1. На главную
  2. Электронные версии
  3. Генетика
  4. T. 59, № 11, 2023

Генетика, 2023, T. 59, № 11, стр. 1303-1312

Определение полиморфизма G/C в позиции хр20:37352001 в препаратах ДНК из крови человека методами GlaI- и Bst2UI-ПЦР анализа

А. Г. Акишев 1, Н. А. Нетесова 2, М. А. Абдурашитов 1, С. Х. Дегтярев 1, 3, *

1 Научно-производственное объединение “СибЭнзим”
630117 Новосибирск, Россия

2 ООО “Эпигенлаб”
630559 Новосибирск, Россия

3 Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова Российской академии наук
119991 Москва, Россия

* E-mail: degt@sibenzyme.com

Поступила в редакцию 17.05.2023
После доработки 09.06.2023
Принята к публикации 20.06.2023

Полный текст (PDF)

Аннотация

Однонуклеотидный полиморфизм (SNP) заключается в замене одного нуклеотида на другой, что часто приводит к возникновению (или исчезновению) сайта узнавания определенной рестриктазы. В результате при амплификации фрагмента ДНК с праймеров, окружающих точку SNP (содержащую либо N1, либо N2-нуклеотид), и последующего гидролиза ампликона данной рестриктазой картины расщепления ДНК будут разные для трех возможных вариантов в диплоидной ДНК (генотипы N1/N1, N1/N2 и N2/N2). Данный метод определения полиморфизма длин фрагментов рестрикции (RFLP) широко используется в практике генетических исследований. Ранее мы разработали методы GlaI- и FatI-ПЦР анализа, в которых проводится ПЦР в реальном времени вместо электрофореза, и показали его применимость для определения SNP T/C. В настоящей работе предложен новый способ определения однонуклеотидного полиморфизма G/C методом Bst2UI-ПЦР анализа. GlaI- и Bst2UI-ПЦР анализ использовали для определения частоты вариантов полиморфизма G/C в положении хр20:37352001 (по геномной сборке GRCh38.p14) в препаратах ДНК, выделенной из клеток крови 161 человека. Исследование включало: 1) выделение лейкоцитарной ДНК из клеток крови; 2) проведение GlaI- и Bst2UI-ПЦР анализа фрагмента ДНК хр20:37351957–37352083; 3) определение цитозина и гуанина в позиции хр20:37352001 в анализируемых препаратах ДНК; 4) сравнительный анализ полученных результатов. Показано, что 68 доноров (42.2%) имеют гетерозиготный набор G/C в положении хр20:37352001, 89 доноров (55.3%) гомозиготны по G, а четыре донора (2.5%) – по C. Таким образом, принимая во внимание, что клетки крови имеют диплоидный набор хромосом, замена G на C встречается в 76 из 322 проанализированных вариантов (23.6%). При этом из полученных результатов следует, что цитозин, комплементарный G в положении хр20:37352001, в большей части молекул ДНК находится в метилированной форме (5-метилцитозин) как у гомо-, так и у гетерозигот. Предложенный метод Bst2UI-ПЦР анализа расширяет возможности определения SNP с помощью ПЦР в реальном времени.

Ключевые слова: однонуклеотидный полиморфизм G/C, частоты аллелей, ДНК из крови человека, GlaI-ПЦР анализ, Bst2UI-ПЦР анализ.

Ранее с помощью GlaI- и FatI-ПЦР анализа нами было проведено изучение частот аллелей для полиморфизмов C/T в положении хр16:75033884 [1] и хр1:245618129 [2] в препаратах ДНК 92 доноров. В данных позициях находится последовательность CACGC, которая превращается в последовательность CATGC с возникновением сайта узнавания рестриктазы FatI (CATG). В настоящей работе мы применили методы GlaI- и Bst2UI-ПЦР анализа для изучения однонуклеотидного полиморфизма G/C в третьем положении последовательности AC(G/C)TGG (rs11697215 по базе данных “dbSNP” [3]) в положении хр20:37352001 в препаратах ДНК 161 донора. Данный SNP расположен в интроне протоонкогена SRC, кодирующего тирозин-специфичную протеинкиназу и его анализ не может проводиться методом FatI-ПЦР анализа ввиду отсутствия последовательности CATG. На рис. 1 представлена нуклеотидная структура участка геномной ДНК, включающая в себя анализируемый полиморфизм. Суть методов GlaI- и Bst2UI-ПЦР анализа заключается в альтернативном расщеплении ДНК ферментами GlaI или Bst2UI соответственно, и последующей ПЦР с праймеров, лежащих до и после искомой последовательности. При расщеплении ДНК ферментами происходит следующее: рестриктаза Bst2UI (сайт узнавания СC(A/T)GG) расщепляет ДНК по последовательности ACCTGG и не расщепляет другие сайты, а ДНК-эндонуклеаза GlaI (сайт узнавания R(5mC)GY) [4] расщепляет только сайт A(5mC)GTGG. При гидролизе ДНК ферментом Bst2UI и последующей ПЦР происходит амплификация фрагмента при наличии последовательности A(5mC)GTGG или ACGTGG и не наблюдается продукта ПЦР в случае сайта ACCTGG. При гидролизе ДНК ферментом GlaI последующая амплификация фрагмента идет при наличии последовательностей ACCTGG и ACGTGG и не наблюдается продукта ПЦР в случае сайта A(5mC)GTGG. Для проведения контрольной ПЦР [5] в этом случае был подобран фермент рестрикции BstDEI, сайты узнавания которого (CTNAG) расположены вне участка амплификации (рис. 1).

Рис. 1.

Нуклеотидная последовательность анализируемого участка геномной ДНК хр20:37351837–37352162. Волнистой линией выделены сайты узнавания рестриктазы BstDEI (CTNAG), окаймляющие амплифицируемый участок. Зоны связывания прямого и обратного праймеров, а также флуоресцентно меченного TaqMan-зонда выделены серым фоном. Изучаемый сайт ACGTGG, содержащий метилируемый сайт ACGT [5], обведен рамкой. Подчеркнут гуаниновый остаток в сайте ACGTGG, который может замещаться цитозином.

При анализе диплоидной ДНК в случае гомозиготы по G фермент Bst2UI не расщепляет искомый фрагмент, и контрольная ПЦР после расщепления BstDEI и Bst2UI-ПЦР дают практически одинаковые результаты. В случае гомозиготы по C Bst2UI расщепляет ДНК близко к 100% и разница в результатах Bst2UI-ПЦР анализа и контрольной ПЦР составляет более восьми циклов (гидролиз сайта CCTGG более 99.5%). При этом в случае гетерозиготы расщепление ДНК ферментом Bst2UI происходит на 50% и разница результатов Bst2UI-ПЦР анализа с результатами контрольной ПЦР должна быть близка к одному циклу. Аналогичный результат будет наблюдаться и в случае GlaI-ПЦР-анализа, если значительная часть цитозинов в положении, комплементарном гуанину в третьем положении последовательности ACGCTGG, метилирована. Тогда в случае гомозиготы по С GlaI не будет расщеплять ДНК, в случае гетерозиготы будет наблюдаться около 50% гидролиза и в случае гомозиготы по G глубина гидролиза будет зависеть от полноты метилирования цитозина. Результаты обоих методов должны соответствовать друг другу: в случае гетерозиготы оба метода должны давать разницу с контрольным ПЦР в один цикл, а в случае гомозигот один метод должен давать разницу с контролем около 0, при этом второй метод должен давать разницу в значительное число циклов.

Таким образом, мы определяем частоты вариантов полиморфизма G/C в положении хр20:37352001 (по геномной сборке GRCh38.p14) в препаратах ДНК, выделенной из клеток крови 161 человека, и контрольных образцах ДНК, используя два метода. Поскольку методы GlaI- и Bst2UI-ПЦР анализа определяют наличие разных нуклеотидов и являются независимыми, их совместное применение подтверждает достоверность результатов, полученных каждым из них.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Для проведения Bst2UI- и GlaI-ПЦР анализа использовались образцы ДНК 161 условно здорового донора, выделенной из лейкоцитов периферической крови. Методика выделения и использованные реактивы описаны ранее в работе [1]. В качестве контроля метилирования мы использовали TaqI-гидролизат ДНК HeLa, метилированный SssI метилазой (НПО “СибЭнзим”). Возраст и пол участников исследования, а также концентрация полученных препаратов ДНК и данные их спектрофотометрической чистоты приведены в табл. 1.

Таблица 1.

Значения Cq в случае гидролиза ДНК по сайтам CTNAG (BstDEI), CCWGG (Bst2UI-ПЦР анализ) и A(5mC)GT (GlaI-ПЦР анализ) и значения разницы величины Cq для двух последних реакций относительно первой (ΔCq_C = Cq_CCWGG – Cq_CTNAG и ΔCq_G = Cq_A(5mC)GT – Cq_CTNAG) соответственно

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Донор Пол Возраст, лет Концентрация ДНК, нг/мкл А260/280 Cq_
BstDEI 		Cq_Bst2UI-ПЦР анализ Cq_GlaI-ПЦР анализ ΔCq_C ΔCq_G
1172 ж 14 376 1.6 20.66 ± 0.05 20.76 ± 0.13 25.57 ± 0.09 0.10 4.91
1164 ж 17 252 1.7 20.19 ± 0.09 20.21 ± 0.04 24.05 ± 0.21 0.02 3.86
1147 м 18 180 2.0 21.31 ± 0.09 22.50 ± 0.04 22.25 ± 0.12 1.19 0.94
1133 м 18 55 1.7 20.10 ± 0.03 20.11 ± 0.07 23.83 ± 0.32 0.01 3.73
1181 ж 18 90 1.8 20.16 ± 0.03 29.68 ± 0.65 20.32 ± 0.04 9.52 0.16
1303 м 18 129 1.8 20.05 ± 0.00 20.04 ± 0.06 24.07 ± 0.09 –0.01 4.02
1187 м 20 304 1.8 21.29 ± 0.02 22.12 ± 0.04 22.11 ± 0.11 0.83 0.82
1502 ж 20 461 1.7 20.49 ± 0.07 20.38 ± 0.09 25.08 ± 0.03 –0.11 4.59
1487 ж 22 406 1.7 20.62 ± 0.06 21.78 ± 0.06 21.70 ± 0.04 1.16 1.08
1304 ж 23 129 1.7 21.08 ± 0.14 29.98 ± 0.38 21.11 ± 0.10 8.90 0.03
1218 м 24 317 1.7 21.88 ± 0.09 21.85 ± 0.13 26.13 ± 0.03 –0.03 4.25
1379 ж 24 241 1.8 20.00 ± 0.10 20.00 ± 0.03 23.36 ± 0.09 0.00 3.36
1243 м 24 280 1.7 21.50 ± 0.04 22.45 ± 0.07 22.62 ± 0.04 0.95 1.12
1332 м 25 507 1.9 21.06 ± 0.05 22.01 ± 0.12 21.98 ± 0.02 0.95 0.92
1263 м 26 252 1.9 20.56 ± 0.07 21.61 ± 0.15 21.41 ± 0.09 1.05 0.85
1173 ж 27 232 1.7 20.37 ± 0.06 21.51 ± 0.12 21.55 ± 0.12 1.14 1.18
1200 м 27 271 1.6 20.67 ± 0.06 21.50 ± 0.06 21.54 ± 0.03 0.83 0.87
1203 м 27 309 1.6 20.95 ± 0.13 22.02 ± 0.09 22.11 ± 0.07 1.07 1.16
1209 м 27 204 1.7 20.27 ± 0.06 21.15 ± 0.05 21.24 ± 0.03 0.88 0.97
1214 ж 27 265 1.6 20.49 ± 0.09 21.49 ± 0.09 21.40 ± 0.04 1.00 0.91
1329 м 27 488 1.8 20.25 ± 0.09 20.27 ± 0.12 24.10 ± 0.09 0.02 3.85
1224 м 28 213 1.9 21.22 ± 0.06 22.11 ± 0.05 22.06 ± 0.08 0.89 0.84
1225 м 28 114 1.9 21.69 ± 0.06 21.73 ± 0.07 24.38 ± 0.14 0.04 2.69
1226 ж 30 297 1.9 21.19 ± 0.04 21.30 ± 0.09 24.41 ± 0.03 0.11 3.22
1240 ж 30 252 1.8 21.38 ± 0.02 21.26 ± 0.04 24.98 ± 0.14 –0.12 3.60
1221 ж 31 263 1.7 20.22 ± 0.02 21.37 ± 0.04 21.33 ± 0.09 1.15 1.11
1134 м 32 53 1.7 19.66 ± 0.04 19.79 ± 0.07 24.21 ± 0.09 0.13 4.55
18л ж 33 140 1.8 21.10 ± 0.01 21.06 ± 0.02 25.71 ± 0.06 –0.04 4.61
1161 м 33 197 1.7 20.34 ± 0.08 20.52 ± 0.03 24.50 ± 0.12 0.18 4.16
1192 ж 33 110 1.7 20.16 ± 0.12 20.23 ± 0.10 23.68 ± 0.14 0.07 3.52
1184 ж 34 305 1.7 21.50 ± 0.10 21.55 ± 0.08 25.00 ± 0.14 0.05 3.50
1300 м 34 127 1.9 20.79 ± 0.08 20.93 ± 0.07 24.52 ± 0.13 0.14 3.73
17л ж 35 72 1.8 20.07 ± 0.03 21.18 ± 0.06 21.09 ± 0.04 1.11 1.02
1208 м 35 207 1.6 21.27 ± 0.06 21.27 ± 0.14 25.76 ± 0.19 0.00 4.49
1227 м 35 101 1.8 21.26 ± 0.04 22.42 ± 0.04 22.17 ± 0.09 1.16 0.91
272 ж 36 49 1.9 22.43 ± 0.12 23.48 ± 0.09 23.26 ± 0.09 1.05 0.83
285 м 36 20 2.0 22.41 ± 0.03 23.54 ± 0.05 23.42 ± 0.11 1.13 1.01
1086 м 36 193 1.7 21.37 ± 0.14 22.36 ± 0.15 22.26 ± 0.07 0.99 0.89
1162 м 36 181 1.8 21.12 ± 0.06 22.17 ± 0.05 22.20 ± 0.11 1.05 1.08
1217 м 36 407 1.6 21.20 ± 0.09 22.11 ± 0.09 22.00 ± 0.09 0.91 0.80
1247 ж 36 286 1.7 21.10 ± 0.06 21.04 ± 0.13 25.19 ± 0.08 –0.06 4.09
273 ж 37 25 1.9 22.27 ± 0.09 22.22 ± 0.05 25.97 ± 0.15 –0.05 3.70
1186 ж 37 175 1.8 20.60 ± 0.00 20.57 ± 0.04 24.21 ± 0.07 –0.03 3.61
1235 ж 37 168 1.7 21.10 ± 0.14 22.11 ± 0.05 21.93 ± 0.05 1.01 0.83
1345 м 37 420 1.8 20.50 ± 0.10 21.32 ± 0.03 21.35 ± 0.09 0.82 0.85
1094 ж 38 172 1.7 20.89 ± 0.06 22.08 ± 0.06 22.04 ± 0.09 1.19 1.15
1236 м 39 196 1.8 20.02 ± 0.08 21.15 ± 0.01 20.98 ± 0.11 1.13 0.96
1376 ж 40 225 1.9 20.26 ± 0.07 20.22 ± 0.04 24.64 ± 0.06 –0.04 4.38
243 ж 41 67 1.9 21.88 ± 0.13 22.80 ± 0.08 22.82 ± 0.09 0.92 0.94
1219 ж 41 315 1.8 21.18 ± 0.09 21.25 ± 0.03 25.99 ± 0.07 0.07 4.81
1335 ж 41 782 1.9 20.34 ± 0.10 20.39 ± 0.11 24.88 ± 0.15 0.05 4.54
1381 ж 41 500 1.7 20.83 ± 0.04 20.71 ± 0.05 24.64 ± 0.09 –0.12 3.81
657 м 42 145 1.8 20.42 ± 0.04 21.21 ± 0.05 21.18 ± 0.11 0.79 0.76
1207 м 42 220 1.6 20.81 ± 0.04 20.67 ± 0.09 24.61 ± 0.14 –0.14 3.80
1331 ж 42 230 1.8 20.86 ± 0.14 20.66 ± 0.03 23.77 ± 0.08 –0.20 2.91
1323 м 42 300 1.8 20.60 ± 0.04 20.54 ± 0.11 24.23 ± 0.23 –0.06 3.63
1411 м 42 569 1.8 20.74 ± 0.07 20.73 ± 0.02 24.49 ± 0.18 –0.01 3.75
23л м 44 25 1.7 21.25 ± 0.11 22.28 ± 0.09 22.18 ± 0.12 1.03 0.93
1374 ж 44 101 1.8 20.99 ± 0.11 21.06 ± 0.04 25.22 ± 0.08 0.07 4.23
661 ж 45 67 1.8 19.54 ± 0.05 20.74 ± 0.14 20.56 ± 0.05 1.20 1.02
1145 ж 45 323 1.6 20.66 ± 0.04 20.61 ± 0.05 25.30 ± 0.12 –0.05 4.64
1171 ж 45 67 1.6 21.23 ± 0.09 21.10 ± 0.04 24.53 ± 0.09 –0.13 3.30
1371 ж 46 233 1.8 20.27 ± 0.07 20.15 ± 0.10 23.78 ± 0.09 –0.12 3.51
1491 ж 46 498 1.7 20.39 ± 0.02 20.29 ± 0.11 23.99 ± 0.33 –0.10 3.60
123л м 48 34 1.8 22.31 ± 0.10 22.46 ± 0.10 25.61 ± 0.12 0.15 3.30
1155 м 48 110 1.6 19.86 ± 0.12 19.92 ± 0.03 23.66 ± 0.13 0.06 3.80
1175 ж 49 202 1.9 20.35 ± 0.03 21.47 ± 0.05 21.40 ± 0.15 1.12 1.05
1313 м 49 157 1.8 19.52 ± 0.07 19.53 ± 0.06 22.77 ± 0.06 0.01 3.25
1317 ж 49 316 1.9 20.59 ± 0.08 21.51 ± 0.05 21.40 ± 0.04 0.92 0.81
1338 м 49 696 1.8 20.28 ± 0.04 21.21 ± 0.05 21.15 ± 0.05 0.93 0.87
1339 ж 49 506 1.9 20.20 ± 0.09 21.18 ± 0.11 21.14 ± 0.01 0.98 0.94
1099 м 50 144 1.7 21.91 ± 0.09 21.73 ± 0.10 25.69 ± 0.10 –0.18 3.78
1111 ж 50 141 1.7 20.63 ± 0.04 21.54 ± 0.07 21.64 ± 0.12 0.91 1.01
1151 ж 50 225 1.7 19.95 ± 0.09 21.06 ± 0.13 21.07 ± 0.04 1.11 1.12
1248 ж 50 154 1.7 19.97 ± 0.07 20.95 ± 0.10 20.88 ± 0.01 0.98 0.91
1321 м 50 112 1.8 21.22 ± 0.07 31.97 ± 0.42 21.12 ± 0.06 10.75 –0.10
1093 м 51 201 1.7 19.98 ± 0.08 21.12 ± 0.07 21.03 ± 0.10 1.14 1.05
1129 ж 51 72 1.7 19.14 ± 0.05 19.04 ± 0.02 22.95 ± 0.11 –0.10 3.81
1165 м 51 356 1.6 20.39 ± 0.01 21.62 ± 0.05 21.46 ± 0.06 1.23 1.07
1337 ж 51 563 1.9 19.48 ± 0.14 19.48 ± 0.08 24.21 ± 0.18 0.00 4.73
1367 ж 51 188 1.9 20.29 ± 0.10 21.29 ± 0.03 21.09 ± 0.04 1.00 0.80
1230 ж 52 723 1.9 22.19 ± 0.14 22.30 ± 0.05 25.61 ± 0.18 0.11 3.42
1350 м 52 231 1.8 20.70 ± 0.10 21.96 ± 0.02 21.73 ± 0.04 1.26 1.03
6л ж 53 288 1.8 21.09 ± 0.10 21.20 ± 0.08 26.13 ± 0.04 0.11 5.04
202 м 53 248 1.8 20.14 ± 0.02 20.10 ± 0.06 24.09 ± 0.21 –0.04 3.95
1159 м 53 358 1.7 20.50 ± 0.03 21.50 ± 0.08 21.40 ± 0.07 1.00 0.90
1239 ж 53 230 1.7 20.43 ± 0.14 20.41 ± 0.02 24.50 ± 0.16 –0.02 4.07
1358 м 53 784 1.8 21.73 ± 0.11 22.63 ± 0.12 22.54 ± 0.06 0.90 0.81
1361 ж 53 762 1.9 20.03 ± 0.10 20.24 ± 0.07 24.41 ± 0.08 0.21 4.38
53л ж 54 88 1.9 21.17 ± 0.07 21.15 ± 0.08 26.02 ± 0.21 –0.02 4.85
1113 ж 55 109 1.9 20.49 ± 0.08 20.54 ± 0.02 24.78 ± 0.06 0.05 4.29
1246 ж 55 191 1.7 20.86 ± 0.06 21.01 ± 0.09 24.00 ± 0.14 0.15 3.14
1342 м 55 119 1.9 20.74 ± 0.08 21.82 ± 0.13 21.81 ± 0.10 1.08 1.07
54л м 56 113 1.9 20.70 ± 0.01 20.79 ± 0.09 24.47 ± 0.03 0.09 3.77
1280 м 56 436 1.8 21.59 ± 0.03 21.43 ± 0.05 25.29 ± 0.05 –0.16 3.70
1127 ж 57 123 1.7 20.38 ± 0.13 20.21 ± 0.02 24.38 ± 0.09 –0.17 4.00
1135 ж 57 127 1.6 19.22 ± 0.02 20.15 ± 0.06 20.10 ± 0.06 0.93 0.88
1163 ж 57 157 1.7 20.48 ± 0.14 20.51 ± 0.12 24.42 ± 0.12 0.03 3.94
1183 ж 57 662 1.7 20.51 ± 0.10 20.56 ± 0.07 24.60 ± 0.05 0.05 4.09
1360 ж 57 570 1.9 20.34 ± 0.05 20.48 ± 0.14 24.48 ± 0.24 0.14 4.14
19л ж 58 54 1.8 21.44 ± 0.13 21.35 ± 0.05 25.32 ± 0.10 –0.09 3.88
1130 ж 58 59 1.7 20.28 ± 0.10 20.24 ± 0.04 23.78 ± 0.08 –0.04 3.50
1351 ж 58 260 1.8 20.10 ± 0.02 21.09 ± 0.15 21.10 ± 0.06 0.99 1.00
297 ж 59 48 1.9 23.10 ± 0.12 24.24 ± 0.04 23.91 ± 0.10 1.14 0.81
1137 ж 59 299 1.6 21.42 ± 0.11 21.48 ± 0.05 25.00 ± 0.15 0.06 3.58
1182 ж 59 136 1.9 21.36 ± 0.01 21.47 ± 0.06 25.39 ± 0.15 0.11 4.03
1259 ж 59 111 1.8 20.72 ± 0.08 21.48 ± 0.05 21.66 ± 0.01 0.76 0.94
1299 ж 59 252 1.8 20.35 ± 0.14 21.30 ± 0.06 21.12 ± 0.03 0.95 0.77
1326 ж 59 380 1.8 19.71 ± 0.14 19.65 ± 0.14 23.15 ± 0.04 –0.06 3.44
1344 ж 59 381 1.7 20.26 ± 0.02 21.43 ± 0.05 21.21 ± 0.04 1.17 0.95
1340 ж 60 562 1.7 20.34 ± 0.09 20.27 ± 0.09 25.20 ± 0.18 –0.07 4.86
1348 м 60 761 1.7 20.35 ± 0.07 20.43 ± 0.08 24.51 ± 0.23 0.08 4.16
1353 ж 60 250 1.9 20.15 ± 0.02 20.17 ± 0.13 24.93 ± 0.20 0.02 4.78
298 ж 61 29 1.9 22.47 ± 0.02 23.39 ± 0.00 23.28 ± 0.01 0.92 0.81
1144 ж 61 147 1.8 20.27 ± 0.11 20.51 ± 0.08 24.48 ± 0.16 0.24 4.21
1234 ж 61 178 1.7 20.18 ± 0.05 21.29 ± 0.08 21.12 ± 0.09 1.11 0.94
1364 м 61 178 1.9 20.11 ± 0.10 21.22 ± 0.08 21.05 ± 0.16 1.11 0.94
1202 ж 62 111 1.8 20.48 ± 0.09 20.37 ± 0.14 24.22 ± 0.06 –0.11 3.74
1347 м 62 590 1.9 20.34 ± 0.05 21.21 ± 0.12 21.14 ± 0.06 0.87 0.80
1349 м 62 355 1.8 21.57 ± 0.15 22.48 ± 0.03 22.44 ± 0.04 0.91 0.87
1250 м 63 271 1.8 21.40 ± 0.04 21.25 ± 0.05 24.86 ± 0.05 –0.15 3.46
1294 м 63 173 1.6 20.63 ± 0.11 20.57 ± 0.05 24.03 ± 0.05 –0.06 3.40
1369 ж 63 301 1.9 20.35 ± 0.12 21.21 ± 0.09 21.25 ± 0.09 0.86 0.90
206 ж 64 90 1.9 21.36 ± 0.06 22.30 ± 0.05 22.11 ± 0.04 0.94 0.75
264 м 64 35 2.0 24.27 ± 0.27 25.38 ± 0.14 25.26 ± 0.10 1.11 0.99
1211 ж 64 323 1.4 19.50 ± 0.04 19.52 ± 0.03 22.67 ± 0.09 0.02 3.17
1255 ж 64 357 1.9 21.00 ± 0.05 21.04 ± 0.08 23.95 ± 0.13 0.04 2.95
1277 ж 64 330 1.7 20.37 ± 0.03 21.32 ± 0.04 21.39 ± 0.05 0.95 1.02
16л ж 65 95 1.8 20.97 ± 0.09 21.94 ± 0.10 21.89 ± 0.08 0.97 0.92
268 м 65 88 1.9 21.25 ± 0.04 22.28 ± 0.06 22.27 ± 0.05 1.03 1.02
299 м 65 56 1.9 21.41 ± 0.05 21.38 ± 0.14 25.04 ± 0.40 –0.03 3.63
1152 ж 65 112 1.7 19.78 ± 0.06 19.58 ± 0.06 23.05 ± 0.12 –0.20 3.27
1205 м 65 420 1.7 21.11 ± 0.09 21.19 ± 0.03 24.55 ± 0.08 0.08 3.44
1238 ж 66 346 1.7 20.28 ± 0.08 21.07 ± 0.09 21.07 ± 0.04 0.79 0.79
266 м 67 18 1.8 22.13 ± 0.14 22.08 ± 0.04 26.07 ± 0.14 –0.05 3.94
296ф ж 67 175 1.8 21.43 ± 0.04 22.54 ± 0.03 22.33 ± 0.05 1.11 0.90
1143 ж 67 84 1.6 20.51 ± 0.09 21.58 ± 0.10 21.40 ± 0.08 1.07 0.89
1372 ж 67 221 1.8 20.23 ± 0.11 20.03 ± 0.07 23.81 ± 0.27 –0.20 3.58
1428 м 67 433 1.8 20.65 ± 0.04 20.61 ± 0.11 23.86 ± 0.12 –0.04 3.21
295 м 68 219 1.8 20.66 ± 0.01 20.66 ± 0.07 23.93 ± 0.14 0.00 3.27
1365 ж 68 204 1.8 20.30 ± 0.04 20.29 ± 0.05 24.03 ± 0.07 –0.01 3.73
173 м 68 352 1.7 19.98 ± 0.07 19.89 ± 0.02 23.39 ± 0.09 –0.09 3.41
1437 м 68 213 1.8 20.17 ± 0.05 20.19 ± 0.04 24.13 ± 0.18 0.02 3.96
237 м 69 31 1.8 21.60 ± 0.11 21.75 ± 0.06 25.14 ± 0.25 0.15 3.54
240 м 69 18 1.9 21.27 ± 0.09 21.41 ± 0.11 25.08 ± 0.13 0.14 3.81
293 м 69 359 1.8 20.02 ± 0.01 20.08 ± 0.05 23.06 ± 0.02 0.06 3.04
1146 ж 70 149 1.8 19.56 ± 0.06 20.76 ± 0.07 20.41 ± 0.08 1.20 0.85
1413 м 70 522 1.9 19.77 ± 0.02 19.82 ± 0.06 23.65 ± 0.17 0.05 3.88
40 ж 72 179 1.8 20.22 ± 0.03 20.20 ± 0.04 24.10 ± 0.12 –0.02 3.88
205a ж 72 461 1.8 21.00 ± 0.03 20.90 ± 0.07 24.56 ± 0.18 –0.10 3.56
643 м 72 51 2.0 23.09 ± 0.02 23.08 ± 0.09 26.71 ± 0.10 –0.01 3.62
1115 м 72 78 1.7 21.24 ± 0.05 22.28 ± 0.10 22.21 ± 0.08 1.04 0.97
1576 м 72 307 1.8 21.06 ± 0.04 22.28 ± 0.10 21.98 ± 0.11 1.22 0.92
178 м 73 182 1.7 20.92 ± 0.05 20.92 ± 0.05 24.64 ± 0.13 0.00 3.72
1669 м 74 351 1.7 21.09 ± 0.02 20.90 ± 0.08 25.14 ± 0.07 –0.19 4.05
121 ж 75 163 1.7 20.36 ± 0.07 21.37 ± 0.07 21.19 ± 0.08 1.01 0.83
1168 ж 79 239 1.7 20.88 ± 0.12 20.96 ± 0.08 24.47 ± 0.11 0.08 3.59
1174 ж 79 271 1.6 21.05 ± 0.11 29.12 ± 0.41 20.98 ± 0.05 8.07 –0.07
1160 ж 80 195 1.7 21.20 ± 0.04 22.31 ± 0.02 22.12 ± 0.06 1.11 0.92
55 ж 81 221 1.7 19.17 ± 0.05 19.11 ± 0.03 22.35 ± 0.01 –0.06 3.18
56 м 81 414 1.7 20.09 ± 0.03 21.31 ± 0.06 21.18 ± 0.12 1.22 1.09
HeLa         20.77 ± 0.05 20.98 ± 0.11 23.81 ± 0.17 0.21 3.04
HeLa
/Taq
/Sss 		        20.63 ± 0.12 20.82 ± 0.16 27.52 ± 0.37 0.19 6.89

Ниже указаны структуры праймеров и флуоресцентно меченного зонда, использованных для проведения ПЦР-анализа участка хр20:37351957–37352083:

SRCd 5'-ACTCTCTGGGTTCCAGCTCTGGCT-3' (24)

SRCr 5'-CCAACTGGCTTCAAAGGCTTTGC-3' (23)

SRCz 5'-FAM-AGCATCCGTGAGCACCCAAGATCCC-BHQ1-3' (25).

ПЦР в реальном времени проводили согласно протоколу производителя [6] в объеме 20 мкл в триплетах на детектирующем амплификаторе CXF-96 (Bio-Rad, США) по следующей программе: при 95°C – 3 мин; 5 “слепых” циклов: 95°C – 10 с, 63°C – 20 с, 72°C – 10 с; 40 циклов: 95°C – 10 с, 63°C – 20 с (с детекцией флуоресцентного сигнала в канале FAM), 72°C – 10 с.

По завершении ПЦР, при помощи программного обеспечения амплификатора Bio-Rad CFX Manager v.2.1 устанавливали среднее значение Cq и значение среднеквадратичного отклонения для анализируемых образцов.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

В табл. 1 показаны значения Cq, полученные при ПЦР-анализе гидролизатов ДНК 161 донора крови и препаратов ДНК HeLa и HeLa/TaqI, метилированной ферментом SssI (столбцы 6–8). В столбцах 9 и 10 указаны значения величин Cq, полученные в Bst2UI- и GlaI-ПЦР анализе, за вычетом значений Cq в столбце 6 (контрольная ПЦР на BstDEI-гидролизате), обозначенные как ΔCq_G и ΔCq_5mC соответственно.

Анализ данных, представленных в табл. 1, показывает, что как и в предыдущих работах [1, 2] полученные значения ΔCq_G и ΔCq_C соответствуют друг другу для всех образцов ДНК в выборке. При этом выявляются три группы образцов ДНК. В первой из них значения ΔCq_G и ΔCq_C варьируют от 0.75 до 1.26, что приблизительно соответствует двукратному уменьшению количества нерасщепленных копий амплифицируемого участка. Таким образом, образцы первой группы представляют собой гетерозиготы по аллелям G и C в позиции хр20:37352001.

Во второй группе значения ΔCq_C варьируют от 8.07 до 10.75, в то время как значения ΔCq_G минимальны (от –0.1 до 0.16). Очевидно, что образцы ДНК второй группы полностью расщепляются ферментом Bst2UI и не содержат сайтов узнавания GlaI. Это свидетельствует о том, что в исследуемой позиции SNP находится лишь цитозиновый остаток (гомозиготы по C).

Для третьей группы образцов ДНК характерно повышенное значение ΔCq_G (2.69–5.04) при небольших значениях ΔCq_C (от –0.2 до 0.24). Соответственно данные образцы можно расценивать как содержащие лишь гуаниновый остаток в позиции хр20:37352001 (гомозиготы по G), причем комплементарный ему цитозиновый остаток находится преимущественно в метилированной форме.

Значения ΔCq_G (2.69–5.04) существенно меньше величин ΔCq_C (от 8.07 до 10.75), что, вероятно, связано с наличием неметилированного комплементарного цитозина, доля которого может достигать почти четверти. Для ДНК HeLa значение ΔCq_G составляет 3.04 и соответствует 12% неметилированной ДНК, тогда как при полностью метилированном сайте в этой ДНК (HeLa/TaqI, метилированной SssI) величина ΔCq_G составляет 6.89, что соответствует 99%-ному метилированию сайта.

На рис. 2 результаты, представленные в табл. 1, отсортированы в порядке уменьшения ΔCq_G.

Рис. 2.

Значения ΔCq_G и ΔCq_C для 161 образца донорской ДНК лейкоцитов (красный и синий цвет соответственно).

Таким образом, гетерозиготный набор G/C имеется в 68 образцах ДНК, четыре образца представляют собой гомозиготу C/C, а 89 образцов являются гомозиготными по аллелю G. Частота аллеля C в исследованной выборке составляет 23.6%. Полученные данные показывают, что во всех образцах ДНК цитозиновые остатки на обеих цепях сайта ACGT в последовательности ACGTGG преимущественно метилированы. Как было показано ранее, метилированная форма CG-динуклеотидов преобладает во всех компартментах генома за исключением CpG-островков и первых экзонов, выполняющих функцию регуляции экспрессии генов [7]. Вариабельный нуклеотид в положении хр20:37352001 расположен в первом интроне гена SRC и в случае аллеля G образующийся сайт ACGT метилирован по цитозиновым остаткам в обеих цепях ДНК.

В табл. 2 показано число генотипов и их доля от общего количества проанализированных препаратов ДНК доноров крови.

Таблица 2.

Распределение диплоидных наборов аллелей в позиции хр20:37352001 в общей выборке

Всего доноров C/C G/C G/G
N % N % N %
161 4 2.48% 68 42.24% 89 55.28%

В табл. 3 дано сравнение частот аллелей G и C в различных популяциях по данным проектов, представленных в базе “dbSNP”.

Таблица 3.

Частоты аллелей G и C для SNP в положении хр20:37352001 по данным различных проектов

Проект Когорта Число обследованных Частота G Частота C
1000Genomes Глобальная 5008 0.79 0.21
  Африка 1322 0.73 0.27
  Восточная Азия 1008 0.83 0.17
  Европа 1006 0.80 0.20
  Южная Азия 978 0.78 0.22
  Америка 694 0.83 0.17
1000Genomes_30x Глобальная 6404 0.78 0.22
  Африка 1786 0.73 0.27
  Европа 1266 0.79 0.21
  Южная Азия 1202 0.78 0.22
  Восточная Азия 1170 0.83 0.17
  Америка 980 0.83 0.17
TopMed Глобальная 264 690 0.76 0.24
The Avon Longitudinal Study Родители и дети 3854 0.73 0.27
Genetic variation in the Estonian population Эстония 4480 0.84 0.16
Northern Sweden Лен Вестерботтен 600 0.85 0.16
Genome of the Netherlands Release 5 Нидерланды 998 0.73 0.27
The Danish reference pan genome Дания 40 0.72 0.28
UK 10K study – Twins Близнецы 3708 0.73 0.27
Qatari Глобальная 216 0.71 0.29
A Vietnamese Genetic Variation Database Глобальная 214 0.85 0.15
Korean population from KRGDB Корея 2930 0.83 0.17
Siberian Глобальная 14 0.43 0.57
Настоящая работа Новосибирская область 161 0.76 0.24

Как видно из табл. 3, полученная нами частота аллеля С в 24% близка к значениям 21–22% для всей мировой когорты обследованных без учета географического проживания или этнического происхождения (“Global”) в проектах “1000Genomes” и совпадает с частотой в проекте “TopMed”. Что же касается исследованных ранее жителей Сибири, то завышенная (0.57) частота аллеля C, скорее всего, связана с небольшим размером выборки (n = 14). Теоретически определенная по формуле Харди–Вайнберга [8] величина числа гомозигот C/C для нашей выборки равна 9, что существенно больше экспериментально полученного значения 4, однако это различие может быть вызвано недостаточным числом обследованных в настоящей работе.

Интересно отметить, что аллель C в исследованной позиции считается “предковым” по отношению к аллелю G (по данным сравнения геномов гоминид, дополнительная информация к [9]). Гомозиготность по C выявлена также для денисовского генома и неандертальского генома из Виндии (https://www.eva.mpg.de/genetics/genome-projects/). Превалирование варианта G у современных людей вне зависимости от расы и этноса свидетельствует о том, что нуклеотидная замена С на G произошла на ранних стадиях становления Homo sapiens, причем в дальнейшем более эволюционно успешными оказались носители аллеля G.

Все процедуры, выполненные в исследовании с участием людей, соответствуют этическим стандартам институционального и/или национального комитета по исследовательской этике и Хельсинкской декларации 1964 г. и ее последующим изменениям или сопоставимым нормам этики.

От каждого из включенных в исследование участников было получено информированное добровольное согласие.

Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов.

Список литературы

  1. Акишев А.Г., Нетесова Н.А., Абдурашитов М.А., Дегтярев С.Х. Определение полиморфизма 5mC/T в повторе AluSx (Chr16: 75033884) в препаратах ДНК из крови человека методами GlaI- и FatI-ПЦР анализа // Эпигенетическая ДНК диагностика. 2021. Т. 1. С. 1–12. https://doi.org/10.26213/SE.2021.11.76.001

  2. Акишев А.Г., Нетесова Н.А., Абдурашитов М.А., Дегтярев С.Х. Определение полиморфизма 5mC/T в позиции Chr1: 245618129 в препаратах ДНК из крови человека методами GlaI- и FatI-ПЦР анализа // Эпигенетическая ДНК диагностика. 2021. Т. 1. С. 13–23. https://doi.org/10.26213/SE.2019.69.42836

  3. Sherry S.T., Ward M.H., Kholodov M. et al. dbSNP: the NCBI database of genetic variation // Nucl. Acids Res. 2001. V. 29. P. 308–311.https://doi.org/10.1093/nar/29.1.308

  4. Tarasova G.V., Nayakshina T.N., Degtyarev S.K. Substrate specificity of new methyl-directed DNA endonuclease GlaI // BMC Molecular Biol. 2008. V. 9: 7. https://doi.org/10.1186/1471-2199-9-7

  5. Акишев А.Г., Нетесова Н.А., Абдурашитов М.А., Дегтярев С.Х. Выщепление рестриктазой амплифицируемого фрагмента ДНК как способ исключения ошибочных результатов ПЦР в реальном времени c TaqMan зондом // ДНК-узнающие ферменты. 2021. Т. 1. С. 1–13. https://doi.org/10.26213/SE.2021.45.29.001

  6. CFX96 and CFX384 Real-Time PCR Detection Systems. Instruction Manual // https://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/10010424.pdf

  7. Edwards J.R., Yarychkivska O., Boulard M., Bestor T.H. DNA methylation and DNA methyltransferases // Epigenet. Chromatin. 2017. V. 10: 23. https://doi.org/10.1186/s13072-017-0130-8

  8. Stark A.E., Seneta E. A reality check on Hardy–Weinberg // Twin Res. Hum. Genet. 2013. V. 16. P. 782–789. https://doi.org/10.1017/thg.2013.40

  9. The 1000 Genomes Project Consortium. A global reference for human genetic variation // Nature 2015. V. 526. P. 68–74. https://doi.org/10.1038/nature15393

Дополнительные материалы отсутствуют.

Инструменты

следующая статья выпуска предыдущая статья выпуска содержание выпуска

Генетика

Архивы выпусков Информация о журнале Отправить рукопись в журнал