Генетика, 2023, T. 59, № 4, стр. 425-436

Молекулярно-генетический анализ

Проведен анализ изменчивости нуклеотидных последовательностей генов COI, цитохрома b и 16S рРНК мтДНК 25 экз. C. kolymensis и 2 экз. C. cognatus Richardson, 1836. Для сравнительного молекулярно-генетического анализа использованы данные из GenBank (www.ncbi.nlm.nih.gov) по другим 12 видам рода Cottus. Виды Mesocottus haitej (Dybowski, 1869) и Trachidermus fasciatus Heckel, 1837 (подсемейство Cottinae, семейство Cottidae) использованы как внешняя группа.

Геномная ДНК выделена из мышечной ткани по стандартной методике, включающей лизис ткани 1% SDS в присутствии протеиназы К (0.2 мг/мл) и депротеинизацию фенолом [11]. Условия амплификации и секвенирования ДНК, последовательности олигонуклеотидных праймеров использованы из предшествующей работы: COI – F-33 и R-1421; цитохром b – L14795 и H15844; 16S рРНК – L2510 и H3080 [12]. Секвенирование ДНК выполнено на автоматическом секвенаторе ABI Prism 3500xL Genetic Analyzer (Applied Biosystems, США) в лаборатории генетики Института биологических проблем Севера ДВО РАН (Магадан, Россия).

Попарные генетические дистанции рассчитаны для объединенных последовательностей генов COI, цитохрома b, 16S рРНК мтДНК в программе MEGA Х [13] методом максимального правдоподобия (ML) с учетом гетерогенности скорости нуклеотидных замен (гамма-распределение G). Оптимальные модели нуклеотидных замен выбраны с использованием информационного критерия BIC (Bayesian Information Criterion) в программе MEGA Х. Филогенетический анализ выполнен методом байесовского анализа в программе MrBayes v3.2.1 [14]. Для контроля динамики байесовского анализа использована программа Tracer v1.7 [15]. Установки для анализа МСМС: 4 цепи, 1 000 000 генераций, отбор деревьев через каждые 100 генераций. Значения вероятности достигли плато в течение 10 000–15 000 генераций. Значения логарифмической вероятности увеличились с менее чем –7542,730 до примерно –4213,251 в первых 5000 генераций, затем примерно до –3678,552 после 500 000 генераций. Из 10001 дерева первые 1001 с нестабильными параметрами моделей нуклеотидных замен были отброшены, а остальные использовались для получения консенсусных деревьев и апостериорных вероятностей их ветвления. Узлы ветвления с оценками вероятности ≥95% приняты как достоверные [16]. Для определения взаимосвязей гаплотипов C. kolymensis построено UPGMA дерево с двухпараметрической моделью Кимуры и оценкой достоверности топологии в 10 000 повторных псевдослучайных выборок бутстрэп-анализа (MEGA Х); узлы ветвления с бутстрэпами ≥70% приняты как достоверные [16].

Кариологический анализ

Изучены кариотипы четырех самок, трех самцов C. kolymensis. Хромосомные препараты приготовлены из суспензии клеток переднего отдела почки рыб методом воздушного высушивания [17]. Для первичного анализа кариотипа хромосомы окрашивали 4%-ным раствором красителя Гимза (Giemsa). Хромосомные препараты исследовали под микроскопом Leica. Лучшие метафазные пластинки были сфотографированы с помощью камеры AxioCam HR CCD с программным обеспечением AXIOVISION (Carl Zeiss MicroImaging GmbH, Германия). Микроскопию и визуализацию проводили в Дальневосточном центре электронной и световой микроскопии Национального научного центра морской биологии им. А.В. Жирмунского (ННЦМБ) ДВО РАН, Владивосток.

Использовали общепринятую в цитогенетических исследованиях классификацию хромосом [18]. Равноплечие метацентрические (М) и неравноплечие субметацентрические (СМ) хромосомы относили к двуплечим, субтелоцентрические (СТ) с очень коротким вторым плечом и акроцентрические (А) с невидимым вторым плечом – к одноплечим хромосомам. Для сравнительного анализа привлечены данные о кариотипах 10 представителей рода Cottus [19–27]. Субтелоцентрики видов C. koreanus и C. hangiongensis, учитывая указанное число хромосом и число хромосомных плеч, трактуются авторами настоящей публикации как двуплечие хромосомы. Одноплечие хромосомы в кариограммах этих видов обозначены как телоцентрики (Т) [26].

Молекулярно-генетический анализ

Нуклеотидные последовательности участков генов COI, цитохрома b и 16S рРНК размещены в GenBank/NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov), их регистрационные номера указаны в табл. 1.

Обнаружены следующие показатели генетической изменчивости видов рода Cottus. Для гена COI (939 пар нуклеотидов, пн) идентифицировано 264 нуклеотидные замены и 219 полиморфных сайтов, 164 (17.5%) замены филогенетически информативные. Из 313 кодируемых аминокислотных остатков два вариабельных. Для гена цитохрома b (840 пн) идентифицировано 274 нуклеотидные замены и 227 полиморфных сайтов, 161 (19.1%) замена филогенетически информативная. Из 280 кодируемых аминокислотных остатков 21 вариабельный. Для гена 16S рРНК (612 пн) идентифицировано 58 нуклеотидных замен и 51 полиморфный сайт, 34 (5.6%) замены филогенетически информативные.

Показатели генетической изменчивости C. kolymensis следующие. Для гена COI обнаружено четыре нуклеотидных замены и четыре филогенетически информативных сайта. Для гена цитохрома b обнаружено четыре нуклеотидных замены и четыре филогенетически информативных сайта; одна замена аминокислотных остатков. Для гена 16S рРНК обнаружено две нуклеотидные замены и два филогенетически информативных сайта. У колымского подкаменщика выявлено четыре гаплотипа.

Во всех исследованных генах обнаружены мутации, маркирующие C. kolymensis и отличающие его от других видов рода Cottus: 7, 3 и 2 замены нуклеотидов для генов COI, цитохрома b и 16S рРНК. В соответствии с данными табл. 2 значения ML-дистанций между мтДНК C. kolymensis и внешней группы варьируют от 10.79% (C. kolymensis/Mesocottus haitej) до 14.27% (C. kolymensis/Trachidermus fasciatus). Между C. kolymensis и другими видами рода Cottus минимальное значение составило 4.64% (с C. czerskii), максимальное – 9.56% (с C. hangiongensis). Генетические дистанции между C. kolymensis и видами группы “Cottus poecilopus” (C. szanaga, C. poecilopus, C. volki, исключая C. koreanus) варьируют от 4.73 до 6.27%.

По данным об объединенных последовательностях мтДНК C. kolymensis реконструировано UPGMA-дерево (рис. 1), которое включает три кластера: Kol (экземпляры из озер бассейна р. Колыма), Okh1 (экземпляры из бассейна Охотского моря – р. Дукча, озер Чистое и Глухое), Okh2 (экземпляры из бассейна Охотского моря – р. Кулькуты). Все узлы ветвления поддержаны достоверными значениями бутстрэп-оценок (≥70%).

Рис. 1.

UPGMA-дерево Cottus kolymensis по данным об объединенных последовательностях генов COI, цитохрома b и 16S рРНК митохондриального генома. Числа в основаниях кластеров – бутстрэп-поддержки (в % от 10 000 реплик). В скобках приведены ваучерные номера и район сбора экземпляров вида. Okh1 и Okh2 Kol – внутривидовые группы.

По данным об объединенных последовательностях мтДНК видов рода Cottus реконструировано байесовское филогенетическое дерево (рис. 2). В основании дерева находятся ДНК видов внешней группы. Виды рода Cottus разделяются на три кластера: A (C. amblystomopsis Schmidt, 1904, C. hangiongensis Mori, 1930, C. koreanus), B (C. asper Richardson, 1836, C. dzungaricus Kottelat, 2006, C. perifretum Freyhof, Kottelat et Nolte, 2005, C. rhenanus Freyhof, Kottelat et Nolte, 2005, C. bairdii Girard, 1850, C. cognatus), C (C. volki, C. poecilopus, C. czerskii Berg, 1913, C. szanaga, C. kolymensis). Оценки апостериорной вероятности (РР ≥ 0.95) подтверждают достоверность ассоциаций типов ДНК.

Рис. 2.

Байесовское дерево видов рода Cottus по данным об объединенных последовательностях генов COI, цитохрома b и 16S рРНК митохондриального генома. Числа в основаниях кластеров – оценки апостериорной вероятности (в %). Рядом с названиями видов приведены ваучерные номера (в скобках) и номера в GenBank. А, В и С – филогенетические группы.

Кариологический анализ

На основании анализа 350 рутинно окрашенных метафазных пластинок установлены два цитотипа вида C. kolymensis.

Цитотип I – 2n = 48, NF = 58 (рис. 3,а), обнаружен у четырех (три самки, один самец) экземпляров. В него входили двуплечие хромосомы: два средних метацентрика (пара 1); четыре крупных (пары 2, 3), два средних (пара 4) и два мелких (пара 5) субметацентрика. Одноплечие хромосомы в нем представлены тридцатью субтелоцентриками (пары 6–20) и 8 акроцентриками (пары 21–24).

Рис. 3.

Метафазные пластинки и кариограммы C. kolymensis из: а – р. Дукча, 2n = 48, NF = 58; б – р. Кулькуты, 2n = = 48, NF = 56. М – мета-, СМ – субмета-, СТ – субтело-, А – акроцентрические хромосомы; цифры – порядковые номера пар хромосом в кариограмме. Масштабная линейка: 10 мм.

Цитотип II – 2n = 48, NF = 56 (рис. 3,б), выявлен у трех (два самца, одна самка) экземпляров. Он включал два средних метацентрика (пара 1), два крупных (пара 2), два средних (пара 3) и два мелких (пара 4) субметацентрика, тридцать два субтелоцентрика (пары 5–20) и восемь акроцентрических хромосом (пары 21–24).

Метацентрики (рис. 3,а, б: пара 1), субметацентрики (рис. 3,а: пары 2, 3, 4, 5; б: пары 2, 3, 4), крупные субтелоцентрики (рис. 3,а: пары 6, 7; б: пары 5, 6) и акроцентрики (рис. 3,а, б: пара 21), всегда хорошо идентифицируемые во всех метафазных пластинках, рассматриваются нами как маркерные для обоих обнаруженных цитотипов. Изменчивость по числу хромосом не установлена, различий между кариотипами самцов и самок вида по 2n и NF не выявлено.

Внутривидовая изменчивость Cottus kolymensis

В настоящей работе исследована выборка C. kolymensis, которая включает рыб из шести популяций, населяющих водоемы бассейна северной части Охотского моря и бассейна р. Колымы. Результаты молекулярно-генетического анализа свидетельствуют о генетической неоднородности вида. Наблюдаемая изменчивость обусловлена различиями между экземплярами колымского подкаменщика, выловленными как в относительно близких (озера и реки охотоморского бассейна), так и в удаленных (охотоморский и колымский бассейны) частях ареала. В нуклеотидных последовательностях генов COI, цитохрома b и 16S рРНК обнаружены замены, объединяющие C. kolymensis в три группы – колымскую Kol (озера Момонтай и Урультун, бассейн р. Колыма), охотоморскую Okh1 (озера Чистое и Глухое, р. Дукча, бассейн Охотского моря) и охотоморскую Okh2 (р. Кулькуты, бассейн Охотского моря). В одном из самых эволюционно-консервативных в митохондриальном геноме гене 16S рРНК, изменчивость которого может свидетельствовать о давней дивергенции, установлены 2 нуклеотидные замены, маркирующие группы Kol и Okh.

В целом число обнаруженных у C. kolymensis вариабельных сайтов составило 0.4, 0.5 и 0.3% для генов COI, цитохрома b и 16S рРНК соответственно. Такие значения являются очень низкими в сравнении с уровнями межвидовой дивергенции в семействе Cottidae, установленными, например, для нуклеотидных последовательностей тех же участков мтДНК видов рода Gymnocanthus (7.7, 8.4 и 11.9% для генов COI, 12S–16S рРНК и цитохрома b) [28].

Ранее на основе сравнительного анализа разных участков мтДНК были предложены пороговые значения внутривидовых и межвидовых генетических дистанций для представителей рода Cottus [29, 30]. Например, для участка гена COI таким критерием являются не более 1% различий между популяциями одного вида и 5–8% различий между видами. Полученные в настоящей работе ML-дистанции между последовательностями гена COI групп колымского подкаменщика не превышают внутривидовых различий – 0.11% (Okh1/Okh2), 0.32% (Okh1/Kol), 0.43% (Okh2/Kol). Анализ объединенных нуклеотидных последовательностей генов COI, цитохрома b, 16S рРНК также показывает невысокие различия групп C. kolymensis из разных частей ареала – 0.13% (Okh1/Okh2), 0.28% (Okh1/Kol), 0.41% (Okh2/Kol).

Топология UPGMA-дерева (рис. 1) подтверждает подразделенность колымского подкаменщика в соответствии с географической приуроченностью к определенному месту обитания, с одной стороны, и невысокий уровень генетических различий, с другой. В структуре дерева выделяются три кластера: Kol (озера Момонтай и Урультун, бассейн р. Колыма), Okh1 (озера Чистое и Глухое, р. Дукча, бассейн Охотского моря) и Okh2 (р. Кулькуты, бассейн Охотского моря).

Данные кариологического анализа подтверждают внутривидовую неоднородность C. kolymensis и разделение его на группы. Колымский подкаменщик в отличие от большинства исследованных видов, хромосомные наборы которых стабильны, обладает изменчивостью числа хромосомных плеч (рис. 3; табл. 3). Сходные различия хромосомных наборов присутствуют у экземпляров C. gobio и C. hangiongensis из разных участков ареала [20, 22, 25, 26]. В соответствии с топологией UPGMA-дерева (рис. 1) наблюдаемая изменчивость обусловлена различиями между экземплярами вида из кластеров Okh1 (р. Дукча – цитотип I) и Okh2 (цитотип II).

Цитотипы колымского подкаменщика имеют одинаковое число хромосом, сходные маркерные хромосомы. Оба цитотипа содержат четыре пары А-хромосом (рис. 3). Однако в отличие от цитотипа I (NF = 58) в цитотипе II отсутствует пара крупных субметацентриков (рис. 3,а: пары 2, 3; б: пара 2), а в ряду субтелоцентриков содержится на одну пару хромосом больше (цитотип I – 15, цитотип II – 16). Обнаруженные различия позволяют предположить, что в одной из пар крупных субметацентриков в цитотипе II произошла перицентрическая инверсия, следствием которой стало уменьшение числа хромосомных плеч (56) в этом цитотипе. Реальность такого механизма хромосомной перестройки у колымского подкаменщика подтверждают различия по NF кариотипов изученных видов рода Cottus, обусловленные именно перицентрическими инверсиями [27].

Генетический полиморфизм C. kolymensis, его дифференциация на внутривидовые группы в зависимости от мест обитания, вероятно, связаны с различными темпами и направлениями эволюционных процессов в условиях географической изоляции и экологических особенностей разных биотопов. Ранее на основе сравнительного анализа было высказано мнение, что морфологическая неоднородность видов группы “Cottus poecilopus” может быть связана с тем, что заселение исходных форм современных пресноводных подкаменщиков в реки осуществлялось в разное время и неоднократно [2]. Исходя из имеющейся информации, можно предположить, что обнаруженные генетические отличия экземпляров колымского подкаменщика из р. Дукча, озер Чистое и Глухое, р. Кулькуты и озер колымского бассейна возникли вследствие разного времени заселения в них представителей вида и, учитывая гидрологические особенности водоемов, последующей длительной географической изоляции популяций.

Дифференциация Cottus kolymensis, видов группы “Cottus poecilopus” и остальных видов рода Cottus

Среди 68 видов рода Cottus [31] только для 13 получены последовательности полных митохондриальных геномов (C. czerskii, C. volki, C. amblystomopsis, C. hangiongensis, C. dzungaricus, C. asper, C. perifretum, C. rhenanus, C. cognatus, C. koreanus, C. poecilopus, C. szanaga, C. bairdii), все они использованы в нашем исследовании для сравнительного анализа. Из-за отсутствия в GenBank последовательностей генов COI, цитохрома b, 16S рРНК C. altaicus и C. kuznetzovi, не удалось привлечь в анализ эти виды. Тем не менее полученные молекулярно-генетические данные подтверждают существование в пределах рода Cottus отдельной группы “Cottus poecilopus”, в которую входят таксоны видового ранга. Однако состав входящих в нее видов отличается от предложенного другими авторами. Судя по ML-дистанциям, к видовой группе “Cottus poecilopus” следует отнести C. czerskii и исключить из нее C. koreanus.

Группа “Cottus poecilopus” в составе C. poecilopus, С. szanaga, C. volki, C. czerskii, C. kolymensis характеризуется маркерными заменами нуклеотидов в генах цитохрома b (четыре замены) и 16S рРНК (две замены), отличающими их от других изученных видов рода Cottus. Уровень различий в пределах группы варьирует от 1.4% между С. szanaga и C. czerskii до 6.97% между C. volki и С. szanaga, а также между C. volki и C. poecilopus. Среднее значение ML-дистанций составляет 5.37% (табл. 2).

C. czerskii, которого на основе морфологических данных не относят к группе “Cottus poecilopus”, а сближают с C. hangiongensis [32], по молекулярно-генетическим данным наиболее близок к С. szanaga (1.4%) и C. poecilopus (3.86%) и значительно отличается от C. hangiongensis (9.85%). Напротив, C. koreanus на основе морфологических признаков относят к группе “Cottus poecilopus” [3], но по данным изучения контрольного региона мтДНК он наиболее близок к C. hangiongensis [8]. По нашим данным C. koreanus отличается от видов группы “Cottus poecilopus” так же, как от остальных изученных видов Cottus – в среднем на 8.62 и 8.15% соответственно. При этом значение ML-дистанции между C. koreanus и C. hangiongensis минимальное, составляет всего 6.57% (табл. 2).

Виды группы “Cottus poecilopus” значительно дифференцированы от других видов рода Cottus: ML-дистанции варьируют от 7.13% между C. czerskii и C. cognatus до 10.04% между С. szanaga и C. hangiongensis и составляют в среднем 8.1%. В сравнении со средним значением ML-дистанций в пределах группы (5.37%), с одной стороны, и со средним значением ML-дистанций между видами рода Cottus и внешней группой (11.27% с Mesocottus haitej и 14.68% с Trachidermus fasciatus), с другой стороны, такой уровень генетических отличий (8.1%) подтверждает существование в роде Cottus отдельной видовой группы “Cottus poecilopus”.

В пределах группы “Cottus poecilopus” самыми близкими видами к колымскому подкаменщику являются C. czerskii (среднее значение ML-дистанций составляет 4.67%) и C. szanaga (4.78%). Более всего C. kolymensis дифференцирован от C. volki (6.19%). C. kolymensis и виды рода Cottus, не входящие в группу “Cottus poecilopus”, отличаются гораздо больше – от 7.46% с C. perifretum до 9.51% с C. hangiongensis, среднее значение ML-дистанций составляет 8.08%.

Цитогенетическими методами род Cottus изучен крайне слабо. Кариотипированы только 10 его представителей [33] (табл. 3). Среди них C. poecilopus и C. koreanus, которые так же, как и исследованный вид C. kolymensis, входят в состав группы “Cottus poecilopus” [1]. В ходе сравнительного анализа установлено, что кариотипы C. kolymensis и других изученных видов рода, за исключением C. gobio [19], имеют одинаковое число хромосом (рис. 3, табл. 3). Объяснить возникновение отличий хромосомного набора C. gobio по 2n от кариотипов других исследованных представителей Cottus не представляется возможным из-за низкого качества представленных в работе метафазной пластинки и кариограммы. H. Ida с соавт. (1989) было высказано предположение о неверной идентификации изученных экземпляров [24]. Основные признаки хромосомных наборов C. kolymensis (цитотип I) и видов C. gobio, C. nozawae, C. pollux сходны по числу, морфологии хромосом и числу хромосомных плеч (рис. 3; табл. 3). Однако другие изученные виды подкаменщиков отличаются не только от них, но и друг от друга по количественному соотношению двуплечих (М/СМ) и одноплечих (СТ/А) хромосом и, как следствие, по числу хромосомных плеч (табл. 3). Возникновение обнаруженных различий, по мнению специалистов, объяснимо тем, что эволюция кариотипов видов рода Cottus происходила путем перицентрических инверсий [27].

Родственные связи Cottus kolymensis

На филогенетическом дереве (рис. 2) мтДНК колымского подкаменщика находится в кластере С, объединяющем виды группы “Cottus poecilopus”. В основании этого кластера расположен C. volki. Затем следует микрокластер, включающий виды (С. szanaga + C. czerskii) + C. poecilopus, к которым присоединяется C. kolymensis. Топология байесовского дерева с высокой достоверностью подтверждает существование видовой группы “Cottus poecilopus”, в состав которой входят C. poecilopus, С. szanaga, C. volki, C. czerskii, C. kolymensis. Терминальное положение кластера С предполагает недавнюю дивергенцию группы “Cottus poecilopus”. МтДНК C. koreanus, включенного ранее в эту группу видов, попадает в кластер А вместе с C. hangiongensis и C. amblystomopsis. Базальное положение кластера А предполагает раннюю дивергенцию и близость к предковой форме видов C. koreanus, C. hangiongensis и C. amblystomopsis.

Сравнительный анализ результатов настоящей работы и других молекулярно-генетических исследований видов рода Cottus показывает значительное совпадение данных. В одном из последних исследований, которое включает большинство полных митохондриальных геномов видов рода из GenBank, NJ филогенетическое дерево ([34]: Figure 2) имеет сходную топологию. У основания дерева находится линия В в составе C. hangiongensis, C. amblystomopsis, C. reinii, C. poecilopus (=C. koreanus в соответствии с номером в GenBank EU332750). Линия А1 включает виды группы “Cottus poecilopus”: близкие С. szanaga и C. czerskii, а также C. volki. Линия А2 представлена C. rhenanus, C. perifretum, C. dzungaricus. По мнению авторов, в роде Cottus виды линии В дивергировали раньше, а виды линий А1 и А2 позже.

В нашем исследовании впервые проведен анализ кариотипа C. kolymensis, который показал, что хромосомные наборы этого вида и подкаменщиков рода Cottus имеют общие признаки, указывающие на их таксономическую близость. Впервые проведен анализ изменчивости генов COI, цитохрома b и 16S рРНК мтДНК C. kolymensis, подтверждающий видовой статус колымского подкаменщика. Впервые изучены представители вида из озер бассейна р. Колымы. Выявлен комплекс кариологических и молекулярно-генетических маркерных признаков, позволяющих идентифицировать C. kolymensis. Установлены различия цитотипов экземпляров колымского подкаменщика из р. Дукча и р. Кулькуты, которые могли возникнуть вследствие разного времени заселения представителей вида в эти реки, последующей географической изоляции популяционной группировки вида из р. Кулькуты. Обнаружены генетические различия популяций C. kolymensis, населяющих водоемы бассейнов р. Колымы и северной части Охотского моря, на основании которых вид подразделяется на три группы в соответствии с местом обитания. На основе молекулярно-генетических данных подтверждено существование видовой группы “Cottus poecilopus” и принадлежность к ней вида C. kolymensis. В противоположность данным морфологических исследований мы предлагаем включить в состав группы “Cottus poecilopus” вид C. czerskii и вывести из нее вид C. koreanus.

Авторы благодарны к.б.н. Сергею Грунину (ИБПС ДВО РАН), к.б.н. Елене Хаменковой (ИБПС ДВО РАН), Виталию Поспехову (ИБПС ДВО РАН) за помощь в сборе материала.

Работа выполнена при бюджетной поддержке в рамках НИР “Фауна, систематика и экология морских и пресноводных гидробионтов Северо-Востока России” (Российская Федерация, № 0290-2019-0004), Институт биологических проблем Севера ДВО РАН, Россия.

Все применимые международные, национальные и/или институциональные принципы ухода и использования животных были соблюдены.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.