1. На главную
  2. Электронные версии
  3. Генетика
  4. T. 59, № 3, 2023

Генетика, 2023, T. 59, № 3, стр. 327-335

Сравнительный анализ экспрессии генов HAP2/GCS1, GEX2 у линий кукурузы саратовской селекции

Е. М. Моисеева 1, Ю. С. Гусев 1, 2, О. В. Гуторова 2, М. И. Чумаков 1, *

1 Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов – обособленное структурное подразделение Федерального исследовательского центра “Саратовский научный центр Российской академии наук”,
410049 Саратов, Россия

2 Саратовский национальный исследовательский государственный университет им. Н.Г. Чернышевского
410012 Саратов, Россия

* E-mail: chumakov_m@ibppm.ru

Поступила в редакцию 11.05.2022
После доработки 20.07.2022
Принята к публикации 25.07.2022

Полный текст (PDF)

Аннотация

Исследование явления гаплоиндукции представляет научный и практический интерес в связи с разработкой эффективных методов получения гаплоидов, необходимых, в частности, для ускоренного создания гомозиготных линий. Обсуждается связь индукции образования гаплоидов у линии кукурузы саратовской селекции Зародышевый маркер саратовский пурпурный (ЗМСП) с генами HAP2/GCS1 и GEX2, контролирующими адгезию и слияние мембран гамет у кукурузы. С помощью метода ПЦР-РВ установлено, что гены GEX2, HAP2/GCS1 экспрессируются не только в спермиях, но и в женских генеративных структурах кукурузы, но гаплоиндуцирующая способность кукурузы не коррелирует с уровнем их экспрессии. Было показано, что ген GEX2 у гаплоиндуцирующей линии ЗМСП имеет 27 однонуклеотидных замен, вставку размером в девять нуклеотидов и одну двухнуклеотидную замену и соответственно десять аминокислотных замен и две вставки в белке GEX2, по сравнению с референсной линией В73. Эти замены, возможно, оказывают воздействие на конформацию белка и процесс взаимодействия мембран гамет. Более эволюционно консервативный белок HAP2/GCS1, обеспечивающий слияние мембран гамет кукурузы, у линии кукурузы ЗМСП имеет только одну аминокислотную замену, по сравнению с линиями Коричневый маркер и В73.

Ключевые слова: кукуруза, Zea mays, гены гиногенеза, экспрессия.

У высших растений развитие семян начинается с двойного оплодотворения, открытого С.Г. Навашиным в 1898 г. [1]. После попадания пыльцы кукурузы на рыльце вегетативная клетка пыльцевого зерна образует пыльцевую трубку, с помощью которой два спермия доставляются к зародышевому мешку. Один спермий (1n) сливается с яйцеклеткой (1n), второй (1n) – с центральной клеткой (2n). Из оплодотворенной яйцеклетки развивается диплоидный зародыш. Центральная клетка с двумя полярными ядрами (2n) в результате слияния со вторым спермием (1n) образует триплоидный эндосперм (3n) [2].

При нарушении двойного оплодотворения у покрытосеменных растений может формироваться партеногенетический гаплоидный зародыш (1n) из неоплодотворенной или оплодотворенной дефектными спермиями яйцеклетки (гиногенез). У современных сортов кукурузы независимое от оплодотворения развитие зародыша (гиногенез или матроклинный партеногенез, как частный случай) встречается крайне редко (0.1–0.01%) [3]. Однако 60 и более лет назад были выведены линии кукурузы с повышенной способностью к индукции гаплоидов (гаплоиндукторы). К ним относятся линии PEM [4], Stock 6 [3] и линии, полученные с использованием Stock 6: ЗМС, ЗМС-8, КМС (Саратов, Россия) [5]; Краснодарский маркер (Краснодар, Россия) [6]; MHI (Молдова) [7, 8] и некоторые другие [9, 10]. Было предположено, что способность саратовских линий ЗМС и КМС к индукции гаплоидов может быть обусловлена нарушением функции спермиев, которые не могут достичь яйцеклетки и/или слиться с ней [5, 11–13]. Однако причины и механизм повышенной гаплоиндуцирующей способности у саратовских линий-гаплоиндукторов кукурузы по сравнению с Stock 6 неясны.

С использованием линии Stock 6 были также получены партеногенетическая линия AT-1 (Саратов) и ее производная линия AT-3 с высокой частотой партеногенеза (с наследуемой матроклинной гаплоидией) [14–16]. Кроме партеногенеза у линии AT-3 наблюдаются полиэмбриония и начало эндоспермогенеза без опыления, но эти линии не являются гаплоиндукторами [16].

Механизмы формирования гаплоидов кукурузы могут быть разными: партеногенетическое развитие зародыша из неоплодотворенной яйцеклетки, апогамия (партеногенетическое развитие зародыша из яйцеклеткоподобных синергид или антипод), гиногенез (явление, при котором после оплодотворения ядро спермия не сливается с ядром яйцеклетки, а затем дегенерирует, и в развитии зародыша участвует только ядро яйцеклетки), андрогенез. За последние 5–7 лет были изучены некоторые молекулярно-генетические аспекты формирования гаплоидов кукурузы [10].

Один из механизмов образования матроклинных гаплоидов у кукурузы был открыт в 2017 г., когда три научные группы независимо опубликовали пионерские данные по расшифровке спонтанной мутации в одном из генов у линии Stock 6 [17–19]. Нуклеотидная последовательность, которая кодирует белок фосфолипазу A, получила разные обозначения (в порядке появления публикаций): MATRILINEAL (MTL) [17], NOT LIKE DAD (NLD) [18], PLA1 [19]. Вставка четырех нуклеотидов в четвертый экзон гена, кодирующего фосфолипазу А у линии Stock 6, сдвинула рамку считывания, изменив 20 аминокислот [19]. Если такую вставку произвести в ген, кодирующий фосфолипазу у обычной линии (негаплоиндуктора), то это приводит к появлению фенотипа аналогичного фенотипу Stock 6 и дает до 2% гаплоидов в потомстве [19].

Эта спонтанная мутация у линии Stock 6 была унаследована линиями, полученными с ее участием [9]. Фермент фосфолипаза А участвует в биодеградации фосфолипидов и в синтезе линоленовой кислоты. Однако авторы, открывшие ген индукции матроклинных гаплоидов [17–19], не уточнили его роль в гаплоиндукции. Возможно, что эта мутация в результате неправильного функционирования фермента приводит к изменениям липидного состава мембраны и следовательно к изменениям ее свойств, что, возможно, приводит к потере способности мембраны спермия взаимодействовать и сливаться с мембраной яйцеклетки и центральной клетки [20]. Можно предположить, что мутации по генам, кодирующим белки, которые участвуют во взаимодействии (адгезии) и слиянии мембран спермия с яйцеклеткой и центральной клеткой, тоже могут привести к нарушениям двойного оплодотворения.

Одной из причин нарушения двойного оплодотворения могут быть нарушения во взаимодействии между мембранами гамет. Первые данные о гене (HAP2/GCS1 (HAPLESS2/Generative Cell Specific 1)), контролирующем взаимодействие мембран гамет у Arabidopsis thaliana, были опубликованы независимо исследователями из Японии [21] (электронная публикация 25 декабря 2005 г.) и США [22]. Белок HAP2(GCS1) необходим для слияния мембран спермия и яйцеклетки, центральной клетки у A. thaliana [23]. Положительный заряд в С-концевой области необходим для функционирования белка HAP2(GCS1) во время слияния гамет [24]. Была показана значительная (69%) гомология между геном HAP2/GCS1 A. thaliana и последовательностью ZM_BFb0162K03 (1921 но) у кукурузы, которая содержит консервативную область, полностью идентичную соответствующим областям у A. thaliana и лилии (Lilium longiflorum) [25]. Экспрессия гена HAP2/GCS1 в кукурузе неспецифична для спермиев, поскольку мРНК была обнаружена в образцах, выделенных из завязей, корней и листьев [25], а также из семян, початков и незрелых метелок [26, 27]. Роль белка HAP2/GCS1 в способности индуцировать гаплоиды еще не доказана.

Эксперименты по картированию с мутантами показали, что ген GEX2 (gamete expressed 2, At5g49150) контролирует раннее взаимодействие (адгезию) гамет у A. thaliana [28]. Белок EC1, секретируемый женскими гаметами, запускает активацию белков HAP2/GCS1 и GEX2 и их экспонирование на поверхности мембраны спермиев (см. обзоры [20, 23]). Мембранный белок GEX2 необходим для начала взаимодействия спермия (прикрепления, адгезии) с мембраной яйцеклетки и центральной клетки A. thaliana [23]. У мутантов по гену GEX2 нарушается способность к адгезии и, как следствие, к слиянию мембран спермиев с яйцеклеткой и центральной клеткой, что приводит к образованию семян, содержащих либо гаплоидный зародыш, либо неправильно формирующийся эндосперм. Предполагается, что у саратовских линий кукурузы однократное оплодотворение является результатом функциональных дефектов у спермиев, которые приводят к образованию гаплоидных зародышей [11].

Известны также некоторые другие гены, при мутации в которых растения приобретают способность к гаплоиндукции. Установлено, что у A. thaliana появление гаплоидов в потомстве связано, в том числе, с мутацией в белке гистона H3, специфичном для центромеры – CENH3. Эта мутация приводит к хромосомной несовместимости и потере части или полного набора отцовских хромосом в первых делениях зиготы (анеуплоидия) [29]. У линий-гаплоиндукторов кукурузы, полученных при скрещиваниях с линией Stock 6, также наблюдалась частичная или полная элиминация хромосом [30–32]. Напомним, что линия Stock 6 и ее производные при использовании их в скрещивании в качестве отцовского родителя (индуцированный гиногенез) индуцируют гаплоиды в количестве 2–3% [33]. В отличие от A. thaliana, у которого при мутации в гене CENH3 возникает анеуплоидия и гаплоидия, у кукурузы элиминируются хромосомы мужского родителя после оплодотворения на ранних стадиях развития зародыша, приводя к гаплоидии (до 3.6%) [32].

Мембранный домен белка DUF679, кодируемый геном DMP9, экспрессируется в мембранах женских и мужских гамет A. thaliana и регулирует их контакт [34]. У A. thaliana нокаут этого гена нарушает оплодотворение яйцеклетки в большей степени, чем оплодотворение центральной клетки [35]. Роль гена DMP в индукции гаплоидов кукурузы была показана с помощью геномного редактирования (CRISPR-Cas9) в экспериментах по нокауту генов [36].

Ген PSASGR-BBML относится к семейству APETALA2/(AP2/ERF), экспрессируется в яйцеклетке до оплодотворения и его роль в индукции партеногенеза была показана для проса [37], кукурузы и риса [38].

Таким образом, установлено несколько генов, которые контролируют появление матроклинных гаплоидов у кукурузы: PLA1, DMP, CENH3, BBML. В представленной статье мы обсуждаем индукцию образования гаплоидов, предположительно связанную с нарушением взаимодействия гамет, в частности с генами, контролирующими адгезию и слияния мембран гамет (HAP2/GCS1, GEX2) у гаплоиндуцирующих линий кукурузы саратовской селекции.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Растительный материал

В настоящей работе были использованы линии кукурузы саратовской селекции (Зародышевый маркер саратовский пурпурный (ЗМСП) и ГПЛ-1) и линия Коричневый маркер (КМ). У линии ЗМСП, отобранной из потомства самоопыляемых гибридов материнской линии Зародышевый маркер саратовский (ЗМС-8) [39] и отцовской линии-гаплоиндуктора Коричневый маркер саратовский (КМС, Саратов), частота гаплоиндукции достигает 10% [40]. Линии ЗМС-8 и КМС с частотой гаплоиндукции до 6–8% [39] являются прямыми потомками линии-гаплоиндуктора Stock 6 [9]. В качестве контроля использовали негаплоиндуцирующие линии КМ и ГПЛ-1. Линия КМ, созданная С.С. Чейзом (Chase) [41], была получена из Национального зернового центра им. Лукьяненко (Краснодар, Россия). Диплоидная линия ГПЛ-1 была получена на кафедре генетики Саратовского государственного университета (Саратов, Россия) путем обработки колхицином гаплоидного растения кукурузы линии Кинельская 113 (Федеральный центр сельскохозяйственных исследований Юго-Восточного региона, Саратов, Россия [11]).

Все линии были выращены на полях Российского научно-исследовательского, проектно-технологического института сорго и кукурузы (Институт Россорго; Саратов, Россия) в 2020 г. и на опытном участке Института биохимии и физиологии растений и микроорганизмов Саратовского научного центра Российской академии наук (Саратов) в 2021 г.

Початки кукурузы были изолированы с помощью пергаментных пакетов до того, как появились пестичные нити (конец июля–начало августа). Для получения зародышей предварительно изолированные початки опыляли вручную пыльцой других растений кукурузы и собирали початки через семь дней после опыления (7 ДПО). Часть образцов этой же линии была собрана через семь дней после появления рылец (7 ДППР) из предварительно изолированных початков без опыления. Все собранные початки были помещены в контейнеры со льдом, доставлены в лабораторию и заморожены при температуре –20°C.

Экспрессия генов GEX2, HAP2/GCS1 в тканях кукурузы

Тотальную РНК выделяли из 100 мг предварительно замороженных (–20°C) завязей, извлеченных из початков (7 ДППР или 7 ДПО), с использованием набора для экстракции РНК (Евроген, Россия), согласно инструкции производителя. Из 100 мг предварительно замороженных (–20°C) пыльцевых зерен РНК выделяли с использованием метода SDS/βME [42] с модификациями: пыльцевые зерна измельчали в предварительно замороженной (–20°C) ступке, а фенол исключали из смеси хлороформ : изоамиловый спирт : фенол.

Для синтеза кДНК проводили обратную транскрипцию мРНК с помощью обратной транскриптазы (номер по каталогу EP0442; Thermo Fisher Scientific, США) и с oligo (dT) праймерами (Евроген, Россия). Концентрацию кДНК измеряли на флуориметре Qubit 4 (Thermo Fisher Scientific, Сингапур) с использованием набора для анализа RNA BR assay (Q32850; Thermo Fisher Scientific, США). Для всех образцов концентрация кДНК доведена до 2 нг путем разбавления более высокой концентрации. ПЦР в режиме реального времени (ПЦР-РВ) проводили на ПЦР-анализаторе Applied Biosystems 7300 Real-Time PCR System (Thermo Fisher Scientific, США) с использованием набора реагентов для ПЦР в реальном времени в присутствии красителя SYBR Green и пассивного референсного красителя ROX (номер по каталогу M-435; Синтол, Россия).

Для оценки экспрессии гена GEX2 методом ПЦР были подобраны праймеры с помощью ресурса Primer-BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast) таким образом, чтобы один из праймеров располагался в месте соединения двух экзонов, что обеспечивает амплификацию только с матрицы кДНК.

В работе использовали праймеры: для гена GEX2 – TGTTTCGGTGTGGGAGGATG/TGACCCGTGAAGTGGAGAAG, для гена GCS1 – TCGGTTCAAATGGCTACAAA/TAGCAGCACCAACA-TGACGA, для гена UBCE – ACAAACCCTCTCCCTCCTGT/GGTAGATGCGACCCTCATGT.

Для каждой точки данных ПЦР выполнялась в четырех технических повторах для одной кДНК. Было проведено два или три независимых биологических эксперимента. В качестве эндогенного контроля использовали ген, кодирующий убиквитин-конъюгирующий фермент (UBCE) [43]. Относительные уровни экспрессии генов рассчитывали методом 2–ΔΔCT [44] с нормализацией к экспрессии целевого гена у линии ЗМСП (7 ДПО). Мы считали, что значения не различаются, если разница между вариантами была <1.3 раза, как предлагается в работе [45].

Секвенирование РНК

Для секвенирования кДНК выделяли РНК из пыльцы линий кукурузы ЗМС-8, ЗМСП и КМ, как описано выше. Для получения ПЦР-продуктов для последующего секвенирования генов GEX2 и HAP2/GCS1 использовали праймеры, приведенные в табл. 1.

Таблица 1.  

Праймеры для амплификации фрагментов генов GEX2 и HAP2/GCS1 для дальнейшего секвенирования

Праймеры для гена HAP2/GCS1 Праймеры для гена GEX2
GCCCGCTCGACTCTTCTT/ TGAAGGTACACGGCGGTTAG CGCAAATGGGTCTGGTTTGG/ ACTTGCAGATGTCAGCCGAA
GACACGCAAATGTGAACCAG/ TGTTACATTCGACACCGTCTG AGCTGCCTCCATGTCCATTC/ GGTTCTTCGCACACCGTTTC
GCCCGCTCGACTCTTCTT/ CTGATGTAGTTGAGGGCGTAGA GAAACGGTGTGCGAAGAACC/ TCACAGCGATGGACAAGGTC
GCACGTTAACGACACAAAG/ AACTTGTACCCTGATGTTGAACC GCTAGAAGTCCTGGAGGGGA/ ACTCGATCTGCTTGCACCAA
GCATGATCTTGAAGAACCAA/ AACTTGTACCCTGATGTTGAACC CGTTGGATACTCCCCTGCTA/ CTATTGTTTACGGCCCCAGA
AAGGAAAAGCTAATACGGCTCA/ TGTTACATTCGACACCGTCTG TTTGCCAGTTGCGATCAATA/ CCACACCGAAACAGTGTCAT
CCATGTTTTTGGAATTGGAAC/ TGTTACATTCGACACCGTCTG GTTCAGCCCTGTCGTCGT/ AGAGCCGTTGGGGTAGGAG
AAGAAATCCCCCTGTCATCA/ GGCTCACCACTACCAGCACT GGGTATTTACCCATTGCCATC/ ACGACGACAGGGCTGAAC
GGTGAGCCACAAAACCTTGG/ CATCCTTGTCTGTCGAGTTCAC TCACTTGGGTTGGGGGTTAT/ CGGTGACGTAGCTGCTGTT
ACCGGAGGCACAAGAAAG/ CCCACGGTACACCAACTTCA CTGGCTACTTCAGGGTCTCG/ GGGTCCATCTGGTTCTCTCA
TCAGAGGAGTCCAGGGAATA/ GGTGATGGTGGTCGTGGT  

Поскольку последовательности транскриптов гена HAP2/GCS1, аннотированные в базе данных GenBank (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/100274016), имели отличия в основном в начальном фрагменте, мы подобрали также пары праймеров для идентификации всех транскриптов по начальному фрагменту (табл. 1).

Для ПЦР и секвенирования региона гена PLA1, в который произошла вставка 4 пн у линии Stoсk 6, использовали праймеры ATGTTCCAGTCGCTCCACAG/ATATCGTAGGGCGCACATCT.

ПЦР-продукты экстрагировали из агарозного геля, очищали с помощью набора Cleanup Standard (Евроген, Россия) и секвенировали в компании Евроген. Сравнение нуклеотидных последовательностей транскриптов разных линий проводили с помощью программы Clustal Omega (https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/). Предварительно, с использованием программы Blast проводили выравнивание прочтений с прямых и обратных праймеров. Учитывали также качество сигнала и вероятность ошибки на хроматограмме с помощью программы Chromas (http://technelysium.com.au/wp/chromas/). Собранные транскрипты генов GEX2 линий ЗМСП и КМ (3646 пн) были представлены нами в базу данных GenBank (MN617022.2, OL649773.1 и MW195549.1).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Линия кукурузы Stock 6 дает максимальную частоту гаплоидов 3.2% [3], в то время как гаплоиндуцирующие линии саратовской селекции на основе Stock 6 дают более высокие частоты появления гаплоидов в их потомстве ≈8% (ЗМС-8) [13] и даже до 10% (ЗМСП) [40]. Наши результаты секвенирования показали, что линии-гаплоиндукторы саратовской селекции ЗМС-8 и ЗМСП имеют те же вставки четырех нуклеотидов (данные не показаны) в ген PLA1, кодирующий фосфолипазу А, что и у линии Stock 6 [19]. Однако не известно связаны ли повышенные частоты гаплоиндукции у гаплоиндуцирующих линий саратовской селекции ЗМС-8 и ЗМСП с функцией каких-либо из ранее обнаруженных генов гиногенеза. Мы исследовали экспрессию генов GEX2, HAP2/GCS1 в пыльце и неоплодотворенных завязях из неопыленных початков через семь дней после появления рылец (7 ДППР) и в завязях через 7 дней после опыления (7 ДПО) у гаплоиндуцирующей (ЗМСП) и двух негаплоиндуцирующих линий (ГПЛ-1, КМ). А также секвенировали гены GEX2, HAP2/GCS1 линий ЗМСП и КМ.

GEX2

Ген GEX2 экспрессируется в зрелой пыльце, бутонах и открытых цветках A. thaliana [28]. В пестиках его экспрессия выражена в гораздо меньшей степени, чем в пыльниках [46]. Ген GEX2 кукурузы высоко и специфично экспрессируется в спермиях, как показано с помощью секвенирования РНК [26, 27]. Однако данных об экспрессии GEX2 в других тканях кукурузы нет. В настоящем исследовании мы впервые наблюдали экспрессию гена GEX2 в завязях кукурузы до и после оплодотворения (рис. 1,а).

Рис. 1.

Экспрессия генов GEX2 (а) и HAP2/GCS1 (б) в пыльце и завязях (без опыления – 7 дней после появления рылец (7 ДППР)) и 7 дней после опыления (7 ДПО) линий ГПЛ-1, КМ и ЗМСП. ПЦР-РВ проводилась в четырех технических повторах для одного образца кДНК и в трех биологических повторах для каждого варианта. В качестве эндогенного контроля использовали ген UBCE (см. Материалы и методы). Относительные уровни экспрессии генов рассчитывали методом 2–ΔΔCT [44] с нормализацией к экспрессии целевого гена в линии ЗМСП. * Значимые различия между образцом и калибратором (завязи ЗМСП, 7 ДПО) обозначены как p ≤ 0.05.

Гаплоиндуцирующая линия ЗМСП не отличалась по экспрессии гена GEX2 в исследованных тканях (завязях до и после опыления и пыльце) от контрольной линии КМ, но демонстрировала повышенную экспрессию в неопыленных завязях (7 ДППР) и в пыльце, в сравнении с другой контрольной линией ГПЛ-1 (рис. 1,а). В целом можно отметить, что исследованные линии кукурузы отличаются по экспрессии генов GEX2, но уровень экспрессии не коррелирует со способностью линии ЗМСП к гаплоиндукции, поскольку может значительно различаться у контрольных линий (КМ, ГПЛ-1), которые не обладают способностью к гаплоиндукции.

Мы также секвенировали транскрипт гена GEX2 с целью выявления мутаций. У трех линий было обнаружено 59 однонуклеотидных замен (ОНЗ) в последовательностях гена GEX2. В частности, нуклеотидная последовательность гена GEX2 у линии ЗМСП имела делецию одного нуклеотида в положении 506 но, а также 27 и 34 ОНЗ по сравнению с B73 и КМ соответственно (не показано). У линии ЗМСП была также обнаружена вставка из девяти нуклеотидов и одна двухнуклеотидная замена по сравнению с линией B73. Следует отметить, что линии ЗМСП и КМ имели одинаковую вставку из девяти нуклеотидов в положениях 3096–3104 но по сравнению с B73 (не показано).

Мы исследовали влияние ОНЗ, делеций и вставок в гене GEX2 на аминокислотную последовательность белка GEX2 и обнаружили 15 несоответствий между аминокислотными последовательностями белков GEX2 у линий КМ и ЗМСП (рис. 2).

Рис. 2.

Фрагменты белков GEX2 у линий B73, КМ и ЗМСП с измененными аминокислотными последовательностями. Парные совпадающие аминокислоты отмечены серым цветом, а замены и делеции аминокислот отмечены белыми буквами на черном фоне. Выравнивание последовательностей белков было выполнено с помощью ClustalO (https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo).

Кроме того, в аминокислотной последовательности белка GEX2 у линии ЗМСП, по сравнению с последовательностью белка B73, обнаружено 10 аминокислотных замен и две вставки (рис. 2). Можно предположить, что изменения аминокислотной последовательности в белке GEX2 у линии ЗМСП могут влиять на его конформацию и функцию во время адгезии мембран гамет и быть связаны с индукцией гаплоидов.

Белок GEX2 необходим для прикрепления (адгезии) спермия как к яйцеклетке, так и к центральной клетке [23]. Однако рецептор для белка GEX2 спермия в мембранах яйцеклетки и центральной клетки неизвестен. Ранее было предположено, что у саратовских линий кукурузы может быть нарушена функция спермиев, которые не могут прикрепиться к мембране яйцеклетки [11].

Мы обнаружили ряд аминокислотных замен у белка GEX2 линий ЗМСП и КМ (рис. 2). Чтобы определить могут ли эти аминокислотные замены в белке GEX2 изменять его конформацию, предстоит выяснить трехмерную структуру белка GEX2 у линий кукурузы ЗМСП (гаплоиндуктор) и КМ (негаплоиндуктор).

HAP2/GCS1

Экспрессия гена HAP2/GCS1 у A. thaliana ранее считалась спермий-специфичной [21, 22]. Позже, однако, было показано, что транскрипт этого гена присутствует в завязях и плодах A. thaliana [47]. Из данных РНК-секвенирования следует, что экспрессия гена HAP2/GCS1 в зрелых пыльниках кукурузы практически отсутствует [26, 27]. Ген HAP2/GCS1 экспрессируется в пыльце кукурузы, завязях и корнях [25], а также в листьях, семенах, початках и незрелых метелках [26, 27]. Экспрессия гена HAP2/GCS1 в вегетативных тканях предполагает, что этот ген участвует не только в слиянии гамет, но, возможно, и в других процессах в тканях кукурузы.

В наших исследованиях зарегистрирована высокая экспрессия гена HAP2/GCS1 в завязях всех исследованных линий кукурузы как до, так и после оплодотворения (рис. 1,б). Экспрессия гена HAP2/GCS1 в пыльце и завязях линии ЗМСП после оплодотворения (7 ДПО) существенно не отличалась от таковой в ГПЛ-1 (7 ДПО). Однако в неопыленных завязях линии ЗМСП (7 ДППР) экспрессия гена HAP2/GCS1 была в 2.4 раза ниже, чем у ГПЛ-1 (7 ДППР). Экспрессия гена HAP2/GCS1 у линии ЗМСП в пыльце и в неопыленных завязях (7ДППР) в 5 и 4 раза соответственно ниже по сравнению с линией КМ. Однако после оплодотворения в завязях (7 ДПО) у линии ЗМСП экспрессия гена HAP2/GCS1 выше в 2.7 раза по сравнению с линией КМ (7 ДПО). Самая высокая экспрессия гена HAP2/GCS1 была зарегистрирована в неопыленных завязях линии ЗМСП (7 ДППР) и в опыленных завязях у линии КМ (7 ДПО).

Таким образом, гаплоиндуцирующая линия ЗМСП достоверно отличалась по экспрессии HAP2/GCS1 в пыльце и завязях только от одной контрольной линии КМ – в 2.7 раза больше в завязях (7 ДПО) и в 5 и 4 раза соответственно меньше в пыльце и в зявязях (7 ДПО), и не отличалась в пыльце и завязях 7 ДППР от другой контрольной линии ГПЛ-1. То есть у ЗМСП нет однозначной связи между экспрессией гена HAP2/GCS1 и индукцией гаплоидов.

В 2017 г. мы впервые секвенировали консервативную (1467 но) область гена HAP2/GCS1 линий кукурузы ЗМСП и ГПЛ-1 [25]. В базе данных GenBank в 2020 г. для гена HAP2/GCS1 кукурузы методом компьютерного прогнозирования предсказано шесть транскриптов. Было установлено, что последовательность гена HAP2/GCS1, секвенированная нами для линий КМ и ЗМСП, соответствует транскрипту NM_001320812.1 референсной линии B73, кодирующему белок NP_001307741.1 (Protein HAPLESS 2 isoform 1 precursor). У линии КМ выявлены два несовпадения нуклеотидных последовательностей в позициях 1412, 1626 но по сравнению с референсной линией B73.

Белок HAP2/GCS1 имеет домен, называемый фактором слияния мужских гамет, который является высококонсервативным и присутствует в различных семействах растений и животных [48]. Предполагается, что слияние мембран гамет цветковых растений происходит с помощью амфифильной спирали белка HAP2/GCS1 [49]. Белок HAP2/GCS1 у линии кукурузы ЗМСП имеет только одну аминокислотную замену по сравнению с линиями КМ и В73 (рис. 2).

Таким образом, установлено, что гены GEX2, HAP2/GCS1 экспрессируются не только в спермиях, но и в женских генеративных структурах кукурузы, однако гаплоиндуцирующая способность кукурузы не коррелирует с их экспрессией. Установлено, что гены GEX2 гаплоиндуцирующей линии ЗМСП и негаплоиндуцирующей линии КМ имеют 29 и 34 изменений нуклеотидных последовательностей соответственно, в том числе одинаковую вставку размером девять нуклеотидов, по сравнению с референсной линией В73. Анализ аминокислотной последовательности белка GEX2 гаплоиндуцирующей линии ЗМСП выявил 15 аминокислотных замен по сравнению с линией КМ и 10 аминокислотных замен по сравнению с референсной линией (рис. 2), что, возможно, оказывает воздействие на процесс взаимодействия мембран гамет. Для уточнения роли генов GEX2 и HAP2/GCS1 в явлении гаплоиндукции у кукурузы требуется исследование их функций в биологических экспериментах, в том числе CRISPR/Cas-редактирование этих генов, а также анализ трехмерных моделей белков GEX2 и HAP2/GCS1 из различных линий кукурузы и возможного влияния нуклеотидных и аминокислотных замен на конформацию и функцию белков.

Авторы признательны О.И. Юдаковой за прочтение рукописи и полезные замечания, а также В.В. Фадееву за помощь в оформлении рукописи и рецензенту за полезные замечания.

Работа выполнена при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (гранты № 20-016-00020а и 20-316-80020/20 мол-э), гранта Президента РФ (№ МК-4527.2022.1.4, Минобрнауки) и Программы фундаментальных исследований Государственных академий наук на 2021–2023 годы (№ 121031700141-7).

Настоящая статья не содержит каких-либо исследований с использованием в качестве объекта животных.

Настоящая статья не содержит каких-либо исследований с участием в качестве объекта людей.

Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов.

Список литературы

  1. Навашин С.Г. Избранные труды. Т. 1. М.; Л.: Изд-во АН СССР, 1951. 364 с.

  2. Dresselhaus T., Snell W.J. Fertilization: A sticky sperm protein in plants // Current Biol. 2014. V. 24. № 4. P. R164–R166. https://doi.org/10.1016/j.cub.2013.12.044

  3. Coe E.H. A line of maize with high haploid frequency // The Am. Naturalist. 1959. V. 93. № 873. P. 381–382. https://doi.org/10.1086/282098

  4. Chase S.S. Monoploid frequencies in a commercial double cross hybrid maize, and in its component single cross hybrids and inbred lines // Genetics. 1949. V. 34. № 3. P. 328–332. https://doi.org/10.1093/genetics/34.3.328

  5. Тырнов В.С., Завалишина А.Н. Индукция высокой частоты возникновения матроклинных гаплоидов кукурузы // Докл. АН СССР. 1984. Т. 276. № 3. С. 735–738.

  6. Shatskaya O.A., Zabirova E.R., Shcherbak V.S., Chumak M.V. Mass induction of maternal haploids in corn // Maize Genet. Cooperation Newsletter. 1994. V. 68. P. 51.

  7. Bylich V.G., Chalyk S.T. Existence of pollen grains with a pair of morphologically different sperm nuclei as a possible cause of the haploid-inducing capacity in ZMS line // Maize Genet. Cooperation Newsletter. 1996. V. 70. P. 33.

  8. Chalyk S., Baumann A., Daniel G., Eder J. Aneuploidy as a possible cause of haploid-induction in maize // Maize Genet. Cooperation Newsletter. 2003. V. 77. P. 29.

  9. Hu H.L., Schrag T.A., Peis R. et al. The genetic basis of haploid induction in maize identified with a novel genome-wide association method // Genetics. 2016. V. 202. № 4. P. 1267–1276. https://doi.org/10.1534/genetics.115.184234

  10. Чумаков М.И., Мазилов С.И. Генетический контроль гиногенеза у кукурузы (обзор) // Генетика. 2022. Т. 58. № 4. С. 388–397.

  11. Еналеева Н.Х., Тырнов В.С., Селиванова Л.П. Одинарное оплодотворение и проблема гаплоиндукции у кукурузы // Докл. АН СССР. 1997. Т. 353. № 3. С. 405–407.

  12. Гуторова О.В. Исследование женского гаметофита линии-гаплоиндуктора кукурузы ЗМС-П // Бюл. Ботанического сада Саратовского гос. ун-та. 2006. № 5. С. 304–307.

  13. Колесова А.Ю., Гуторова О.В. Цитоэмбриологическое исследование гаплоиндуцирующей линии кукурузы ЗМС-8 // Бюл. Ботанического сада Саратовского гос. ун-та. 2008. № 7. С. 202–205.

  14. Тырнов B.C., Еналеева Н.Х. Автономное развитие зародыша и эндосперма у кукурузы // Докл. АН СССР. 1983. Т. 272. № 3. С. 722–725.

  15. Enaleeva N.Kh., Tyrnov V.S. Cytological investigation of apomixis in AT-1 plants of corn // Maize Genet. Cooperation. Newsletter. 1997. V. 71. P. 74–75.

  16. Еналеева Н.Х., Отькало О.В., Тырнов В.С. Фенотипическое проявление мутации ig в мегагаметофите кукурузы линии Зародышевый маркер // Генетика. 1998. Т. 34. № 2. С. 259–265.

  17. Kelliher T., Starr D., Richbourg L. et al. MATRILINEAL, a sperm-specific phospholipase, triggers maize haploid induction // Nature. 2017. V. 542. № 7639. P. 105–109. https://doi.org/10.1038/nature20827

  18. Gilles L.M., Khaled A. Loss of pollen-specific phospholipase NOT LIKE DAD triggers gynogenesis in maize // EMBO J. 2017. V. 36. № 6. P. 707–717. https://doi.org/10.15252/embj.201796603

  19. Liu C., Li X., Meng D., Zhong Y. et al. A 4-bp insertion at ZmPLA1 encoding a putative phospholipase a generates haploid induction in maize // Mol. Plant. 2017. V. 10. № 3. P. 520–522. https://doi.org/10.1016/j.molp.2017.01.011

  20. Чумаков М.И. Матроклинная гаплоидия и взаимодействие гамет у кукурузы // Генетика. 2018. Т. 54. № 10. С. 1120–1124.

  21. Mori H., Kuroiwa T., Kranz E., Scholten S. GENERATIVE CELL SPECIFIC 1 is essential for angiosperm fertilization // Nat. Cell Biol. 2006. V. 8. P. 64–71. https://doi.org/10.1038/ncb1345

  22. Besser V.K., Frank A.C., Johnson M.A., Preuss D. Arabidopsis HAP2 (GCS1) is a sperm-specific gene required for pollen tube guidance and fertilization // Development. 2006. V. 133. № 23. P. 4761–4769. https://doi.org/10.1242/dev.02683

  23. Mori T., Igawa T., Tamiya G. et al. Gamete attachment requires GEX2 for successful fertilization in Arabidopsis // Current Biol. 2014. V. 24. № 2. P. 170–175. https://doi.org/10.1016/j.cub.2013.11.030

  24. Wong J.L., Leydon A.R., Johnson M.A. HAP2(GCS1)-dependent gamete fusion requires a positively charged carboxy-terminal domain // PLoS Genetics. 2010. V. 6. № 3. https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1000882

  25. Волохина И.В., Моисеева Е.М., Гусев Ю.С. и др. Анализ генов, контролирующих процесс слияния гамет, у гаплоиндуцирующей линии кукурузы ЗМС-П // Онтогенез. 2017. Т. 48. № 2. С. 134–139.

  26. Hoopes G.M., Hamilton J.P., Wood J.C. et al. An updated gene atlas for maize reveals organ-specific and stress-induced genes // The Plant J. 2019. V. 97. № 6. P. 1154–1167. https://doi.org/10.1111/tpj.14184

  27. Stelpflug S.C., Sekhon R.S., Vaillancourt B. et al. An expanded maize gene expression atlas based on RNA sequencing and its use to explore root development // The Plant Genome. 2016. V. 9. № 1. https://doi.org/10.3835/plantgenome2015.04.0025

  28. Engel M.L., Holmes-Davis R., McCormick S. Green sperm. Identification of male gamete promoters in Arabidopsis // Plant Physiol. 2005. V. 138. № 4. P. 2124–2133. https://doi.org/10.1104/pp.104.054213

  29. Ravi M., Chan S.W.L. Haploid plants produced by centromere-mediated genome elimination // Nature. 2010. V. 464. № 7288. P. 615–618.

  30. Zhang Z., Qiu F., Liu Y. et al. Chromosome elimination and in vivo haploid production induced by Stock 6-derived inducer line in maize (Zea mays L.) // Plant Cell Reports. 2008. V. 27. № 12. P. 1851–1860. https://doi.org/10.1007/s00299-008-0601-2

  31. Qiu F., Liang Y., Li Y. et al. Morphological, cellular and molecular evidences of chromosome random elimination in vivo upon haploid induction in maize // Current Plant Biol. 2014. V. 1. P. 83–90. https://doi.org/10.1016/j.cpb.2014.04.001

  32. Kelliher T., Starr D., Wang W. et al. Maternal haploids are preferentially induced by CENH3-tailswap transgenic complementation in maize // Frontiers Plant Sci. 2016. V. 7. P. 414. https://doi.org/10.3389/fpls.2016.00414

  33. Xu X., Li L., Dong X. et al. Gametophytic and zygotic selection leads to segregation distortion through in vivo induction of a maternal haploid in maize // J. Experimental Bot. 2013. V. 64. № 4. P. 1083–1096. https://doi.org/10.1093/jxb/ers393

  34. Takahashi T., Mori T., Ueda K. et al. The male gamete membrane protein DMP9/DAU2 is required for double fertilization in flowering plants // Development. 2018. V. 145. № 23. dev170076. https://doi.org/10.1242/dev.170076

  35. Cyprys P., Lindemeier M., Sprunck S. Gamete fusion is facilitated by two sperm cell-expressed DUF679 membrane proteins // Nat. Plants. 2019. V. 5. P. 253–257. https://doi.org/10.1038/s41477-019-0382-3

  36. Zhong Y., Liu C., Qi X. et al. Mutation of ZmDMP enhances haploid induction in maize // Nat. Plants. 2019. V. 5. P. 575–580. https://doi.org/10.1038/s41477-019-0443-7

  37. Conner J.A., Mookkan M., Huo H. et al. A parthenogenesis gene of apomict origin elicits embryo formation from unfertilized eggs in a sexual plant // Proc. Natl Acad. Sci. USA. 2015. V. 112. № 36. P. 11205–11210. https://doi.org/10.1073/pnas.1505856112

  38. Conner J.A., Podio M., Ozias-Akins P. Haploid embryo production in rice and maize induced by PsASGR-BBML transgenes // Plant Reproduction. 2017. V. 30. P. 41–52.

  39. Zavalishina A.N., Tyrnov V.S. Induction of matroclinal haploidy in maize in vivo // Reproductive Biol. Plant Breeding: XIII EUCARPiA Congr. 1992. P. 221–222.

  40. Гуторова О.В., Апанасова Н.В., Юдакова О.И. Создание генетически маркированных линий кукурузы с наследуемым и индуцированным типами партеногенеза // Изв. Самарского науч. центра РАН. 2016. Т. 18. № 2-2. С. 341–344.

  41. Chase S.S. Monoploids and monoploid-derivatives of maize (Zea mays L.) // The Bot. Review. 1969. V. 35. № 2. P. 117–168.

  42. Bijli K.M., Singh B.P., Sridhara S., Arora N. Isolation of total RNA from pollens // Preparative Biochem. Biotechnol. 2001. V. 31. № 2. P. 155–162. https://doi.org/10.1081/PB-100103381

  43. Manoli A., Sturaro A., Trevisan S. et al. Evaluation of candidate reference genes for qPCR in maize // J. Plant Physiol. 2012. V. 169. № 8. P. 807–815. https://doi.org/10.1016/j.jplph.2012.01.019

  44. Livak K.J., Schmittgen T.D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2‒ΔΔCT method // Methods. 2001. V. 25. № 4. P. 402–408. https://doi.org/10.1006/meth.2001.1262

  45. Weaver S., Dube S., Mir A. et al. Taking qPCR to a higher level: analysis of cnv reveals the power of high throughput qPCR to enhance quantitative resolution // Methods. 2010. V. 50. № 4. P. 271–276. https://doi.org/10.1016/j.ymeth.2010.01.003

  46. Alandete-Saez M., Ron M., Mccormick S. GEX3 expressed in the male gametophyte and in the egg cell of Arabidopsis is essential for micropylar pollen tube guidance and plays a role during early embryogenesis // Mol. Plant. 2008. V. 1. № 4. P. 586–598. https://doi.org/10.1093/mp/ssn015

  47. Borges F., Gomes G., Gardner R. et al. Comparative transcriptomics of Arabidopsis sperm cells // Plant Physiol. 2008. V. 148. № 2. P. 1168–1181. https://doi.org/10.1104/pp.108.125229

  48. Valansi C., Moi D., Leikina E. et al. Arabidopsis HAP2/GCS1 is a gamete fusion protein homologous to somatic and viral fusogens // J. Cell Biol. 2017. V. 216. P. 571–581. https://doi.org/10.1083/jcb.201610093

  49. Fedry J., Forcina J., Legrand P. et al. Evolutionary diversification of the HAP2 membrane insertion motifs to drive gamete fusion acrosseukaryotes // PLoS Biology. 2018. V. 16(8): e2006357. https://doi.org/10.1371/journal.pbio.2006357

Дополнительные материалы отсутствуют.

Инструменты

следующая статья выпуска предыдущая статья выпуска содержание выпуска

Генетика

Архивы выпусков Информация о журнале Отправить рукопись в журнал