTCGCTTGCACC-3'), αTub84D (5'-GTGCATGTTGTCCAACACCAC-3' и 5'-AGAACTCTCCCTCCTCCATA-3').

Выявлено, что уровень базовой (неиндуцированной) экспрессии гена Cyp9b1 одинаков у всех линий и примерно в пять раз ниже, чем уровень базовой экспрессии гена Cyp9b2 у линии дикого типа (рис. 1). Уровень базовой экспрессии гена Cyp9b2 значительно выше у линии SS7K по сравнению с линией дикого типа и гибридами. Борная кислота активирует транскрипцию гена Сyp9b1 до уровня базовой транскрипции гена Cyp9b2 в линии дикого типа, а в линии SS7K и у гибридов уровень индуцированной транскрипции гена Сyp9b1 примерно одинаков и в два раза ниже, чем в линии SS7K. Однако уровень транскрипции гена Cyp9b2 у гибридов на среде с борной кислотой активируется в 2.5–3 раза по сравнению с родительскими линиями. Таким образом, повышенный уровень выживаемости у гибридов обусловлен именно повышенным уровнем экспрессии гена Cyp9b2, так как значительное повышение экспрессии этого гена у гибридов коррелирует с их повышенной выживаемостью на среде с борной кислотой.

Суммарный уровень индуцированной транскрипции генов Сyp9b1 и Cyp9b2 в линии D32 сравним с таковым для гена Cyp9b2 в линии SS7K. Если предположить, что гены работают аддитивно, то, при условии отсутствия (из-за наличия стоп-кодона) белкового продукта гена Cyp9b1 линии SS7K, должна была бы наблюдаться повышенная устойчивость к борной кислоте в линии D32, а не в SS7K. Однако количество белковых продуктов не обязательно должно быть пропорционально количеству транскриптов и, тем более, выживаемости. Последнее следует из данных по гибридам, у которых транскрипция гена Cyp9b2 на среде с борной кислотой повышена примерно в три раза, а выживаемость – не более, чем в два раза, и то в определенных временны́х точках (рис. 1). Таким образом, опираясь на данные исследования [11] и полученные в настоящем исследовании данные, можно заключить, что выживаемость на борной кислоте строго коррелирует с уровнем транскрипции гена Cyp9b2, а экспрессии гена Сyp9b1 недостаточно, чтобы значимо повлиять на уровень устойчивости к борной кислоте.

По данным масштабного транскриптомного анализа, результаты которого размещены в базе данных FlyBase [13], уровень базовой транскрипции гена Cyp9b1 оценивается у имаго как очень низкий (2–3 условные единицы), Cyp9b2 – как умеренный (14–16 условных единиц). Очень высокий уровень неиндуцированной транскрипции гена Cyp9b2 (более 150 условных единиц) наблюдается в пищеварительной системе, высокий (50–100 условных единиц) – в тканях головы и каркаса. Для гена Cyp9b1 в тканях головы и пищеварительной системы наблюдается умеренный уровень (11–17 условных единиц) экспрессии. Характер экспрессии генов Cyp9b1 и Cyp9b2 в разных тканях и в ответ на воздействие различных ксенобиотиков в целом схож. Согласно анализу корреляции профилей экспрессии, проведенному FlyBase на основании сравнения транскриптомных данных, корреляция транскрипции генов Cyp9b1 и Cyp9b2 в разных тканях и в ответ на воздействие стрессоров, составляет 84.4 и 91.7% соответственно, что может свидетельствовать о сходном контроле транскрипции этих генов. Однако в списке HitList коррелирующих по профилю экспрессии в разных тканях генов, кроме Cyp9b1 и Cyp9b2, присутствуют еще шесть генов цитохромов (Cyp6g1, Cyp28d1, Cyp4ac1, Cyp6w1, Cyp6a2, Cyp4p1), а в списке коррелирующих по профилю экспрессии генов в ответ на стрессовые воздействия наряду с Cyp9b1 и Cyp9b2 присутствуют еще десять генов цитохромов (Cyp12a5, Cyp6a9, Cyp6a21, Cyp4p1, Cyp6a23, Cyp12e1, Cyp6a17, Cyp6a14, Cyp4d14, Cyp6d4). Таким образом, списки генов цитохромов, индуцируемых в разных тканях и в ответ на стрессовые воздействия, в основном, не пересекаются и содержат только три одинаковых гена – Cyp9b1, Cyp9b2 и Cyp4p1. Последний ген не попал в круг рассматриваемых кандидатов, выявленных в работе [11], и имеет незначительное структурное сходство с геном Cyp9b2 (Cyp4p1 и Cyp9b2 на 25% идентичны и на 40% сходны по аминокислотным последовательностям).

Следует отметить, что кроме корреляции профилей транскрипции, необходимо сравнивать еще уровень транскрипции генов цитохромов. Так уровень индуцированной экспрессии гена Cyp9b2 выше, чем Cyp9b1, в пять раз в тканях головы и каркаса и в 20 раз выше в тканях пищеварительной системы. Такой высокий уровень экспрессии гена Cyp9b2 в тканях пищеварительной системы может объяснять устойчивость к борной кислоте, которую мухи получали с пищей. Почему же ген Сyp9b1 имеет низкий базовый уровень транскрипции?

Поскольку гены Cyp9b1 и Cyp9b2 – результат дупликации предкового гена, мы проанализировали регуляторные 5'-регуляторные области (по 500 пн от начала кодирующей рамки) на предмет сходства нуклеотидных последовательностей и наличия общих регуляторных сайтов. Выравнивание последовательностей в программе Blastn (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/BlastAlign.cgi) не выявило протяженных участков гомологии сходства, что свидетельствует о значительной дивергенции последовательностей. Поиск коротких сходных последовательностей длиной 10–12 пн (допустимо наличие двух неспаренных нуклеотидов) в некодирующих 5'-регуляторных областях генов в программе Oligonucleotids repeats finder (http:// wwwmgs.bionet.nsc.ru/mgs/programs/oligorep/) выявил 20 гомологичных участков, из которых только пять имеют примерно одинаковые координаты в регуляторных областях. Предсказание сайтов связывания транскрипционных факторов в программе LASAGNA (https://biogrid-lasagna.engr.uconn.edu/lasagna_search/index.php) [14] с использованием алгоритма позиционно-весовых матриц и двух баз данных TRANSFAC (Insects, 38 моделей сайтов связывания) и JASPAR (Insects, 126 моделей сайтов связывания). Поиск в базе данных TRANSFAC выявил с вероятностью p < < 0.001 три предполагаемых сайта связывания транскрипционных факторов для гена Cyp9b1 и семь – для гена Cyp9b2. Поиск в базе данных JASPAR выявил с вероятностью p < 0.001 11 и 19 предполагаемых сайтов связывания транскрипционных факторов для генов Cyp9b1 и Cyp9b2 соответственно. Общим для двух генов и для двух баз данных оказался только один сайт связывания – сайт транскрипционного фактора CF-2II, контролирующего дифференцировку фолликулярных клеток и регулирующего экспрессию генов миогенеза. Таким образом, по крайней мере по данным биоинформатического анализа, регуляция работы генов Cyp9b1 и Cyp9b2 может различаться, а у гена Cyp9b2 может быть больше регуляторов транскрипционной активности. Однако предсказательная сила у биоинформатических методов поиска сайтов связывания транскрипционных факторов невысока и требует экспериментального подтверждения.

Опубликовано единственное исследование, в котором экспрессия на уровне транскрипции обоих генов, Сyp9b1 и Cyp9b2, согласовано повышалась до трех раз в ответ на воздействие ксенобиотиком – фенобарбиталом [15]. Индукция только гена Cyp9b2 под действием фенобарбитала обнаружена в работах [16, 17]. Примечательно, что фенобарбитал в низких концентрациях в ряде исследований используется как антиоксидант, повышающий устойчивость к определенным пестицидам при совместной обработке [18]. Чаще всего такой эффект обусловлен дополнительной индукцией систем антиоксидантой защиты, поскольку в ряде случаев цитохромы, участвуя в детоксикации ксенобиотиков, сами индуцируют окислительный стресс [19].

Различный характер экспрессии генов Cyp9b1 и Cyp9b2 был выявлен в нескольких работах, посвященных исследованию ответа цитохромов на различные стрессовые воздействия [20–25]. Показано, что Cyp9b1 снижает свою экспрессию при облучении молодых мух синим светом (наряду с девятью другими генами цитохромов – Cyp28d1, Cyp317a1, Cyp4c3, Cyp4e1, Cyp4e3, Cyp4s3, Cyp6a20, Cyp6a8, Cyp6a9), при этом индуцируются нейропротекторные гены [18]. Также ген Cyp9b1 снижает свою экспрессию в ответ на гипоксию у личинок третьего возраста (наряду с генами Cyp6a22 и Cyp6a17) [21]. Напротив, экспрессия Cyp9b2 повышается при голодании [22] и гипоксии [23]. У взрослых самцов экспрессия Cyp9b2 индуцируется на среде с туникамицином – индуктором стресса эндоплазматического ретикулума [24]. В работе [25] было обнаружено, что экспрессия гена Сyp9b2 индуцируется голоданием у дрозофилы. Таким образом, гены Cyp9b1 и Cyp9b2 могут активироваться как согласованно, так и дифференциально.

Примечательным является тот факт, что лабораторная линия SS7K, используемая в нашем эксперименте, оказалась полностью гомозиготной по мутации в гене Cyp9b1. Конечно это может быть результатом случайных событий. Но очевидно это свидетельствует о том, что ген не является важным и не поддерживается отбором в лабораторных условиях культивирования. Шел ли отбор в пользу закрепления в данной популяции мутантного аллеля гена Cyp9b1 – неизвестно. Однако те немногочисленные исследования, которые включали анализ транскрипции гена Cyp9b1, показывают, что его экспрессия снижается, то есть не является необходимой, при ряде стрессовых воздействий [20, 21]. А если и индуцируется некоторыми воздействиями, то в незначительной степени, в отличие от гена Cyp9b2, что делает роль этого гена второстепенной. По-видимому, ген Cyp9b1 не находится под действием стабилизирующего отбора, поскольку дублирует функцию Cyp9b2 и имеет слишком низкий уровень экспрессии.

Полученные нами данные о зависимости уровня устойчивости к борной кислоте в зависимости от дозы гена Cyp9b2 косвенно подтверждаются исследованиями на другом виде дрозофил – D. sechellia. Исследование генома D. sechellia, питающихся плодами растения Morinda сitrifolia, экстракт которого часто используют в качестве инсектицида с нейротоксическим действием, имеют три дополнительные копии гена Cyp9b2 (а также по одной дополнительной копии генов Cyp6d5, Cyp9f2, Cyp6a9, Cyp6a17, Cyp4p1, Cyp4d1, Cyp4d2) [26]. Очевидно ген Cyp9b2 является важным геном детоксикации, отвечающим на широкий спектр воздействий. Характер индукции гена Cyp9b2 свидетельствует о его участии в ответе на нейротоксический стресс, он активируется нейротоксичными ксенобиотиками (фенобарбитал, ротенон, кофеин, этанол) [27]. По-видимому борная кислота оказывает сходное воздействие, влияя и на пищеварительную, и на центральную нервную систему дрозофилы. Основной вопрос заключается в том, каким образом ген Cyp9b2 обеспечивает некоторый уровень устойчивости к борной кислоте. Известно, что борная кислота может физически взаимодействовать с одним из типов цитохромов, цитохромом с, в реакции in vitro [28]. Это не исключает возможности ее взаимодействия с другими типами цитохромов, что требует дальнейшего исследования.

Исследование выполнено в рамках Междисциплинарной научно-образовательной школы Московского университета “Молекулярные технологии живых систем и синтетическая биология”.

Все применимые международные, национальные и/или институциональные принципы ухода и использования животных были соблюдены.

Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов.