Генетика, 2023, T. 59, № 3, стр. 336-344

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Биологические образцы. В исследование были включены следующие группы: образцы биологического материала (кровь) домашней собаки общей численностью 118 шт.; образцы биологического материала (кровь или мышечная ткань) волка – 80 шт. Образцы домашних животных были отобраны сотрудниками ветеринарных клиник и поступали для молекулярно-генетического анализа в отдельных пробирках типа Vacutainer (BD Vacutainer® Sodium Citrate Tubes), снабженных бирками с описанием животного (породная принадлежность, возраст, пол). Образцы биологического материала волка предоставлялись охотниками, добывающими волков в рамках программ регулирования численности в результате личных контактов авторов данной работы.

Выделение ДНК. ДНК из образцов мышечной ткани выделяли с использованием методики, основанной на высвобождении ДНК в ходе инкубирования образцов биологического материала в лизирующем буфере, содержащем 2% додецилсульфата натрия (SDS), 20 мM Tris-HCl, 100 мM NaCl, 20 мM EDTA (pH 8.0) и протеиназу К. При наличии фрагментов, которые подверглись лизису не полностью, осадок отделяли центрифугированием в течение 5 мин при 3000 об./мин, а супернатант переносили в новую пробирку. К супернатанту добавили 6.3 М раствор гуанидинхлорида в объеме 1/2 от объема исходной смеси, далее помещали пробирки в холодильник при 0–5°С на 10–15 мин, осадок комплекса продуктов расщепления белков с SDS удаляли центрифугированием в течение 8 мин (5000 об./мин). Далее использовали коммерческую смесь Roti®-Phenol (www.carlroth.com) согласно рекомендациям производителя.

Для выделения ДНК из крови использовали коммерческие наборы “Blood-Animal-Plant DNA Preparation Kit” (Jena Bioscience, www.jenabioscience.com).

Концентрацию ДНК измеряли с использованием спектрофотометра NanoDrop-1000 (Peqlab, Германия). Среднее значение концентрации ДНК составило 85.4 ± 11.8 нг/мкл (260/280–1.92 ± 0.13).

KASP. Определение генотипа по SNP g.27748425T>C (ADCY8) и g.1414373T>C (RYR3) осуществляли с использованием технологии, основанной на конкурентной аллель-специфической ПЦР (KASP, Kompetitive allele specific PCR). Генотипирование проводили с использованием KASP Assay mix (KASP by Design, KBD) и KASP Master mix (LGC Biosearch Technologies, Великобритания; ООО “Максим Медикал”, РФ) в двукратной повторности. ПЦР проводили в объеме 10 мкл в термоциклире CFX96 (Bio-Rad, США) согласно имеющимся рекомендациям по KASP.

ПЦР-ПДРФ. Реакцию ПЦР для генотипирования по SNP g.27748425T>C (ADCY8) и g.1414373T>C (RYR3) проводили в объеме 20 мкл. Количество вносимой ДНК на реакцию составляло 10–20 нг. Для ПЦР использовали реакционную смесь qPCRmix-HS (Евроген, РФ), финальная концентрация прямого и обратного праймеров составила 400 нМ. Протокол амплификации для двух SNP был одинаков: 95°С – 5 мин, 40 циклов (95°С – 10 с, 56°С – 30 с, 72°С – 30 с), 72°С – 5 мин. Реакцию рестрикции проводили согласно рекомендациям производителей, для g.27748425T>C использовали TaiI, для g.1414373T>C – TaqI (Thermo Fisher Scientific). Электрофорез проводили в 10.0%-ном ПААГ (акриламид/бисакриламид – 29/1, m/m) при постоянном напряжении электрического поля 320 V в течение 80 мин в термостатируемых условиях – +(6–10)°С.

Информация о последовательностях олигонуклеотидов (Евроген, РФ) для анализируемых SNP, а также о фрагментах реакции рестрикции представлены в табл. 1.

HRM-анализ. Генотипирование по SNP g.27748425T>C (ADCY8) и g.1414373T>C (RYR3) также проводилось с использованием Precision Melt Supermix for High Resolution Melt (HRM) Analysis (Bio-Rad, США) в трехкратной повторности согласно рекомендации производителя. Результаты аллельной кластеризации были проанализированы с использованием Precision Melt Analysis™ Software v1.3 (Bio-Rad, США). Концентрация ДНК для всех образцов была стандартизирована до 10 нг/мкл. Протокол амплификации и плавления ампликона соответствовал рекомендуемым Bio-Rad.

Определение генотипа in silico. Генотипы in silico для животных, геномы которых были представлены в открытом доступе в NCBI, определяли с использованием on-line алгоритма SRA-Blast (файлы в формате *.sam) и программы Unipro UGENE v.1.31.1 [9]. Определение генотипа с использованием алгоритма BLAST (с покрытием в интересующем полиморфизме ≥5х) было проведено для 694 особей домашней собаки (Canis lupus familiaris) и 203 особей волка (Canis lupus). Для автоматизации процесс поиска, скачивания файлов в формате *.sam, а также пакетного определения генотипа для первичного анализа использовали програмную библиотеку Selenium WebDriver для Google Chrome (версия 89.0.4389.90) под управлением Python (версия 3.9).

Также определены генотипы для ряда родственных биологических видов: обыкновенный шакал – Canis aureus (n = 1), койот – Canis latrans (n = 5), гималайский волк – Canis lupus chanco (n = 8), Динго – Canis lupus dingo (n = 10), иберийский волк – Canis lupus signatus (n = 1), красный волк – Cuon alpinus (n = 2), африканский золотой волк – Canis lupaster (n = 1), эфиопский шакал – Canis simensis (n = 1), гиеновидная собака – Lycaon pictus (n = 1). Дополнительно определены генотипы для трех особей, являющихся гибридами между волком и собакой (Canis lupus × Canis lupus familiaris – wolfdog).

При анализе “сырых” данных (raw data) полных геномов использовали файлы из проектов PRJEB34110, PRJEB39198, PRJEB42199, PRJEB43408, PRJEB44869, PRJNA263947, PRJNA358192, PRJNA417738, PRJNA448733, PRJNA494719, PRJNA494815, PRJNA512209, PRJNA517114, PRJNA532581, PRJNA543877, PRJNA593363, PRJNA648123.

Используемые настройки поиска генотипа in silico отражены в работе [10].

Статистический анализ данных. Дифференцирующий потенциал SNP определяли с использованием ROC-анализа в SPSS v.20.0. При наличии нижней границы асимптотического 95%-го доверительного интервала более 0.8 для параметра AUC (площадь под кривой) полиморфизм позиционировался как генетический маркер с высоким дифференцирующим потенциалом.

Комплексную оценку дифференцирующего потенциала для совокупности SNP проводили с использованием программы MDR v.3.0.2 (http://www.multifactordimensionalityreduction.org/) [11]. Вклад конкретного генотипа определялся величиной энтропии Н (выраженной в %). При H = = 100% генотип способен однозначно дифференцировать, к какой группе (волк или домашняя cобака) относится неизвестный образец. В программе MDR в результате множественных перестановок (пермутаций) первичных данных определяется наиболее оптимальная модель дифференциации.

В процессе моделирования были использованы высоко консервативные настройки поиска конфигурации модели, которые позволили однозначно дифференцировать наличие/отсутствие статистически значимых эффектов, а имеено: количество атрибутов (attribute count range) – от 1 до n (где n – число переменных в модели); воспроизводимость модели (cross-validation count) – 100; анализ топ-моделей (track top models) – 1000; поиск конфигурации модели (search method configuration) – всесторонний (exhaustive); метод сравнения (ambiguous cell analysis) – точный тест Фишера (Fisher’s exact test); классификация ячеек (ambiguous cell assignment) – неклассифицированные (unclassified). Корректность модели оценивали по значению сбалансированной точность (Balanced Accuracy), которая зависит от чувствительности и специфичности модели.

Вероятность отнесения образца к одной из двух групп: Canis lupus familiaris или Canis lupus, – рассчитывали в SPSS v.20.0 с использованием логистической регрессии.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

С использованием алгоритма глобального выравнивания, реализованного в ПО Unipro UGENE v.1.31.1 [9], были проанализированы на наличие SNP с высоким дифференцирующим потенциалом (т. е. с максимально различающимися частотами распространения аллелей для двух групп) следующие регионы: на 13 хромосоме – g.27 000 000–g.29 000 000 и на 30 хромосоме – g.800 000–g.1 600 000. Выбор данных регионов был обусловлен тем фактом, что в исследовании B.M. Vonholdt с соавт. [3] c применением полногеномного анализа SNP были выявлены кластеры нуклеотидных последовательностей (для 13 хромосомы – длиной 543 841 пн, для 30 хромосомы – 1 239 195 пн), содержащие SNP, частота аллелей для которых существенно отличалась для представителей Canis lupus familiaris и Canis lupus по причине эволюционной дивергенции. В результате биоинформатического анализа были выявлены 13 SNP c потенциально высоким дифференцирующим потенциалом.

С использованием биоинформатического и молекулярно-генетического анализа определены генотипы по SNP g.27748425T>C (ADCY8) и g.1414373T>C (RYR3) для 1095 животных, из них 283 – Canis lupus, 812 – Canis lupus familiaris (см. Приложение). Наибольший дифференцирующий потенциал был определен для SNP g.27748425T>C (ген ADCY8) – AUC = 0.947, 95%ДИ 0.934–0.960, p = 3.45E-112. Для SNP g.1414373T>C (ген RYR3) – AUC = 0.893, 95%ДИ 0.871–0.915, p = 4.31E-87.

Для включенных в исследование образцов домашней собаки (n = 812) показано наличие трех генотипов для полиморфизма g.27748425T>C (ADCY8), при этом аллель Т распространен в выборке “Домашняя собака” с частотой 78.9%, т. е. является мажорным. Для образцов из выборки “Волк” (n = 283) в рамках данного исследования аллель С распространен с частотой 99.3%. Электрофореграмма разделения рестриктов представлена на рис. 1, результаты аллельной дискриминации с использованием KASP – на рис. 2.

Рис. 1.

Результаты электрофоретического разделения рестриктов для полиморфизма g.27748425T>C гена ADCY8 в 10.0%-ном ПААГ. М – маркер молекулярного веса (Jena Bioscience M-213S). 1 – T/T Canis lupus f., 2 – T/T Canis lupus f., 3 – T/T Canis lupus f., 4 – C/C Canis lupus, 5 – C/C Canis lupus, 6 – C/C Canis lupus, 7 – C/C Canis lupus.

Рис. 2.

График аллельной дискриминации результатов KASP для полиморфизма g.27748425T>C гена ADCY8.

Для образцов из выборки “Домашняя собака” для полиморфизма g.1414373T>C (RYR3) также показано наличие трех генотипов. Аллель T распространен в данной выборке с частотой 80.9%. Для образцов из выборки “Волк” в рамках данного исследования аллель C распространен с частотой 83.2%. Электрофореграмма разделения рестриктов представлена на рис. 3, результаты аллельной дискриминации с использованием KASP – на рис. 4.

Рис. 3.

Результаты электрофоретического разделения рестриктов для полиморфизма g.1414373T>C гена RYR3 в 10.0%-ном ПААГ. М – маркер молекулярного веса (Jena Bioscience M-213S). 1 – T/T Canis lupus f., 2 – T/T Canis lupus f., 3 – T/T Canis lupus f., 4 – C/T Canis lupus, 5 – C/C Canis lupus, 6 – C/C Canis lupus, 7 – C/C Canis lupus.

Рис. 4.

График аллельной дискриминации результатов KASP для полиморфизма g.1414373T>C гена RYR3.

Для создания универсальной системы дифференциации было принято решение включить в тест-систему по одному SNP из каждой хромосомы, чтобы избежать сложностей, сопряженных с совместным наследованием генетических маркеров. Графическая интерпретация модели представлена на рис. 5. Согласно полученным результатам сбалансированная точность дифференциации (adj. Balanced accuracy) волка от домашней собаки при анализе 1095 образцов по двум SNP – g.27748425T>C (ген ADCY8, chr. 13) и g.1414373T>C (ген RYR3, chr. 30), – составила 96.2% (специфичность модели – 96.3, чувствительность – 98.9%), см. файл “Доп. материалы.xlsx”, лист “MDR_result”. В среднем, в 5.8% случаев особь не удалось отнести ни к одному кластеру с заявленным в MDR-уровнем точности в 99.0%.

Рис. 5.

Графическое представление модели из двух полиморфизмов в генах ADCY8 и RYR3. а – распределение генотипов исследованных локусов в выборках “Домашняя собака” и “Волк”: в каждой ячейке цифра слева – абсолютное число особей Canis lupus, цифра справа – абсолютное число особей Canis lupus familiars. б – результат отнесения образца к одной из двух групп – Canis lupus или Canis lupus familiars.

В то же время при оценке точности отнесения образца к одной из двух групп: Canis lupus familiaris (CLF) или Canis lupus (CL) с использованием логистической регрессии получены следующие данные (см. файл “Доп. материалы.xlsx”, лист “LOG”): при наличии генотипа СС (ADCY8)/СС (RYR3) вероятность отнесения образца к группе CL составляет 95.26% (распространенность особей с данным генотипом в группе – 71.73%), при наличии генотипа СС (ADCY8)/ТС (RYR3) – 72.93% (распространенность – 22.26%); при наличии генотипа TС (ADCY8)/СС (RYR3) вероятность отнесения образца к группе CLF составляет 80.27%, при наличии генотипа TС (ADCY8)/ТС (RYR3) – 96.81%, при наличии генотипа TС (ADCY8)/ТТ (RYR3) – 99.56%, при наличии генотипа TТ (ADCY8)/СС (RYR3) – 99.70%, при наличии генотипа TТ (ADCY8)/ТС (RYR3) – 99.96%, при наличии генотипа TТ (ADCY8)/ТТ (RYR3) – 100%.

Особого внимания заслуживают три особи волка, по фенотипическим характеристикам однозначно относящихся к Canis lupus, с генотипами TC (ADCY8)/TC (RYR3) и TТ (ADCY8)/TТ (RYR3), которые теоретически могут относиться к волкособам (гибридам между волком и собакой). Косвенно это указывает тот факт, что для образцов SAMEA7038723, SAMEA7038724 и SAMEA7038725, являющихся гибридами между волком и собакой (Canis lupus × Canis lupus familiaris – wolfdog, BioProject – PRJEB39198), определены гетерозиготные генотипы для полиморфизма g.27748425T>C (ADCY8), см. файл “Доп. материалы.xlsx” (лист “dataset”) и табл. 2. Возможно, в дальнейшем анализ этих образцов с использованием STR-локусов подтвердит данное предположение.

Среди особей Canis lupus familiaris с генотипами СС (ADCY8)/СС (RYR3) и СС (ADCY8)/ТС (RYR3) выявлены породы: русский черный терьер, шарпей, аляскинский маламут, пекинес, бельгийская овчарка, куньминская овчарка, такса, бернский зенненхунд, йоркширский терьер, шотландский терьер, алапахский бульдог, доберман пинчер. Таким образом, наличие аллеля С (g.1414373T>C, RYR3), характерного для Canis lupus, не является специфической характеристикой для каких-то конкретных пород собак.

Также мы апробировали метод HRM для генотипирования полиморфных вариантов g.27748425T>C (ADCY8) и g.1414373T>C (RYR3). Цель этапа – дать исследователю простой, но достаточно точный и доступный метод генотипирования в контексте описанной выше модели. Для деградированных образцов ДНК, как нам представляется, данный способ будет весьма актуален.

Результаты аллельной кластеризации были подтверждены с использованием ПЦР-ПДРФ и KASP. Результаты кластеризации для полиморфизма g.27748425T>C (ADCY8) представлены на рис. 6,а, для g.1414373T>C (RYR3) – рис. 6,б.

Рис. 6.

Результат кластеризации генотипов в Precision Melt Analysis™ Software v.1.3 (Bio-Rad, США) для полиморфизма: а – g.27748425T>C (ADCY8), б – g.1414373T>C (RYR3).

Также с использованием предложенной нами тест-системы была проведена апробация на образцах близкородственных к Canis lupus видов, а именно: обыкновенный шакал (Canis aureus), койот (Canis latrans), гималайский волк (Canis lupus chanco), динго (Canis lupus dingo), иберийский волк (Canis lupus signatus), красный волк (Cuon alpinus), африканский золотой волк (Canis lupaster), эфиопский шакал (Canis simensis) и гиеновидная собака (Lycaon pictus). Результаты генотипирования in silico и классификация по кластерам представлены в табл. 2. Особи видов Canis latrans, Canis lupus signatus, Canis simensis, Cuon alpinus, Lycaon pictus и Canis lupaster были отнесены к кластеру “Волк” (Canis lupus). Семь из восьми представителей вида Canis lupus chanco также были отнесены к кластеру “Волк” (Canis lupus). Среди особей вида Canis lupus dingo лишь шесть из десяти были отнесены к кластеру “Волк” (Canis lupus). Как известно, собаки динго – вторично одичавшие домашние собаки, и, таким образом, среди них высока частота аллелей, характерных для вида Canis lupus familiaris.

Необходимо отметить, что сбалансированная точность дифференциации Canis lupus familiaris и Canis lupus составила более 95%, данного показателя вполне достаточно для решения большинства задач биологической направленности, например, в контексте популяционных исследований. В то же время, в 2.56% случаев (согласно модели, рис. 6) образцы домашней собаки могут быть некорректно дифференцированы как образцы волка. В перспективе для увеличения точности модели (например для криминалистических приложений) необходимо увеличение выборки исследуемых образцов за счет включения новых образцов с заведомо известной видовой принадлежностью, например по результатам биологического исследования (при наличии шкуры и др. объектов биологического происхождения, позволяющих однозначно дифференцировать видовую принадлежность образца) и/или генетического исследования (например анализ STR-локусов). Также перспективно и добавление в предложенную нами модель новых SNP с высоким дифференцирующим потенциалом.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В рамках настоящего исследования предложена тест-система, основанная на анализе двух SNP в генах ADCY8 и RYR3, по дифференциации волка (Canis lupus) и домашней собаки (Canis lupus familiaris). Так, с использованием методов биоинформатики определены SNP c высоким дифференцирующим потенциалом для различения волка и домашней собаки, а также на практическом материале подтвержден высокий дифференцирующий потенциал выявленных полиморфных вариантов. На основании результатов молекулярно-генетического анализа и генотипирования in silico 1095 образцов предложена тест-модель из двух SNP –g.27748425T>C (ADCY8) и g.1414373T>C (RYR3), сбалансированная точность которой составляет не менее 96.2% при специфичности 96.3%. Входящие в тест-систему SNP представляется возможным анализировать с использованием различных технологий – KASP, ПЦР-ПДРФ или HRM.

Предложенная нами схема по дифференциации волка и домашней собаки с использованием двух SNP выгодно отличается своей универсальностью (с позиций методологического подхода возможно использовать различную приборную базу), высокими точностью и специфичностью. Молекулярно-генетический анализ с использованием KASP призван сократить временные и финансовые затраты на молекулярно-генетическое тестирование, а также снизить риск кросс-контаминации, т. к. процесс является одностадийным (исключены этапы рестрикции и электрофореза).

В целом, продолжение исследований, расширение базы образцов и включение в тест-систему дополнительных SNP для идентификации, в том числе и гибридов между Canis lupus familiaris и Canis lupus, продолжает оставаться актуальной задачей.

Исследование выполнено при частичной финансовой поддержке OOO “Максим Медикал” в рамках частной научной инициативы “Analysis of SRA Data using bioinformatics methods”.

Все применимые международные, национальные и/или институциональные принципы ухода и использования животных были соблюдены.

Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов.