Генетика, 2022, T. 58, № 9, стр. 1042-1055

Сборы клещей

Сборы окаймленных трутовиков, Fomitopsis pinicola, проводили в 1989–2021 гг. в различных регионах России, а также на территории Украины, Дании и Франции. Анализировались только живые плодовые тела преимущественно средних размеров, возрастом 1–3 года, со светло-желтым или белым гименофором, без признаков повреждения. Грибы отделяли от деревьев, заворачивали в несколько слоев газетной бумаги (оставляя прослойку воздуха над гименофором) и полиэтиленовый пакет и доставляли в лабораторию. Иногда использовалась почтовая пересылка в течение 3–5 дней. Всего изучено 502 плодовых тела из 62 локалитетов. Географическое расположение мест сбора трутовиков представлено на рис. 1. Число грибов в сериях из одного локалитета варьировало от двух до 202 шт. Выгонку клещей проводили в лаборатории в эклекторах из плотной бумаги без специального освещения или подогрева до полного высыхания в течение 10–18 сут. Клещей фиксировали 96%-ным этанолом. Часть определенных по морфологическим признакам особей H. oblongus была использована в генетических исследованиях. При изготовлении препаратов применяли жидкость Хойера. Определяли процент инфицированных клещом плодовых тел 2–3-летнего возраста и количество особей H. pinicola всех стадий развития в каждом плодовом теле, которое пересчитывали на 1 дм² площади гименофора. В ряде районов, представляющих основные климатические зоны в пределах ареала H. oblongus, был проведен поиск клещей H. oblongus в лесной почве. Пробы почвы отбирали с площади 5 × 5 см², они включали подстилку и собственно почву до глубины 5 см. Выгонку клещей проводили в эклекторах.

Рис. 1.

Географическое расположение районов сборов H. oblongus. Красными кружками показаны районы сборов H. oblongus, охарактеризованных только по морфологическим признакам клещей; зелеными кружками отмечены районы сборов H. oblongus, проанализированных морфологически и методом ДНК-баркодирования.

Формирование выборки клещей H. oblongus для проведения ДНК-штрихкодирования

Для молекулярного анализа клещей собирали из одного плодового тела гриба. Из общего сбора микроартропод, собранных в эклектор, самок H. oblongus выбирали механически в количестве около 50 для одного выделения тотальной ДНК. Возможность применения такого метода сбора клещей связана с особенностями биологии H. oblongus. H. oblongus не образует стабильного заселения определенного места. Его колонии возникают, очевидно, от единственной самки-основательницы или от небольшой, вероятно родственной, группы клещей, перенесенных на гриб в результате форезии на летающем насекомом-переносчике. Колонии существуют обычно от одного года до четырех лет, пока гриб растет, и исчезают после отмирания гриба. Таким образом, при формировании каждой колонии клещей должен наблюдаться эффект основателя, что связано со снижением генетической изменчивости. В результате клещи из конкретного плодового тела гриба могут рассматриваться как одна митохондриальная линия, которую можно сравнивать с другими митохондриальными линиями из географически удаленных районов. Были обработаны выборки из 28 локалитетов. Места сборов клещей, охарактеризованных с помощью метода ДНК-щтрихкодирования, показаны на рис. 1. Описание мест сборов клещей и результат ДНК-штрихкодирования клещей по данным изменчивости нуклеотидной последовательности BOLD-фрагмента митохондриального гена COI представлены в табл. 1.

Выделение тотальной ДНК и проведение ПЦР

Тотальную ДНК из самок клещей выделяли фенол-хлороформным методом [23]. Полученную ДНК растворяли в деионизованной воде. Концентрация ДНК определялась спектрофотометрически с использованием Implen NanoPhotometer NP80. Концентрацию ДНК в препаратах выравнивали до 4 нг/мкл. ПЦР проводили в конечном объеме 25 мкл с использованием наборов для амплификации EncycloPlus PCR kit (Евроген, Россия) в соответствии с инструкцией фирмы-производителя.

Стандартные фолмеровские праймеры LCO1490 и HCO2198 [24] дают нестабильную амплификацию BOLD-фрагмента на матрице тотальной ДНК клещей. Более стабильные результаты дает пара праймеров HOP611F–HCO2198, амплифицирующих укороченный с 5'-конца BOLD-фрагмент длиной 611 пн. Прямой праймер: HOP611F (5'-TATGAGCAGGAATAATTGGAACCT-3'), обратный праймер: HCO2198 (5'-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3'). Праймеры были подобраны с помощью программы Primer3 [25]. Условия ПЦР: первичная денатурация – 3 мин при 94°С; затем 35 циклов: денатурация 94°С – 15 с, отжиг 60°С – 10 с, синтез 72°С – 40 с; и завершающий синтез при 72°С – 7 мин.

Для амплификации фрагмента рибосомного повтора гриба F. pinicola мы использовали модифицированный протокол из работы [26]. Праймеры: прямой ITS1 (5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3') и обратный ITS4 (5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3') амплифицируют фрагмент длиной 625 пн, включающий следующие последовательности: фрагмент ITS1, ген 5.8S рРНК, ITS2, фрагмент гена 28S рРНК. Вследствие неожиданно высокой гомологии некоторых фрагментов ядерных рибосомных повторов у гриба и клеща, которую мы обнаружили эмпирически, те же праймеры позволяют амплифицировать аналогичный фрагмент рибосомного повтора клещей H. oblongus длиной 589 пн. Мы использовали эти праймеры для получения ПЦР-фрагмента, включающего последовательности ITS1, гена 5.8S рРНК, ITS2 и фрагмента гена 28S рРНК у клещей H. oblongus. Условия ПЦР: первичная денатурация – 3 мин при 94°С; затем 35 циклов: денатурация 94°С – 15 с, отжиг 58°С – 10 с, синтез 72°С – 40 с; и завершающий синтез при 72°С – 7 мин.

Очистка и секвенирование ПЦР-фрагментов

Фрагменты, полученные в результате амплификации, фракционировали в 1.5%-ном агарозном геле. Элюция фрагментов из геля проводилась с использованием набора для элюции Cleanup Mimi (Евроген, Россия) в соответствии с инструкцией фирмы-производителя.

Нуклеотидную последовательность ПЦР-фрагментов определяли с прямого и обратного праймеров на приборе 3500 Genetic Analyzer с использованием набора реагентов BigDye®Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, США) согласно рекомендациям фирмы-производителя.

Биоинформационный анализ

Анализ хроматограмм проводили с помощью программы CromasPro 13.3 (Technelysium, Australia). Выравнивание последовательностей, полученных в результате секвенирования, с последовательностями, размещенными в базах данных GenBank, было выполнено с использованием ресурсов NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov). Для проведения кладистического анализа использовали программу MEGA7 [27]. Дендрограммы строили методом ближайших соседей (NJ). Статистическую достоверность полученной кластеризации таксонов оценивали при помощи величины бутстрэп-поддержки с числом репликаций 10 000. Количественные данные о величине нуклеотидной изменчивости выборки проводили в программе MEGA7 [27].

Медианная сеть митохондриальных гаплотипов была построена в программе PopART [28] с применением алгоритма TCS [29].

Поиск насекомых-переносчиков клещей

Для обнаружения видов насекомых-переносчиков H. oblongus были сконструированы ловчие камеры, состоящие из подноса, на котором располагались свежесобранные окаймленные трутовики, и ловчего экрана, расположенного над грибами на высоте нескольких сантиметров. Экран смазывался энтомологическим клеем “Полификс”, размягченным в бензиновом растворителе “Галоша”. Толщина слоя клея составляла около 0.1 мм. Экран располагали над свежими плодовыми телами трутовиков таким образом, чтобы он не касался грибов и подноса. Ловчие камеры размещали на открытом воздухе в защищенном от дождя месте, неподалеку от паркового леса в Москве, заселенного окаймленным трутовиком и H. oblongus. Можно было ожидать наличия в нем и насекомых-переносчиков H. oblongus. Насекомые-переносчики имели возможности залетать в камеры с плодовыми телами трутовиков и свободно покидать их, но часть насекомых прилипала к липкой поверхности ловчего экрана. Плодовые тела сменялись каждые 6–8 дней. В период с 16 мая по 30 сентября 2021 г. осмотр экранов проводили ежедневно под бинокулярным микроскопом. В описанных условиях мелкие насекомые надежно прилипали к экрану, смазанному энтомологическим клеем. Поскольку камеры были приоткрыты, насекомые могли как вылетать из грибов, так и залетать снаружи из соседнего парка. Клещи H. oblongus учитывались, если они были обнаружены на насекомых или непосредственно рядом с прилипшими насекомыми. Так как после прилипания насекомого форезирующие клещи способны недолго перемещаться в слое клея, часто наблюдалась следовая дорожка от клеща к насекомому, что позволяло установить факт форезии. Прилипших к экрану насекомых и клещей снимали с помощью иглы, помещали в отдельные пробирки и выдерживали в течение 5–7 дней в бензиновом растворителе, а потом 0.5–3 мес. – в этиловом спирте (96%). Из клещей и насекомых изготавливали постоянные препараты с жидкостью Хойера по стандартной методике, размещая их на одном стекле для фотографирования. Насекомых определяли до уровня семейства.

Ареал Hoploseius oblongus

На рис. 1 приведены все известные к настоящему времени места находок H. oblongus. В 62 из 74 локалитетов H. oblongus был обнаружен впервые. Данные о встречаемости H. oblongus в различных частях ареала приведены в табл. 2. Встречаемость H. oblongus в трутовиках F. pinicola на территории Западной Палеарктики оказалась повсеместно высокой. В различных подзонах равнинной тайги и в смешанных лесах Европы, как и в горных лесах Кавказа и Алтая, клещи были найдены в 90–100% плодовых тел F. pinicola. H. oblongus является узкоспециализированным видом, обитающим только в плодовых телах F. pinicola. Этот вывод следует из анализа многолетних сборов клещей в лесной подстилке тех же биотопов, где собирались плодовые тела трутовиков. В пробах почвы было найдено только 3 экз. H. oblongus (табл. 2).

Численность H. oblongus на единицу площади гименофора гриба варьирует от одного до 2300 экз./дм² и обычно составляет 50–400 экз./дм². На 1 см² гименофора F. pinicola размещаются от 550 до 600 трубочек. Следовательно, при максимальной установленной нами плотности клещей на одного клеща “приходится” 26 трубочек гименофора.

Кроме Hoploseius oblongus в плодовых телах F. pinicola были обнаружены другие виды гамазовых клещей. Наиболее часто, вместе с H. oblongus, встречаются: Ameroseius fungicolis Masan, 1998, Aceosejus muricatus Koch, 1839, Lasioseius ometes Oudemans, 1903, Zerconopsis remiger Kramer, 1876, Oodinychus ovalis C.L. Koch, 1839, Sejus togatus C.L. Koch, 1836 и клещи из рода Mycolaelaps.

ДНК-баркодирование выборки H. oblongus

Результат ДНК-баркодирования выборки H. oblongus представлен в табл. 1. Всего мы проанализировали 28 образцов ДНК клещей и выявили 16 COI гаплотипов, различающихся точковыми однонуклеотидными замещениями. На рис. 2 представлен результат кластеризации полученных нами COI митохондриальных гаплотипов с наиболее сходными последовательностями, зарегистрированными в GenBank для других представителей Phytoseioidea (семейства Blattisociidae и Phytoseiidae). Семейство Blattisociidae, к которому принадлежит H. oblongus, представлено в GenBank тремя видами рода Lasioseius и 34 неидентифицированными точнее последовательностями, полученными в ходе сканирующего исследования фауны микроартропод национального парка “Ontario” в Канаде [30]. Все эти гаплотипы представлены на рис. 2. Обширное семейство Phytoseiidae также представлено на рис. 2 наиболее сходными с H. oblongus видами. Следует отметить, что изменчивость нуклеотидных последовательностей митохондриального гена COI в пределах этого семейства чрезвычайно велика и заслуживает специального обсуждения. Сравнение нуклеотидных последовательностей гена COI H. oblongus и Phytoseiulus persimilis (GenBank ID: MW074335), Phytoseiidae, показывает величину дивергенции 74.7%, что больше, чем величина дивергенции нуклеотидных последовательностей гена COI при сравнении H. oblongus и клещей Dermanyssus gallinae и Androlaelaps casalis, относящихся к неродственному надсемейству Dermanyssoidea.

Рис. 2.

NJ-дендрограмма BOLD-фрагментов COI гаплотипов H. oblongus и наиболее сходных по этому признаку представителей семейств Blattisociidae и Phytoseiidae. Последовательности H. oblongus обозначены именами гаплотипов, представленных в табл. 1. Нуклеотидные последовательности представителей семейств Blattisociidae (отмечены треугольником) и Phytoseiidae (отмечены кружком) приведены с номерами GenBank. В качестве внешней группы взяты нуклеотидные последовательности COI Dermanyssus gallinae и Androlaelaps casalis, относящихся к надсемейству Dermanyssoidea. Величины бутстреп-поддержки указаны рядом с узлами дендрограммы.

Нуклеотидная изменчивость между гаплотипами H. oblongus не превышает 1%. Средняя частота нуклеотидных замен при анализе всей выборки последовательностей H. oblongus равна 0.0046 замещений на сайт. Большинство нуклеотидных замещений молчащие. При сравнении продуктов концептуальной трансляции зарегистрированных гаплотипов H. oblongus длиной 203 аминокислоты обнаружено пять аминокислотных замещений у трех гаплотипов. Гаплотип Arkhangelsk_12 характеризуется заменой лейцина на фенилаланин в позиции 151 и лейцина на валин в позиции 177; гаплотип Tomsk_31 характеризуется заменой аланина на валин в позиции 155; и гаплотип Smolensk_22a характеризуется заменой аспарагина на серин в позиции 17 и аланина на треонин в позиции 173. Нормализованное отношение транзиций к трансверсиям (R) равно 5.31. Сравнительно высокая величина этого отношения указывает на наличие сильного стабилизирующего отбора на поддержание структуры гена COI.

Рассмотрение дендрограммы на рис. 2 выявляет некоторые необычные особенности кластеризации последовательностей COI семейств Blattisociidae и Phytoseiidae. Разделение семейств не поддержано. Представители обоих семейств образуют одну гетерогенную кладу с хорошей бутстреп-поддержкой. Генетические дистанции между кладами H. oblongus и Lasioseius neometes (обе из Blattisociidae) равно 23%. Такая же дистанция равная 23% разделяет клады H. oblongus и Amblyseius eharai из Phytoseiidae. Столь большая величина дистанции между двумя родами одного семейства (Hoploseius и Lasioseius) необычна. Вероятно, систематический ранг рода Hoploseius после изучения других представителей рода придется повысить до уровня трибы или выше.

Для характеристики изменчивости нуклеотидных последовательностей ядерного генома H. oblongus мы выбрали фрагмент ядерного рибосомного повтора, включающий фрагмент ITS1, ген 5.8S рРНК, ITS2, фрагмент гена 28S рРНК. Мы проанализировали те же образцы H. oblongus, которые ранее были взяты для определения митохондриального гаплотипа. Все образцы H. oblongus оказались мономорфны по этой последовательности, что подтверждает близкое родство всех популяций H. oblongus в Западной Евразии. Так как межвидовые сравнения последовательностей ITS у клещей показывало многочисленные случаи инсерций и делеций, затрудняющих сравнение, мы ограничились сравнением нуклеотидных последовательностей гена 5.8S рРНК, широко используемого в молекулярной систематике. Последовательности 5.8S рРНК известны у 71 вида клещей семейства Phytoseiidae, представляющих 15 родов. Виды каждого из родов семейства Phytoseiidae представлены на рис. 3. Представители семейства Blattisociidae ранее не были охарактеризованы по нуклеотидным последовательностям гена 5.8S рРНК. Полученные данные по изменчивости ядерного гена 5.8S рРНК согласуются с данными по изменчивости митохондриаьного гена COI, и также подтверждают своеобразие H. oblongus, соответствующее уровню подсемейства или семейства. Точнее определить таксономический статус H. oblongus в отряде Mesostigmata по молекулярным данным в настоящее время не представляется возможным.

Рис. 3.

NJ-дендрограмма 5.8S рРНК генов H. oblongus и наиболее сходных по этому признаку представителей семейства Phytoseiidae. Нуклеотидная последовательность 5.8S рРНК гена H. oblongus, полученная в настоящей работе, зарегистрирована в GenBank с номером (MZ686432). На дендрограмме она отмечена квадратом. Последовательности клещей, относящихся к семейству Phytoseiidae, приведены с номерами GenBank. В качестве внешней группы взяты последовательности генов 5.8S рРНК клещей Dermanyssus gallinae и Androlaelaps casalis, относящихся к надсемейству Dermanyssoidea. Величины бутстреп-поддержки указаны рядом с узлами дендрограммы.

Структура генетической изменчивости H. oblongus

Для изучения генетической изменчивости H. oblongus по ареалу и получения информации об истории расселения вида мы построили медианную сеть митохондриальных гаплотипов. Дендрограммы не подходят для такого анализа, так как исходные допущения модели предполагают, что предковый гаплотип уже вымер, тогда как в случае недавних генетических процессов предковый гаплотип существует и часто является самым массовым. Полученный результат приведен на рис. 4. Популяция с H. oblongus слабо структурирована географически. Предковыми гаплотипами можно считать гаплотипы клещей Алтая, так как они меньше дивергировали от наиболее сходного с H. oblongus вида Amblyseius eharai. Максимальная дивергенция от предковой группы гаплотипов Алтая наблюдается у гаплотипов Smolensk_22a, Curanian_Spit, найденных на крайней западной границе изученной области ареала. Эти наблюдения позволяют предположить направление расширения ареала клещей с юго-востока на северо-запад.

Рис. 4.

Медианная сеть COI митохондриальных гаплотипов H. oblongus. Медианная сеть построена на основе 28 BOLD-фрагментов COI клещей H. oblongus длиной 611 пн. В качестве внешней группы выбран наиболее сходный с H. oblongus по нуклеотидной последовательности BOLD-фрагмента COI Amblyseius eharai (GenBank ID: JX080345). Гаплотипы соединены ломаными линиями. Нуклеотидные замены обозначены поперечными отрезками. Минимальное число нуклеотидных замещений, необходимое для преобразования одного гаплотипа в другой, обозначено числом отрезков на соединяющих гаплотипы линиях. Размер кругов пропорционален числу синонимичных последовательностей для данного гаплотипа. GenBank ID гаплотипов H. oblongus приведен в табл. 1. Рисунок взрослой самки клеща H. oblongus – внизу справа.

Насекомые-переносчики Hoploseius oblongus

Для идентификации насекомых-переносчиков H. oblongus, обеспечивающих его расселение между плодовыми телами F. pinicola, были сконструированы ловчие камеры, позволяющие отлавливать летающих насекомых, которые посещают плодовые тела трутовиков (см. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ). Всего в период с 16 мая по 30 сентября 2021 г. в ловчих камерах было отловлено 919 особей насекомых, в основном из отрядов Diptera и Coleoptera. Прочие насекомые представлены единичными находками. Распределение пойманных насекомых и клещей по месяцам года представлено на рис. 5. С мая по июнь среди летающих насекомых, посещающих плодовые тела трутовика, преобладали жуки (преимущественно Staphylinidae), но они практически не переносили клещей (табл. 3). С июня и до сентября в сборах преобладали двукрылые. Всего было обнаружено 39 имаго насекомых, переносящих клещей (в том числе 38 – с клещами H. oblongus): 35 – представители Diptera (90%), 3– Hymenoptera (8%), 1 – Coleoptera (3%).

Рис. 5.

Динамика числа насекомых и клещей H. oblongus, отловленных на стенках ловчих камер с грибами Fomitopsis pinicola в сезон 2021 г. (Москва, р-н Сокол). Число имаго пойманных насекомых – потенциальных переносчиков H. oblongus обозначено столбиками диаграммы (левая вертикальная ось). Число пойманных клещей H. oblongus, форезирующих на насекомых, обозначено кружками, соединенными ломаной линией (правая вертикальная ось).

Форезия H. oblongus наблюдалась с начала августа по конец сентября с четко выраженным пиком в первой половине сентября (рис. 5). Состав насекомых-переносчиков H. oblongus, определенных до семейства, представлен в табл. 3. Из полученных данных можно сделать вывод, что наиболее эффективно форезия H. oblongus осуществляется самками комариков из семейства детритниц (Sciaridae). Помимо переноса ими H. oblongus установлена форезия двух дейтонимф гамазового клеща Dendrolaelaps sp. (Digamasellidae) на самке Sciaridae (от 02.07.2021) и 18 самок клещей из семейства Scutacaridae, Trombidiformes, на другой самке Sciaridae (от 27.08.2021).

Среди 55 экз. H. oblongus, полученных с насекомых в ловчих камерах, 9 особей (16%) были самцами, остальные – самками. У каждой третьей самки в сперматеках были видны сперматодозы.