Генетика, 2023, T. 59, № 11, стр. 1290-1302

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Группы исследования. На основании базы данных Атласа генома рака (The Cancer Genome Atlas, https://www.cancer.gov/tcga) с помощью инструмента cBioPortal [10] в исследование отобрано 127 пациентов с РПР, принадлежащих к европеоидной расе. В работу были включены только пациенты, имеющие отрицательный ВПЧ-статус, представляющие основную долю случаев РПР среди молодых пациентов. Пациенты были поделены на четыре группы по возрасту на момент постановки диагноза (до и после 45 лет) и типу заболевания (РПР в целом и РЯ в частности). Первая группа включала пациентов до 45 лет включительно с диагнозом РПР, С01-06 по МКБ-10. У пациентов второй группы РПР (С01-06) был диагностирован после 45 лет. В третью группу входили пациенты с РЯ (С01-02) в возрасте до 45 лет включительно. Четвертую группу составили пациенты с РЯ (С01-02) старше 45 лет. Клинико-морфологические параметры пациентов в рамках групп исследования представлены в табл. 1. Не было обнаружено различий между молодыми и возрастными пациентами с РПР и РЯ по полу, стадии заболевания, размеру опухолевого узла (Т), степени метастатического поражения лимфатических узлов (N) и степени дифференцировки опухоли (G).

Генетический анализ. Анализ однонуклеотидных вариантов и аберраций числа копий ДНК проводили с помощью онлайн-инструмента cBioPortal на основании данных полногеномного секвенирования РПР и РЯ, полученных из базы данных Атласа генома рака.

Транскриптомный анализ. Данные РНК-секвенирования ткани РПР и РЯ были получены из базы данных Атласа генома рака. Идентификацию дифференциально-экспрессирующихся генов (ДЭГ) проводили с использованием пакета DESeq2 в среде R. ДЭГ со значениями log₂FC ≥ 0.75 (гиперэкспрессия) и log₂FC ≤ –0.75 (гипоэкспрессия) и p.adj < 0.05 использовались в дальнейшем анализе выраженности сигнальных путей. Визуализацию полученных результатов проводили с помощью инструментов ggplot2 (ggplot2, RRID: SCR_014601), pheatmap (pheatmap, RRID: SCR_016418) и онлайн-ресурса Phantasus [11].

Анализ метилирования. Анализ профиля метилирования ДНК тканей РПР и РЯ проводили с помощью онлайн-инструмента cBioPortal на основании микроматричного профилирования, полученных из базы данных Атласа генома рака. Дифференциально-метилированные гены (ДМГ) со значениями log₂FC > 0 (гипометилирование) и log₂FC < 0 (гиперметилирование) и p.adj ≤ 0.05 использовались в дальнейшем анализе выраженности сигнальных путей.

Протеомный анализ. Анализ экспрессии белков в тканях РПР и РЯ проводили с помощью онлайн-инструмента cBioPortal на основании количественного микрочипового профилирования, полученных из базы данных Атласа генома рака. Дифференциально-экспрессирующиеся белки (ДЭБ) со значениями log₂FC > 0 (гиперэкспрессия) и log₂FC < 0 (гипоэкспрессия) и p ≤ 0.05 использовались в дальнейшем анализе выраженности сигнальных путей.

Анализ микробиома. Анализ микробиомного профиля РПР и РЯ проводили с помощью онлайн-инструмента cBioPortal на основании РНК-секвенирования, полученных из базы данных Атласа генома рака. В исследовании использовался показатель log-cpm, который обозначает логарифм количества прочтений микробных сигнатур, приходящихся на 1 млн картированных прочтений [12].

Функциональное аннотирование генов. Онлайн-инструмент Enrichr использовался для функционального аннотирования ДЭГ, ДМГ, ДЭБ и генов, несущих мутации, с целью идентификации сигнальных путей, характерных для РПР и РЯ у молодых пациентов [13]. Аннотацию сигнальных путей проводили на основании электронной базы данных Киотской энциклопедии генов и геномов (KEGG).

Статистический анализ. Сравнение клинико-патологических характеристик больных РПР и РЯ молодого и старшего возраста проводили с помощью критерия χ². Сравнение экспрессии белков, профиля метилирования и микробиомного профиля РПР и РЯ в зависимости от возраста проводили с помощью t-критерия Стьюдента. Сравнение мутационного профиля РПР и РЯ в зависимости от возраста проводили с помощью точного одностороннего критерия Фишера. Различия принимались статистически значимыми при p ≤ 0.05 и на уровне тенденции при p ≤ 0.1.

РЕЗУЛЬТАТЫ

2. Транскриптомный профиль РПР у молодых пациентов

Рак полости рта. Обнаружено 382 ДЭГ между молодыми и возрастными больными РПР, включая 318 гипоэкспрессирующихся и 64 гиперэкспрессирующихся генов (таблица приведена в Online Resource 2). Топ 10 генов, гипоэкспрессирующихся в опухоли молодых пациентов, был представлен BPIFB1, RPL10P6, PIGR, BPIFB2, FDCSP, ODAM, DMBT1, TMPRSS3, IDO1, MUC5B (р.adj < 0.0003 и log₂FC ≤ –2.1), в то время как топ 10 гиперэкспрессирующихся генов включал HCG22, DCDC2, KRT4, CFAP58, PMEL, LINC02901, PPP1R3C, LGR6, FMN2, PLP1 (р.adj < 0.004 и log₂FC ≥ 1.1; рис. 1,а, б).

Рис. 1.

Различия транскриптомного профиля генов РПР между молодыми и возрастными пациентами. а, б – тепловая карта и диаграмма рассеяния разности экспрессии (volcano plot) генов; в – сигнальные пути KEGG, выраженные на основе гиперэкспрессирующихся генов, у молодых пациентов (p.adj ≤ 0.1); г – сигнальные пути KEGG, выраженные на основе гипоэкспрессирующихся генов, у молодых пациентов (p.adj ≤ 0.05).

По данным функционального аннотирования для гиперэкспрессирующихся у молодых пациентов генов наблюдалась тенденция активации сигнальных путей функционирования синаптического везикулярного цикла, ГАМК-ергических синапсов и секреции продуктов поджелудочной железы (рис. 1,в). В то же время гипоэкспрессирующиеся гены вовлечены в сигнальные пути взаимодействия цитокиновых рецепторов, каскада системы комплемента и свертывания крови, нарушения регуляции транскрипции при раке, JAK-STAT, метаболизма триптофана и ряда иммунных реакций (рис. 1,г).

Рак языка. У молодых больных РЯ был дифференциально экспрессирован 91 ген, включая 66 гипоэкспрессирующихся и 25 гиперэкспрессирующихся (таблица приведена в Online Resource 2). Топ 10 генов, гипоэкспрессирующихся в опухоли молодых пациентов, был представлен BPIFB1, RPL10P6, FDCSP, PIGR, DMBT1, MUC5B, DMRTA2, ODAM, ALG1L1P, KRT7 (р.adj < 0.007 и log₂FC ≤ –1.2), а топ 10 гиперэкспрессирующихся генов включал HCG22, ALB, PMEL, KRT4, PPP1R3C, EMP1, CLGN, THSD4, PLP1, FMN2 (р.adj < 0.03 и log₂FC ≥ 1.2; рис. 2,а, б).

Рис. 2.

Различия транскриптомного профиля генов РЯ между группами молодых и возрастных пациентов. а, б – тепловая карта и диаграмма рассеяния разности экспрессии (volcano plot) генов; в – сигнальные пути KEGG, выраженные на основе гиперэкспрессирующихся генов, у молодых пациентов (p.adj ≤ 0.1); г – сигнальные пути KEGG, выраженные на основе гипоэкспрессирующихся генов, у молодых пациентов (p.adj ≤ 0.05).

Гиперэкспрессирующиеся в опухоли молодых пациентов гены на уровне тенденции задействованы в процессах регуляции синтеза гормонов щитовидной железы (рис. 2,в). В то же время гипоэкспрессирующиеся гены вовлечены в сигнальные пути взаимодействия цитокиновых рецепторов и в процессы, характерные для коклюша и туберкулеза (рис. 2,г).

3. Профиль метилирования РПР у молодых пациентов

Рак полости рта. Между тканями РПР молодых и возрастных больных обнаружен 161 ДМГ (p.adj ≤ 0.05; рис. 3,а) (таблица приведена в Online Resource 3). Топ 10 гипометилированных генов представлен PRDM12, SLC7A8, PCDHB14, MYADM, ZNF585B, AQP5, FLJ40125-RTN2, TMPRSS2, RAP1GAP и BARD1 (табл. 2; рис. 3,б–л), тогда как гиперметилирование затрагивало только генный комплекс DTX3L–PARP9 (рис. 3,м).

Рис. 3.

Различия в профиле метилирования генов РПР (ось ординат) между молодыми и возрастными пациентами. а – дифференциально-метилированные гены (синим цветом указаны статистически значимые гены); б–л – гипометилированные гены у молодых пациентов; м – гиперметилированные гены комплекса DTX3L–PARP9 у молодых пациентов.

Рак языка. Между тканями РЯ молодых и возрастных больных обнаружено 226 ДМГ (p.adj ≤ ≤ 0.05; рис. 4,а) (таблица приведена в Online Resource 3). Топ 10 гипометилированных генов представлен ZFP42 (REX1), NEUROG1, TRPC4, ADD3, TOX2, ATP6V1C2, GATA4, TNFRSF8, ST6GALNAC5, FAM5B (табл. 3; рис. 4,б–м). Статистически значимых гиперметилированных генов не обнаружено у молодых пациентов.

Рис. 4.

Различия в профиле метилирования генов опухоли языка (ось ординат) между молодыми и возрастными пациентами. а – дифференциально-метилированные гены (синим цветом указаны статистически значимые гены); б–м – гипометилированные гены у молодых пациентов.

4. Протеомный профиль РПР у молодых пациентов

Рак полости рта. По сравнению с возрастными больными у пациентов молодого возраста с РПР обнаружена гиперэкспрессия белков BAK1, PRKCB_PS660, MYC, RICTOR_PT1135, STAT3_PY705, RICTOR, BCL2L11, PEA15_PS116, CHEK1_PS345, PRKCD_PS664, NOTCH1, RPS6KA1_PT359_S363, YWHAE, TSC2_PT1462, PRKCA_PS657, AKT3_PS473, AKT2_PS473, AKT1_PS473 и гипоэкспрессия TP53 (рис. 5,а).

Рис. 5.

Дифференциально-экспрессирующиеся белки между молодыми и возрастными пациентами с РПР (а) и РЯ (б). Слева – тепловая карта и справа – линейчатая гистограмма, отражающие средний уровень экспрессии белков у молодых и возрастных пациентов в ткани РПР и РЯ. На тепловой карте красным выделена гипоэкспрессия, зеленым – гиперэкспрессия белков.

Рак языка. По сравнению с возрастными больными у пациентов молодого возраста с РЯ обнаружена гипоэкспрессия белков RAB11A и RAB11B (рис. 5,б) и гиперэкспрессия BAK1, PRKCB_PS660, MYC, RICTOR_PT1135, STAT3_PY705, RICTOR, PEA15_PS116, RPS6KA1_PT359_S363, NOTCH1, TSC2_PT1462, AKT3_PS473, AKT2_PS473, AKT1_PS473 (рис. 5,б).

ОБСУЖДЕНИЕ

Актуальной проблемой современной онкологии является увеличение числа онкологических больных молодого возраста, что характерно и для РПР в частности [14]. Несмотря на обновление спектра имеющихся методов терапии, современные схемы лечения молодых больных РПР малоэффективны, что связывают с недостаточным уровнем знаний о молекулярных механизмах развития этой нозологии. При этом из всех видов РПР РЯ считается более агрессивным и чаще прогрессирующим, и предлагается рассматривать его как отдельный тип рака [4]. В связи с этим исследование молекулярных особенностей РПР в общем и РЯ в частности у пациентов молодого возраста является актуальной задачей. В представленной работе изучены молекулярные особенности РПР и РЯ на уровне генома, эпигенома, транскриптома, протеома и микробиома.

Для РПР характерен сложный мутационный ландшафт, который включает хромосомные аномалии, аберрации числа копий ДНК и генные мутации [15]. В настоящем исследовании у молодых пациентов как с РПР, так и с РЯ обнаружено снижение мутационной нагрузки в опухоли по сравнению с пациентами старше 45 лет. В настоящее время хорошо известно, что мутационная нагрузка отражает антигенный профиль опухоли, является предиктором для назначения иммунотерапии, в т.ч. у пациентов с раком головы и шеи, и связана с прогнозом РПР при проведении хирургического лечения [16, 17]. При этом степень мутационной нагрузки ниже 11.5 мутаций/Мб является неблагоприятным прогностическим фактором для общей выживаемости пациентов с РПР, которым не проводилась иммунотерапия [16]. Таким образом, результаты настоящего исследования могут указывать на худший прогноз РПР и РЯ у пациентов молодого возраста, что должно учитываться при проведении лечения данной категории больных.

На уровне транскриптома гипоэкспрессирующиеся гены в ткани РПР и РЯ у молодых пациентов главным образом вовлечены в регуляцию иммунных реакций и связаны с инфекционными заболеваниями, тогда как гиперэкспрессирующиеся гены в большинстве своем ассоциированы с гомеостазом организма. При этом обнаружена гиперэкспрессия генов HCG22, KRT4 и EMP1, которые могут ингибировать пролиферацию, рост и инвазию злокачественных клеток и индуцировать апоптоз в клетках РПР [18–20]. HCG22 также способен ингибировать сигнальные пути Akt, mTOR и Wnt/β-катенин, ассоциированные с онкогенезом и прогрессированием РПР, рака желудка и колоректального рака [18]. На основании этих результатов можно заключить, что РПР у молодых больных имеет транскрипционные особенности, отличные от таковых при РПР в старшем возрасте. Наиболее важным, на наш взгляд, является сниженная активность иммунно-воспалительных реакций в РПР у молодых больных.

Профиль метилирования как РПР, так и РЯ у молодых пациентов представлен в основном гипометилированными локусами. Обнаружено гипометилирование генов AQP5 и ZNF585B при РПР, которые по данным литературы гиперметилированы при раке головы и шеи и раке молочной железы у пациентов старше 45 лет [21, 22]. Другие гены, в частности ZFP42, GATA4 и ST6GALNAC5, гипометилированные при РЯ у молодых пациентов, ранее были описаны как гиперметилированные при плоскоклеточном раке легкого, глиобластоме и колоректальном раке у лиц старше 55 лет [23–25].

Обнаруженные ДЭБ при РПР у молодых пациентов участвуют главным образом в регуляции клеточного цикла и апоптоза посредством изменения активности генов TP53 и BCL2 [26]. Помимо этого NOTCH1, гиперэкспрессирующийся в ткани РПР молодых больных, входит в состав комплекса MAML1–RBP–Jkappa–ICN1, регулирующего клеточную дифференцировку [27]. Другие белки, гиперэкспрессирующиеся в ткани РПР молодых пациентов, участвуют в эпигенетической регуляции ядерных процессов: PRKCA и PRKCВ регулируют активность гистона H3T6 [28], а CHEK1 является треонин-киназой для гистона H3T11 [29]. Особенностью РЯ у молодых пациентов является гипоэкспрессия белков RAB11A и RAB11B по сравнению с возрастными пациентами. Известно, что данные белки активируют пролиферацию и подвижность опухолевых клеток пищевода через сигнальный путь Wnt [30].

Интегральный анализ генов с SNVs и CNAs, ДЭГ, ДМГ и ДЭБ позволил обнаружить общие сигнальные пути, характерные для РПР и РЯ у молодых пациентов (рис. 6). Молекулярный профиль РПР и РЯ у молодых больных в основном представлен гиперэкспрессией генов и белков, а также гипометилированием генов, участвующих в активации Rap1, PI3K-Akt, MAPK и cGMP-PKG сигнальных путей и Fc-гамма R-опосредованного фагоцитоза. Известно, что PI3K-Akt индуцирует экспрессию транскрипционных факторов, ответственных за прогрессию клеточного цикла и выживание клеток [31, 32]. cGMP-PKG-сигнальный путь подавляет рост и пролиферацию опухолевых клеток [33]. MAPK-сигнальный путь является ключевым игроком в опухолях разных локализаций и вовлечен в регуляцию пролиферации, дифференцировки и миграции клеток [34]. Также активация MAPK может приводить к злокачественной трансформации, а экспрессия компонентов данного пути имеет тенденцию к увеличению при РПР [35]. Для РПР у молодых пациентов также характерны Rap1-сигнальный путь, способствующий по данным литературы инвазии и миграции клеток рака предстательной железы и плоскоклеточного рака головы и шеи [36], и сигналинг Fc-гамма R-опосредованного фагоцитоза, играющего центральную роль в противоопухолевом иммунитете за счет фосфорилирования остатков тирозина иммунных рецепторов [37].

Рис. 6.

Сигнальные пути, выраженные при РПР и РЯ у молодых пациентов. В прямоугольниках приведены сигнальные пути, при этом синий цвет указывает на пути, характерные для РПР в целом, красный – для РЯ. Гены и белки, составляющие сигнальные пути, приведены в кружках: желтым – гены с SNVs, фиолетовым – гипометилированные гены, оранжевым – гипоэкспрессирующиеся гены, темно-зеленым – гиперэкспрессирующиеся белки и светло-зеленым – гипоэкспрессирующиеся белки.

Особенностью РЯ в молодом возрасте является активация сигнальных путей, ответственных за гомеостаз организма и его развитие, например посредством JAK-STAT-сигналинга и регуляции метаболизма гормонов и холина [38–41], за функционирование контрольных точек PD-L1 и PD-1 и ответ иммунной системы на инфекционные и паразитарные заболевания (болезнь Шагаса) [42–44]. Как следствие активация данных путей влияет на онкогенез и способствует прогрессии рака [39–41]. Интересно, что для РЯ также характерен сигнальный путь, ассоциированный с инфицированием ВПЧ, хотя в исследуемой группе все пациенты имели негативный ВПЧ-статус. Кроме того, в ткани РЯ наблюдается снижение активности рецепторов, ответственных за сборку фагосом. По данным литературы ингибирование фагоцитоза приводит к хроническому воспалению и повреждению тканей, а также обусловливает “ускользание” опухоли от иммунного ответа [45].

За последние десятилетия стала очевидной роль микробиома в поддержании здоровья человека и развитии различных заболеваний. В ряде работ описан вклад микробиома в развитие заболеваний полости рта, в том числе РПР и РЯ [46, 47]. Тем не менее молекулярные механизмы роли микробиома в формировании РПР непонятны [46]. В настоящем исследовании обнаружено, что в ткани РПР молодых больных чаще представлены бактерии родов Allosalinactinospora, Riemerella, Zooshikella, Demequina, Kyrpidia, Ethanoligenens, Ferrovum, Arcobacter, Bibersteinia, Haemophilus и Actibacterium и реже Lachnobacterium и Hylemonella. Большинство из перечисленных родов бактерий слабо изучены, особенно в отношении связи с раком. Есть данные о том, что бактерии рода Haemophilus в норме населяют ротовую полость [48]. При этом численность бактерий Haemophilus снижается у больных РПР по сравнению со здоровыми индивидами, у которых медиана возраста больных с РПР составила 66 лет [49]. Интересно, что микробиота РЯ у молодых пациентов отличается от таковой при других локализациях РПР. Так, в ткани РЯ отмечено увеличение бактерий родов Methylomicrobium, Pararhodospirillum, Knoellia, Collimonas, Actinokineospora, Mitsuaria, Hydrocarboniphaga, Chromohalobacter, Angustibacter и снижение Ferrimonas, Thermacetogenium, Haematobacter. Тем не менее информация о роли данных микроорганизмов в развитии и прогрессировании злокачественных новообразований практически отсутствует в доступной литературе. Известно, что для бактерий рода Chromohalobacter (Chromohalobacter salexigens и Chromohalobacter israelensis) и рода Actinokineospora характерна противоопухолевая активность [50].

Таким образом, РПР в общем и РЯ в частности у молодых пациентов характеризуются снижением мутационной нагрузки, активацией Rap1, PI3K-Akt, MAPK и cGMP-PKG сигнальных путей и сигналинга Fc-гамма R-опосредованного фагоцитоза, а также специфическими особенностями микробиома. В отличие от РПР для РЯ характерна активация сигнальных путей JAK-STAT, иммунного ответа на инфекционные и паразитарные заболевания и PD-L1/PD-1-опосредованной иммуносупрессии и ингибирование сигналинга фагоцитоза. Полученные данные свидетельствуют о том, что РПР у молодых пациентов обладает молекулярными особенностями, отличными от таковых у больных старше 45 лет, при этом РЯ отличается от других локализаций РПР по молекулярному профилю и, вероятно, должен рассматриваться как отдельная клиническая форма.

Все данные, использованные в настоящем исследовании, были загружены из общедоступного ресурса Атласа генома рака, а получение и анализ данных осуществлялись в соответствии с рекомендациями Атласа генома рака по публикации и политикой доступа к ним. Таким образом, дополнительного одобрения со стороны местного комитета по этике не требовалось.

Работа выполнена при финансовой поддержке гранта РНФ № 22-15-00308.

Настоящая статья не содержит каких-либо исследований с использованием в качестве объекта животных.

Настоящая статья не содержит каких-либо исследований с участием в качестве объекта людей.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.