Генетика, 2023, T. 59, № 4, стр. 381-402

ГЕНЫ РЕГУЛЯТОРНЫХ нкРНК, ПЕРЕКРЫВАЮЩИЕСЯ ПО ЛОКАЛИЗАЦИИ С ГЕНАМИ КАРДИОМИОПАТИЙ

Установлено, что в пределах генов КМП локализованы гены различных регуляторных нкРНК, в том числе микроРНК, длинных некодирующих РНК (lncRNA, lncРНК), кольцевых РНК (circRNA, circРНК) (табл. 1). МикроРНК относятся к классу коротких интерферирующих РНК, размером менее 200 нуклеотидов (длиной в среднем 22 нуклеотида). Основная функция микроРНК заключается в регуляции экспрессии генов на посттранскрипционном уровне: связываясь со своими мишенями на матричной РНК (мРНК), они приводят к репрессии трансляции [23, 24]. Как правило, одна и та же микроРНК имеет сайты связывания на мРНК многих генов, а мРНК одного и того же гена, в свою очередь, способна связывать несколько различных микроРНК. Описаны также неканонические эпигенетические механизмы действия микроРНК: в ядре они могут участвовать в активации или подавлении транскрипции генов-мишеней [24]. То, что микроРНК играют критическую роль в обеспечении развития и нормального функционирования сердца, подтверждается наблюдениями, что специфичная для кардиомиоцитов делеция Dgcr8 (гена, необходимого для биогенеза микроРНК) приводит к развитию полностью пенетрантного патологического фенотипа у мыши: развивается дисфункция левого желудочка, которая прогрессирует до ДКМП и ранней летальности [25], а также многочисленными клиническими наблюдениями и экспериментальными исследованиями.

К категории lncРНК относят РНК, размер которых превышает 200 нуклеотидов, они имеют сложную и пока еще не устоявшуюся классификацию [26, 27]. В качестве самостоятельного подтипа выделяют дивергентные lncРНК, которые транскрибируются в противоположном соседним генам направлении и могут вовлекаться в регуляцию их экспрессии [28]. Среди lncРНК, гены которых перекрываются по локализации с генами КМП, выделяют, например, KCNQ1OT1 и TTN-AS1. circРНК также относят к длинным нкРНК [29], включая подтип rt-circRNA (read through-circRNA), продуцирующийся из экзонов двух соседних генов одной и той же цепи [30, 31].

Длинные нкРНК могут обладать различными функциями: в ядре участвуют в регуляции транскрипции, в цитоплазме контролируют стабильность мРНК, выступают в качестве “губки” для микроРНК и других РНК, снижая тем самым их эффекты [23, 27]. При наличии и для lncРНК, и для мРНК общих элементов распознавания на микроРНК (microRNA recognition elements – MREs), lncРНК может конкурентно связываться с микроРНК, что будет приводить к усилению экспрессии генов-мишеней микроРНК (т.е. lncРНК могут выступать в качестве конкурирующей эндогенной РНК – competitive endogenous RNA, ceRNA, ceРНК). Согласованность сети lncРНК–микроРНК–мРНК влияет на функциональное состояние клетки, органа и организма в целом, и ее разбалансировка может лежать в основе развития патологии [32–35].

Одним из механизмов продуцирования регуляторных lncРНК является альтернативный сплайсинг. Например, сложный альтернативный сплайсинг характерен для мРНК гена кардиомиопатий TTN, который происходит при участии РНК-связывающего белка-20 (кодирует ген RBM20) [20, 36]. Для TTN идентифицировано 80 экспрессирующихся circРНК, уровень которых не коррелировал с уровнем экспрессии его гена-хозяина, но эффективность продуцирования данного класса молекул зависела как от структуры гена TTN, так и от функционирования участвующего в генерации circРНК гена RBM20 [20]. Известно, что варианты в гене RBM20 могут приводить к развитию различных форм КМП – прежде всего ДКМП, а также ГКМП, аритмогенной правожелудочковой КМП (АПЖКМП), НКМЛЖ [14–16]. На основании установления связи между метилированием ДНК гена TTN-AS1 (специфичность метилирования которого наблюдали при ДКМП) и сплайсингом мРНК высказано предположение, что нарушение сплайсинга может вызывать пропуск экзонов при транскрипции TTN, особенно в той его области, которая входит в состав А-полос саркомера, что может имитировать фенотип ДКМП, наблюдаемый при наличии мутаций, приводящих к укорочению белка титина (TTNtv) [37]. В миокарде большое количество circРНК продуцируют гены MYH6 и MYH7 (в том числе circРНК, консервативные в миокарде человека, крысы и мыши), но из-за высокой гомологии между данными генами и увеличения вероятности артефактов авторы подчеркивают необходимость проведения более тщательных исследований [21].

Среди генов нкРНК, локализованных в области генов КМП, не все охарактеризованы с функциональной точки зрения. К числу наиболее изученных при КМП относятся гены микроРНК MIR1-2 и MIR133A1 (локализованы в интронах гена MIB1), MIR208A (в гене MYH6); MIR208B (в гене MYH7); MIR490 (в гене CHRM2) и MIR499A (в гене MYH7B); гены lncРНК MHRT и KCNQ1OT1, перекрываются с генами MYH7 и KCNQ1 соответственно; а также TTN-AS1 (перекрывается с геном TTN). Кодируемые данными генами нкРНК (miR-1, miR-133a, miR-208a, miR-208b, miR-490, miR-499a, MHRT, KCNQ1OT1 и TTN-AS1) экспрессируются в клетках миокарда и вовлечены в обеспечение функционирования сердца в норме и при развитии патологических процессов на разных этапах онтогенеза [38–42].

нкРНК В СЕРДЦЕ В НОРМЕ И ПРИ КАРДИОМИОПАТИЯХ

Для ряда регуляторных нкРНК, гены которых располагаются в области генов КМП, установлены онтогенетическая и возрастная динамика экспрессии и функции, а также поло- и камеро-специфичные различия по уровню данных микроРНК в сердце [43–49]. Онтогенетическая динамика экспрессии характерна для lncРНК Mhrt: ее уровень возрастает в ходе дифференцировки кардиомиоцитов по мере развития сердца у эмбриона и в постнатальном периоде с увеличением возраста [45]. miR-1 и miR-133a контролируют преимущественно ранние стадии кардиогенеза, поддерживая детерминацию специфического для сердца мышечного клона из эмбриональных стволовых клеток и мезодермальных предшественников, а miR-208 и miR-499 участвуют на поздних стадиях кардиогенеза, опосредуя дифференцировку кардиобластов в кардиомиоциты и спецификацию быстрых/медленных мышечных волокон [50]. Экспрессия miR-208b снижается в ходе развития эмбриона мыши и в сердце взрослой особи, в норме эта микроРНК не выявляется [51]. miR-208a, miR-208b и miR-499, гены которых перекрываются с генами Myh6, Myh7 и Myh7b соответственно, относятся к одному семейству микроРНК, причем miR-208b и mir-499 функционально дублируют друг друга [43].

В сердце взрослых мышей происходит совместная экспрессия miR-208a и ее гена-хозяина Myh6, а miR-208a, в свою очередь, регулирует экспрессию двух медленных миозинов и их интронных микроРНК, Myh7 и miR-208b, Myh7b и miR-499 [43], но экспрессия miR-208b может также происходить независимо от экспрессии гена-хозяина Myh7 [52]. С другой стороны, miR-208b и ее предшественник pri-miR-208b участвуют в регуляции экспрессии генов MYH6 и MYH7, в том числе посредством вовлечения в эпигенетическую регуляцию на уровне метилирования/ацетилирования ДНК [53, 54]. В частности, повышенная экспрессия pri-miR-208b способствует взаимодействию метилтрансферазы гистонов Ezh2 с межгенным двунаправленным промотором, происходит метилирование H3K27m3, что приводит к подавлению экспрессии генов, кодирующих MYH7 (α-MHC) и антисмысловой транскрипт MYH6 (AS β-MHC), вследствие чего развивается гипертрофия сердца [53]. С другой стороны, при использовании ингибиторов гистоновой деацетилазы наблюдали гиперацетилирование межгенного двунаправленного промотора (которое сопровождалось высвобождением комплекса Ezh2/pri-miR-208b) и восстановление экспрессии генов α-MHC и AS β-MHC [53]. Подавление pri-miR-208b приводит к изменению экспрессии Ezh2-регулируемых генов, среди которых – Anp, Bnp, Tgfb3, Spp1, а также AS β-MHC и α-MHC.

На модельных объектах в левом желудочке сердца установлены различия между полами по уровню экспрессии pri-miR-208b и гена Myh6 (более высокие уровни экспрессии показаны для самок при отсутствии различий по уровню метилирования CpG-сайтов промотора pri-miR-208b между полами), тогда как уровень экспрессии зрелой miR-208b, а также Mhrt и гена Myh7 у представителей разных полов был сопоставим [47]. Различия в экспрессии pri-miR-208b в сердце между полами могут быть связаны с поло-специфичными эпигенетическими процессами, происходящими на уровне РНК и ДНК. В регуляции экспрессии miR-208b участвует lncРНК Mhrt (ген-хозяин данной lncРНК – Myh7), для которой установлено специфическое для полов метилирование, что определяет характер взаимодействия считывающего метилирование белка MeCP2 на промоторе pri-miR-208b. Так как в сердце самцов lncРНК Mhrt в позиции CG18 неметилирована, MeCP2 и белковый корепрессорный комплекс (состоит из Brg1, Rest, Hdac2) взаимодействуют с промотором pri-miR-208b, что приводит к репрессии транскрипции; в сердце самок позиция CG18 метилирована и наблюдается ее обогащение MeCP2, что позволяет транскрипцию pri-miR-208b [47]. Различия по уровню экспрессии в левом желудочке сердца между полами зарегистрированы и для других микроРНК как в норме, так и при КМП (в частности, при ишемической КМП), причем спектр дифференциально экспрессирующихся микроРНК специфичен при разных функциональных состояниях (у человека различия по уровню между полами зарегистрированы в норме для 15 микроРНК, при ишемической КМП – для трех микроРНК) [55].

Для семейства miR-208 зарегистрирована также заметная камерная специфичность экспрессии: miR-208a-3p и miR-208a-5p в изобилии представлены в левых предсердиях сердца, тогда как miR-208b-3p и miR-208b-5p преимущественно выявлялись в левых желудочках (аналогичная ситуация наблюдалась и для их генов-хозяев – α-MHC (MYH6) и β-MHC (MYH7) соответственно) [46]. Камерная специфичность экспрессии зарегистрирована и для других микроРНК, в том числе и в ответ на воздействие кардиотоксичных препаратов [56].

Длинные нкРНК также модулируют экспрессию и функцию генов в развивающемся сердце, в том числе и путем вовлечения в широкий спектр эпигенетических процессов. В регионе гена Kcnq1ot1 (антисмыслового транскрипта, локализованного в импринтированном регионе гена KCNQ1, который играет важную роль в развитии и функционировании сердца) выявлено множество энхансеров, в том числе и значимых для регуляции экспрессии его гена-хозяина Kcnq1 в сердце [57]. Уровни Kcnq1ot1 обратно коррелируют с уровнем Kcnq1 во многих тканях, на основании чего высказано предположение, что экспрессия данных генов является взаимоисключающей, при этом отмечают тенденцию к более высокой экспрессии Kcnq1ot1 в эмбриональных тканях по сравнению с тканями взрослого организма [57]. Установлено также, что экспрессирующиеся продукты области Kcnq1ot1 по молекулярной структуре, количеству и сложности различаются на разных этапах онтогенеза [57]. Кроме того, по мере развития сердца в миокарде экспрессия Kcnq1ot1 переключается на двуаллельную: происходит активация материнского транскрипта Kcnq1ot1 (который короче отцовского); его активация зависит от альтернативного сайта начала транскрипции, находящегося ниже СpG-островков, что позволяет таким образом обходить метку метилирования ДНК [44].

Характер взаимодействия между Kcnq1ot1 и его геном-хозяином Kcnq1 также отличается на разных этапах онтогенеза: на ранних этапах в сердце импринтинг Kcnq1 устанавливается и поддерживается независимо от экспрессии данной lncРНК, но на более поздних стадиях развития Kcnq1ot1 участвует в модуляции уровней Kcnq1, так как отсутствие данной антисмысловой нкРНК ведет к сверхэкспрессии Kcnq1, что сопровождается аберрантной трехмерной структурой хроматина [44]. То, что Kcnq1ot1 модулирует трехмерную конформацию хроматина, отмечали и другие исследователи [58]. Являясь lncРНК, KCNQ1OT1 может вовлекаться в различные метаболические процессы, выступая в качестве конкурирующей эндогенной РНК для широкого спектра микроРНК.

Известно, что КМП являются возраст-зависимыми патологиями, регистрируются также различия в клинической картине между мужчинами и женщинами [59–61]. Кроме того, в ряде случаев имеет место специфичность поражения различных отделов сердца при разных типах КМП (например, чаще регистрируют аритмогенную кардиомиопатию правого желудочка, некомпактный миокард левого желудочка, по сравнению с поражением других отделов сердца). Описанные выше различия по уровню экспрессии нкРНК, гены которых располагаются в области генов КМП (возрастные особенности, различия между полами, камерная специфичность), представляют интерес с точки зрения объяснения особенностей клинической картины развития заболеваний миокарда. Кроме того, приведенные данные свидетельствуют о том, что регуляторные нкРНК являясь эпигенетическими маркерами вовлекаются в широкий спектр других эпигенетических процессов, имеющих важное значение для нормального функционирования сердца и развития патологических состояний.

ЭКСПРЕССИЯ нкРНК В МИОКАРДЕ И СЫВОРОТКЕ КРОВИ ПРИ КАРДИОМИОПАТИЯХ

Для нкРНК, гены которых локализуются в области генов КМП, зарегистрированы изменения экспрессии в миокарде и сыворотке крови при развитии различных КМП, а также установлена их ассоциированность с признаками, отражающими функциональное состояние сердца у человека и модельных животных (см. Приложение, составлено по [39, 46, 53, 54, 62–92 ]). Такие данные получены для микроРНК miR-1, miR-133a, miR-208a, miR-208b, miR-324, miR-490, miR-499a и lncРНК – KCNQ1OT1, MHRT и др. Различия по уровню экспрессии микроРНК регистрировали при ГКМП, ДКМП, АПЖКМП, ишемической, диабетической и других формах КМП по сравнению с контролем или с другими заболеваниями сердечно-сосудистой системы, а также между различными формами КМП.

При развитии КМП для большинства привлеченных к анализу микроРНК наблюдали разнонаправленные изменения уровня экспрессии в миокарде (сыворотке) по сравнению с непораженными тканями, за исключением miR-490 (более низкий уровень в миокарде выявлен у пациентов с ишемической и неишемической КМП), miR-499 (увеличение уровня в клетках миокарда при ДКМП и ГКМП у человека) и miR-324 (более высокие уровни в сыворотке крови при идиопатической и ишемической ДКМП) (рис. 1; приложение). Следует, однако, отметить, что число исследований miR-490, -499 и -324 при КМП относительно невелико.

Рис. 1.

Ассоциация экспрессии нкРНК в миокарде (а) и сыворотке крови (б) с кардиомиопатиями и клинически значимыми признаками у человека. * – нкРНК; up/down/no dif – увеличение/снижение/нет различий уровня нкРНК при КМП по сравнению с контролем; plus/minus – положительная/отрицательная корреляция уровня нкРНК с эндофенотипом КМП. Детали – см. приложение.

Для других микроРНК регистрировали разнонаправленные изменения уровня при развитии разных форм КМП, а также противоречивые результаты при исследовании одной и той же кардиомиопатии (рис. 1; Приложение). Так, и снижение, и увеличение уровня микроРНК по сравнению с контролем регистрировали для miR-1 при ГКМП, ДКМП, для miR-133a – при ГКМП, для miR-208a и miR-208b – при ДКМП. В некоторых случаях разнонаправленные изменения уровня микроРНК при одной и той же патологии могут быть связаны с возрастными особенностями анализируемых выборок, как, например, для miR-1 и miR-208a-5p при ДКМП у детей и взрослых [64, 72], но и для выборок взрослых индивидов также наблюдали разнонаправленные изменения уровня микроРНК при одной и той же КМП (рис. 1; Приложение).

МикроРНК miR-1 наиболее представлена в миокарде, на ее долю приходится 40% всей микроРНК [25], и она часто привлекалась к анализу при исследовании КМП. Помимо ДКМП и ГКМП от контроля отличался уровень miR-1 при КМП такоцубо (более высокий уровень в сыворотке крови) [65], а также при КМП у пациентов с хронической болезнью Шагаса (более низкий уровень в миокарде) [64]. Для miR-133a наряду с КМП, для которых зарегистрирован измененный уровень экспрессии miR-1 (за исключением КМП при хронической болезни Шагаса), отличия установлены для АПЖКМП, ишемической и воспалительной КМП (рис. 1; приложение). Интересно, что более низкий уровень miR-133a установлен не только у пациентов с АПЖКМП, в том числе у обладателей редких вариантов в генах DSP, PKP2 и JUP, но и у бессимптомных носителей данных вариантов среди членов семей, отягощенных данной патологией [84].

Несмотря на то что гены miR-1 и miR-133a имеют общий ген-хозяин (MIB1) и экспрессируются с одного транскрипта, для них регистрируются неоднозначные, а иногда и разнонаправленные изменения экспрессии при одной и той же КМП (рис. 1; Приложение). Например, в сыворотке крови у пациентов с ГКМП наблюдали повышенный уровень miR-133a и снижение уровня miR-1 (на уровне тенденции), что по мнению некоторых исследователей [66] может быть следствием их экспрессии в разных типах клеток и соответственно отражать вовлеченность в различные внутриклеточные метаболические процессы и разную функциональную значимость.

Для miR-208a и miR-208b наблюдали отклонения в уровне экспрессии в миокарде при ГКМП, ДКМП, АПЖКМП и КМП у пациентов с хронической болезнью Шагаса (рис. 1; Приложение). Также регистрировали увеличение уровня miR-499 в клетках миокарда при сердечной недостаточности и гипертрофии сердца у человека, которое было более выражено, чем для miR-208 [88].

Кроме того, различия по уровню экспрессии микроРНК установлены между образцами миокарда (реже образцами сыворотки крови) пациентов с различными формами КМП, причем различия наблюдали даже в случае однонаправленного изменения экспрессии при КМП по сравнению с контролем (приложение). Например, более низкие уровни miR-1 выявлены в миокарде пациентов и с ГКМП, и с ДКМП, но в связи с разным уровнем снижения данной микроРНК по сравнению с контрольными образцами регистрировались также значимые различия и между этими формами КМП [69]. Различия по уровню miR-324 в сыворотке крови установлены между пациентами с идиопатической и неидиопатической ДКМП, при том что для них показаны более высокие уровни данной микроРНК по сравнению со здоровыми индивидами [71].

По уровню экспрессии микроРНК в миокарде пациенты с КМП также отличались от лиц с другими заболеваниями сердечно-сосудистой системы: для miR-133 различия зарегистрированы между КМП такоцубо и инфарктом миокарда с подъемом зубца ST, между ДКМП и КМП у пациентов с хронической болезнью Шагаса и др. (приложение). Пациенты с АПЖКМП отличались по уровню экспрессии в перикардиальной жидкости miR-1-3p по сравнению с пациентами с постинфарктной желудочковой тахикардией [73]. Уровни экспрессии шести микроРНК, включая miR-133a, были информативными для дифференциации пациентов с АПЖКМП от здоровых индивидов, пациентов с другими КМП (ГКМП, ДКМП) и другими заболеваниями сердца (синдром Бругада, миокардитом), а также от здоровых членов семьи с АПЖКМП, являющихся носителями патогенных вариантов в демосомных генах [84]. Различия по уровню экспрессии в клетках миокарда установлены для miR-490-3p между пациентами с ишемической и неишемической КМП [87].

Важно подчеркнуть, что данные по изменению уровня экспрессии микроРНК в миокарде не всегда согласуются с оценками, полученными в образцах сыворотки крови даже для одних и тех же пациентов (рис. 1; табл. Приложение). Например, снижение уровня miR-1 и увеличение уровня miR-208a регистрировали в миокарде, но не в сыворотке крови [70]; уровень miR-133 в миокарде (но не в сыворотке) был предиктором комбинированной конечной точки у пациентов с ДКМП [82]. В то же время у пациентов с АПЖКМП уровень miR-133a-3p снижался в образцах и крови, и миокарда, причем даже независимо от наличия/отсутствия редких вариантов в десмосомных генах [84].

Для микроРНК установлена также ассоциированность с характером течения КМП (наличие фиброза, выживаемость, бессобытийность), ЭХО-кардиографическими параметрами, отражающими функциональное состояние сердца (рис. 1; табл. Приложение), что свидетельствует в пользу неслучайности выявленной динамики изменения уровня микроРНК при развитии КМП.

Несмотря на то что результаты исследований, выполненных на животных, не всегда соответствуют данным, полученным при обследовании человека, они существенно расширяют представления о значимости микроРНК в развитии различных КМП. Так, в дополнение к данным, полученным при обследовании человека, показано, что изменение уровня анализируемых микроРНК наблюдалось при воздействии различных провоцирующих развитие КМП стимулов, в том числе – мутаций в генах КМП (трансгенные животные); химических веществ (стрептозотоцин, фенантрен), механических (поперечное сужение аорты), стресса, параллельно с развитием патологических изменений в сердце, соответствующих различным КМП – ГКМП, АПЖКМП, диабетической КМП, а их уровень коррелировал с патофизиологическими признаками и клиническими особенностями (рис. 2; Приложение).

Рис. 2.

Уровень экспрессии нкРНК в миокарде у животных (мышь) при моделировании КМП. * – нкРНК; up/down – увеличение/снижение уровня нкРНК при КМП по сравнению с контролем. Детали – см. Приложение.

Для miR-499 на моделях животных были получены результаты, отличающиеся от таковых у человека (рис. 1 и 2; приложение). На мышиной модели (miR-499-трансгенные мыши) показано, что miR-499 индуцировала прогрессирующее увеличение сердца и сократительную дисфункцию, и с возрастом у таких особей развивалась ДКМП [88]. Однако снижение miR-499 в миокарде зарегистрировано у трансгенных мышей со специфичной для кардиомиоцитов сверхэкспрессией гена DSG2, несущего нонсенс-мутацию p.Gln558Ter, характерную для аритмогенной кардиомиопатии у человека [89], у трансгенных мышей, несущих двойную мутацию в генах ГКМП (p.Gly203Ser в TnI и p.Arg403Gln в Myh6) [63], и у мышей, страдающих диабетической КМП, с дефицитом лептиновых рецепторов [90], тогда как уровень данной микроРНК был повышен в миокарде мышей с диабетической КМП, индуцированной стрептозотоцином [67] и при Gq-опосредованной КМП [88]. Эти данные свидетельствуют о том, что направленность изменения уровня экспрессии микроРНК может не только различаться при разных типах КМП, но и зависеть от стимула (как эндогенного, так и экзогенного), вызвавшего развитие патологии.

Только на основании уровня экспрессии нкРНК нельзя сделать заключение об их участии в патогенезе болезни. Однако для рассматриваемых нкРНК была установлена вовлеченность в регуляцию экспрессии генов в миокарде. Изменение уровня miR-208a, miR-208b, miR-499 влияло на экспрессию в сердце генов, имеющих мишени для данных микроРНК (в том числе и транскрипционных факторов) [51, 88]. Так, активация miR-499 способствовала развитию сердечной недостаточности посредством прямой регуляции 67 первичных мРНК-мишеней и косвенной регуляции большого количества мРНК и белков сердца [88].

Кроме того, доказательства вовлеченности данных микроРНК в патогенез КМП получены на клиническом и молекулярно-генетическом уровнях. На животных моделях показано, что снижение уровней miR-1 и miR-133a в миокарде происходит на стадии, предшествующей ГКМП, и это предполагает их участие в раннем этапе развития болезни (рис. 2; приложение) [63]. Уровень miR-133 не только различался между пораженными и непораженными фиброзом участками сердца пациентов с ДКМП [81], но определял молекулярно-генетические преобразования при развитии данного патологического процесса. Так, на модельных животных и у пациентов с ГКМП показано, что уровень miR-133a был обратно пропорционален количеству фактора роста соединительной ткани (CTGF), выполняющего ключевую роль в процессе фиброза (на мРНК CTGF доказано наличие мишеней для miR-133a) [93]. У мышей с диабетической КМП, вызванной приемом стрептозотоцина, в миокарде наблюдали снижение уровня miR-133a, что сопровождалось увеличением мРНК коактиватора транскрипции EP300, основных маркеров фиброза (трансформирующего фактора роста-β1, фактора роста соединительной ткани, фибронектина (FN1) и COL4A1) и увеличением очагового фиброза, тогда как сверхэкспрессия сердечной miR-133a снижает уровни мРНК маркеров фиброза в сердце мыши с диабетом [76]. Однако не во всех исследованиях подтверждена связь данной микроРНК с фиброзом [82]. Кроме того, miR-133a, уровень которой изменяется в миокарде и сыворотке крови при КМП, развивающихся вследствие инфекционных процессов, в том числе и при COVID-19, коррелировал не только с морфофункциональными параметрами сердца, но и с клеточными и биохимическими маркерами воспаления [79, 83, 94].

Повышение уровня экспрессии miR-208а в миокарде было достаточно, чтобы развилась гипертрофия сердца, тогда как ингибирование данной микроРНК ослабляло индуцированную стрессом гипертрофию и ремоделирование сердца [38, 42]. Высокий уровень miR-208a не только вызывал гипертрофию миокарда и развитие аритмии, но также влиял на электрофизиологию и эхокардиографические показатели сердца [38, 42, 51]. Для miR-208а также установлена корреляция с уровнем мРНК β-MHC (Myh7), объемом миокардиального коллагена, с неблагоприятными клиническими исходами [85]. Повышенная экспрессия miR-208b в миокарде приводила у мышей к гипертрофии сердца, но подавление данной микроРНК предотвращало переход адаптивного ремоделирования в неадаптивное в мышиной модели ДКМП, связанной с нарушением работы гена Ttn (рис. 2; приложение) [54].

Для lncРНК MIHRT и KCNQ1OT1 также установлены изменения уровня экспрессии при развитии КМП (рис. 1 и 2; Приложение). В частности, зарегистрировано снижение в клетках миокарда уровня MHRT на 82.8, 72.8 и 65.9% при ГКМП, ишемической КМП и идиопатической ДКМП соответственно [39]. У пациентов с гипертонической болезнью в мононуклеарах крови наблюдали более высокий уровень MHRT, который значимо отрицательно коррелировал с индексом массы миокарда левого желудочка [95]. Несмотря на то что гены lncРНК Mhrt и микроРНК miR-208b расположены в области одного и того же гена КМП (Myh7), они оказывают разное влияние в отношении функционирования сердца: при перегрузке давлением Mhrt обладает защитным эффектом, тогда как miR-208 – неблагоприятным эффектом на сердце [39, 51, 96].

Участие в развитии гипертрофии миокарда показано для днРНК Kcnq1ot1. Kcnq1ot1 выступает в качестве эндогенной конкурирующей РНК, формируя ось Kcnq1ot1/miR-30e-5p/ADAM9: при секвестировании miR-30e-5p увеличивается экспрессия ADAM9 и происходит репрессия ангиотензин-II-индуцированного гипертрофического фенотипа в кардиомиоцитах [97].

Функциональная значимость TTN-AS1 исследовалась в основном при онкологических заболеваниях, в которых показано, что она может действовать как ceРНК, вовлекаясь в различные метаболические пути, в том числе и значимые для сердечно-сосудистой системы. В частности, TTN-AS1 выступает в качестве “губки” для miR-142-5p (которая регулирует уровень экспрессии циклинзависимой киназы 5 – CDK5) [98], для miR-573 (регулирует уровень экспрессии транскрипционного фактора E2F3) [99], для miR-376b-3p (регулирует уровень экспрессии репрессора транскрипции KLF12) [100], для miR-153-3p (регулирует уровень экспрессии фермента ZNRF2, необходимого для активации PI3K/Akt/mTOR метаболического пути) [101]. Среди этих микроРНК для miR-142 установлено изменение уровня в сыворотке крови детей с ДКМП [102], при развитии аритмогенной КМП по сравнению как с контролем, так и с другими КМП и заболеваниями сердечной мышцы [84]; у пациентов с семейной ДКМП, связанной с мутациями в гене LMNA, и у носителей данных мутаций без клинических проявлений [103]; у пациентов с тяжелым по сравнению с умеренным течением ДКМП [71]. Для miR-376b-3p установлена дифференциальная экспрессия в миокарде при КМП правого желудочка, индуцированной трикуспидальной регургитацией, по сравнению с нормальным миокардом (в данном случае установлена регуляторная ось с участием и данной микроРНК, и TTN-AS1 – TTN-AS1/hsa-miR-376b-3p/TRPM5) [101].

При КМП (в частности, при ДКМП) нарушается продуцирование circРНК из генов, патогенные мутации в которых приводят к КМП, в том числе – из генов TTN и RYR2 [20, 21]. В интронах генов, связанных с кардиомиопатиями (например, TTN, ACTC1, TPM1, JPH2, ANKRD1, DTNA, TMPO и FHL2), локализованы и другие lncРНК, которые дифференциально экспрессировались в миокарде между пациентами с ГКМП и здоровыми индивидами [22].

Таким образом, уровни микроРНК и днРНК, гены которых локализуются в области генов КМП, изменяются в миокарде и в сыворотке крови при развитии кардиомиопатий, но эти изменения не всегда воспроизводятся или даже могут носить разнонаправленный характер.

ВОЗМОЖНЫЕ ПРИЧИНЫ ПРОТИВОРЕЧИВОСТИ РЕЗУЛЬТАТОВ ОЦЕНКИ УРОВНЯ микроРНК И lncРНК В МИОКАРДЕ И СЫВОРОТКЕ КРОВИ ПРИ КАРДИОМИОПАТИЯХ

Противоречивость результатов изменения уровня микроРНК при КМП, полученных в разных исследованиях, может быть связана с различиями по полу и возрасту, стадии болезни индивидов, участвующих в исследовании, по участкам миокарда, в которых проводился молекулярный анализ, а также может быть следствием эффектов эндогенных и экзогенных средовых факторов.

На мышиной модели ГКМП (мыши c мутациями p.Gly203Ser в тропонине I (TnI-203) и p.Arg403Gln в тяжелой цепи α-миозина (MHC-403)) показано, что изменения экспрессии miR-1 и miR-133a в миокарде желудочков регистрируются еще до начала развития гипертрофии (которое для miR-1 сохраняется на всех стадиях – ранней, стабильной и конечной), тогда как снижение miR-499-5p выявлено только на конечной стадии болезни [63]. При ДКМП в верхушке сердца выявили снижение уровня ряда микроРНК (в том числе и miR-133a), тогда как в перегородке сердца между пораженными ДКМП и здоровыми сердцами различий не было выявлено [81]. Кроме того, для ряда микроРНК (miR-1, miR-133a, miR-208a, miR-324) установлены корреляции с параметрами, отражающими клинические особенности и тяжесть течения КМП (рис. 1; Приложение).

микроРНК также могут вовлекаться в разные с точки зрения патогенеза процессы, в том числе и с противоположными эффектами. Так, активация miR-499 связана как с патогенезом гипертрофии сердца посредством регуляции экспрессии генов саркомерных белков [88], так и с возможной кардиозащитной ролью через регуляцию проапоптотических генов, таких как Pdcd4 и Pasc2 [104]. Для miR-208a также показаны противоположные эффекты в отношении функционирования сердца при развитии ГКМП, посредством вовлеченности в различные молекулярные сети (см. обзор [42]). Так, miR-208a может регулировать экспрессию не только антигипертрофических, но и прогипертрофических генов (например, ген транскрипционного фактора Gata4, необходимый для развития гипертрофии сердца, ингибируется miR-208a) [51].

Экспрессионные профили нкРНК могут модифицироваться наличием сопутствующей патологии (и ее стадией) у обследованных индивидов. miR-208b рассматривают в качестве сывороточного маркера фибрилляции предсердий [105], ее уровень также повышен в миокарде у пациентов с данной патологией [69]. При этом фибрилляция предсердий может быть начальной стадией проявления кардиомиопатий (в том числе и у носителей патогенных/вероятно патогенных вариантов в генах КМП) [106], а фенотип аритмогенной КМП может встречаться при других генетически обусловленных кардиомиопатиях [107].

По сравнению с контролем наблюдали более высокие уровни экспрессии KCNQ1OT1 в сыворотке крови у пациентов с инфарктом миокарда с подъемом сегмента ST [108], у больных ишемической болезнью сердца [109], а MHRT – в мононуклеарных клетках периферической крови у пациентов с гипертонической болезнью [95]. В то же время для MHRT получены противоречивые данные об изменении ее уровня даже при одном и том же патологическом фенотипе. Так, в одном исследовании показано, что у пациентов с хронической сердечной недостаточностью уровень lncРНК MHRT был снижен в сыворотке крови, причем пациенты с низким уровнем данной lncРНК имели более неблагоприятный прогноз по выживаемости [110], в другой работе при этой же патологии зарегистрирован более высокий ее уровень в плазме крови, который положительно коррелировал с некоторыми кардиальными биомаркерами (аспартатаминотрансферазой и лактатдегидрогеназой) [111]. J. Zhang с соавт. [112] показано, что lncРНК MHRT обладает защитным эффектом для кардиомиоцитов, а концентрация MHRT в плазме может служить диагностическим биомаркером для инфаркта миокарда (ИМ), тогда как другая группа исследователей [113] отмечала, что MHRT способствовала фиброзу миокарда после ИМ через взаимодействие с miR-3185. Уровень MHRT при патологии может различаться в зависимости от стадии болезни [114].

На основании анализа дифференциально экспрессирующихся lncРНК, микроРНК, а также мРНК в миокарде при сердечной недостаточности была сформирована сеть ceРНК, состоящая из 58 узловых мРНК, 5 микроРНК, 82 lncРНК, причем KCNQ1OT1 была среди трех наиболее значимых lncРНК [115]. Таким образом, одна и та же регуляторная нкРНК может быть вовлечена в формирование различных сетей с участием ceРНК, что может быть связано с дифференцированным ответом экспрессии микроРНК и lncРНК на эндогенные и экзогенные стимулы.

ВОВЛЕЧЕННОСТЬ нкРНК В МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ПРОЦЕССЫ В КАРДИОМИОЦИТАХ И МИОКАРДЕ В КОНТЕКСТЕ СРЕДОВЫХ ВОЗДЕЙСТВИЙ

Известно, что, с одной стороны, развитие КМП может быть спровоцировано воздействием каких-то внешних (стресс, прием лекарственных препаратов) или внутренних (беременность, гипергликемия, гипертиреоидизм) факторов, с другой, – такие же факторы могут влиять на изменение паттерна экспрессии нкРНК. При этом средовые факторы по-разному влияют на изменение уровня экспрессии нкРНК, которые вовлекаются в разнообразные патофизиологические процессы (в том числе и как сеРНК) и соответственно различаются по эффектам на функцию сердца и сосудов с точки зрения вред/польза. Так, уровень miR-1, miR-133a, miR-499 чувствителен к таким факторам как глюкоза, активные формы кислорода, фенантрен, ишемическое прекондиционирование и др., что может сказываться на патофизиологических процессах, значимых для развития КМП (табл. 2).

Интересно, что измененный уровень некоторых микроРНК в образцах левого желудочка сердца не восстанавливался после нормализации уровня глюкозы в крови: в частности, сохранялся повышенный уровень miR-342-3p, -490-3p и пониженный – miR-133a и miR-1 (miR-133a участвует в процессах аутофагии и гипертрофии, miR-1 – в развитии гипертрофии) [67]. В сыворотке крови крыс маркером кардиотоксичности, обусловленной лекарствами, является уровень miR-208 [131], а блокатор β-адренорецепторов карведилол приводит к увеличению экспрессии miR-1 в сыворотке крови, что оказывает кардиопротективный эффект у пациентов с сердечной недостаточностью [119].

При этом, с одной стороны, уровень регуляторных нкРНК зависит от других эпигенетических маркеров, а с другой, – они сами вовлекаются в эпигенетические процессы на разных уровнях. Например, в культуре H9C2 кардиомиоцитов крысы снижение уровня miR-133a при воздействии фенантреном достигается за счет увеличения метилирования CpG сайтов в промоторе гена Mir133a [80]. Уровень экспрессии miR-133a-1 при развитии кардиомиопатии контролируется гистондеацетилазами: показано, что HDAC1 и HDAC2 связываются с энхансерными областями гена Mir-133a-1, и на модельных объектах путем их блокировки удалось нормализовать уровень данной микроРНК и снизить неблагоприятные эффекты развития КМП (снижалась экспрессия фактора роста соединительной ткани, уменьшался фиброз миокарда и диаметр левого предсердия, приводя к улучшению диастолической функции сердца) [78].

miR-208 и miR-499 совместно с miR-1 и miR-133 влияют на уровень гистоновых метилтрансфераз и деметилаз, регулирующих триметилирование H3K27 (H3K27me3 – эпигенетическую модификацию, значимую для регуляции репрессии транскрипции), что приводит к изменению глобального уровня H3K27me3 (включая промоторные области кардиальных факторов транскрипции) и снижению их экспрессии в фибробластах сердца [132].

Уровень микроРНК может регулироваться lncРНК. На мышиной модели гипертрофии сердца показано, что lncРНК ROR способствует гипертрофии сердца посредством взаимодействия с miR-133 [133]. Высокий потенциал связывания с miR-133 показан для circALMS1_6, и это взаимодействие определяет процессы ремоделирования сердца [21]. Эффект miR-499-5p на развитие патологического фенотипа при диабетической КМП (диастолическая дисфункция, гипертрофия сердца) зависит от lncРНК TUG1, которая напрямую взаимодействует с данной микроРНК, участвуя в развитии гипертрофии сердца [90]. Нокдаун TUG1 ослаблял гипертрофию сердца, индуцированную диабетической КМП, и диастолическую дисфункцию за счет увеличения уровня miR-499-5p [90].

В ряде исследований для микроРНК и lncРНК установлена вовлеченность в формирование различных типов тройной сети “lncРНК–микроРНК–мРНК” (и более сложных), значимых для развития патологических процессов в сердечно-сосудистой системе (см. табл. 2). Например, на фибробластах сердца показано, что при воздействии глюкозы в результате увеличения уровня Kcnq1ot1 формирование оси Kcnq1ot1/miR-214-3p/Caspase-1/TGF-β1/Smad1/Smad2 способствует активации пироптоза и прогрессированию диабетической КМП [123].

В сложные эпигенетические взаимосвязи вовлечена lncРНК MHRT. Данная lncРНК защищает от патологической гипертрофической кардиомиопатии несколькими путями [9, 134, 135]. Так, Mhrt может ингибировать гипертрофию миокарда, индуцированную транскрипционным фактором миокардин (Myocd), посредством его ацетилирования с помощью HDAC5, а миокардин способен напрямую активировать транскрипцию Mhrt посредством связывания с CarG-боксом, т.е. Mhrt и миокардин образуют петлю регуляции в процессе гипертрофии сердца [134]. Возможны и иные пути участия Mhrt в возникновении и развитии гипертрофии миокарда, например путь Mhrt/KLF4/миокардин: Mhrt способствует экспрессии KLF4 посредством прямого связывания с miR-145a-5p или ингибирования фосфорилирования транскрипционного фактора KLF4 путем образования с ним комплекса для предотвращения связывания данного транскрипционного фактора с белками ERK, тем самым происходит ингибирование экспрессии миокардина и развитие гипертрофии миокарда [135].

Кроме того, Mhrt также может противодействовать функции фактора ремоделирования хроматина Brg1 путем связывания с его хеликазным доменом, что не позволяет Brg1 распознавать свои мишени в геномной ДНК (такие как Myh6, Myh7 и др.), предотвращая аберрантную реактивацию генов в сердце плода во время стресса [39, 45]. Mhrt779 (наиболее распространенная форма Mhrt в желудочках сердца взрослых мышей) может связывать SWI/SNF-ассоциированный матричный актин-зависимый регулятор хроматина Brg1, чтобы ингибировать активацию гистоновой деацетилазы 2 (путь Mhrt779/Brg1/Hdac2/p-Akt/p-GSK3β) [129]. Предварительное кондиционирование гипертрофии физической нагрузкой повышает экспрессию днРНК Mhrt779 за счет увеличения 3-метилирования гистона 3 на промоторе а4 Mhrt779 [129]. В то же время при патологическом стрессе вследствие активации репрессорного комплекса хроматина Brg1–Hdac–Parp регистрировали ингибирование транскрипции Mhrt в сердце, и это снижение способствовало развитию КМП (восстановление Mhrt до дострессового уровня защищало сердце от гипертрофии и сердечной недостаточности) [39].

При этом в условиях стресса гормон трийодтиронин (T3) активирует промотор Mhrt в двух чувствительных к гормонам щитовидной железы элементах, расположенных в критической области, которая необходима как для активации Mhrt, так и для Brg1-зависимой репрессии Mhrt (что происходит только в условиях гетерохроматизации ДНК) [130]. T3 также способен предотвращать избыточную экспрессию Brg1, наблюдаемую в условиях после ишемии/реперфузии миокарда, посредством пути, который может повлечь за собой T3-опосредованное повышение экспрессии miR-208a [130]. Избыточная экспрессия Mir208a приводит к резкому подавлению транскрипта фактора ремоделирования хроматина Brg1, что сопровождается более чем двукратным увеличением уровня экспрессии длинной нкРНК Mhrt и почти пятикратным увеличением отношения Myh6/Myh7 [130]. Авторы процитированного исследования заключили, что реципрокное ингибирование Mhrt-Brg1 представляет собой цепь отрицательной обратной связи, критически важную для поддержания функционирования сердца.

KCNQ1OT1 также чувствительна к средовым воздействиям. Токсичность для сердца препарата против острого промиелоцитарного лейкоза триоксида мышьяка (вызывает внезапную сердечную смерть в результате синдрома удлиненного интервала QT) связана с подавлением lncРНК Kcnq1ot1 [118]. В то же время тикагрелор (препарат, используемый для профилактики атеротромботических осложнений у пациентов с острым коронарным синдромом) увеличивает экспрессию lncРНК KCNQ1OT1, что активизирует процессы, предотвращающие повреждение окисленными липопротеинами низкой плотности (ox-LDL) в гладкомышечных клетках сосудов аорты [109].

KCNQ1OT1, выступая в качестве ceРНК, вовлекается в многочисленные метаболические пути с разнонаправленными эффектами, в том числе и патогенетически значимые для функционирования сердечно-сосудистой системы. Так, на основании анализа дифференциально экспрессирующихся в моноцитах генов показана высокая степень связности KCNQ1OT1 с микроРНК при ИБС (miR-186-5p, miR-29c-3p, miR-493-5p, miR-30b-5p, miR-326, miR-543, miR-376a-3p, miR-103a-3p) [136] и при сердечной недостаточности (miR-17-5p, miR-20b-5p, miR-107, miR-125a-5p и miR-140-5p) [115]. Уровень miR-186-5p повышался в кардиомиоцитах при неишемической ДКМП, вызванной длительным употреблением этанола (алкогольной КМП), и при обработке этанолом кардиомиоцитов, при этом снижался уровень ингибитора апоптоза XIAP, что способствовало апоптозу кардиомиоцитов [137]. Уровень miR-29c снижался в миокарде при ДКМП [81] и в крови при структурных и функциональных аномалиях сердца среди женщин-носительниц мутаций в гене дистрофина (DMD) [138]. При этом как одна и та же lncРНК может вовлекаться в регуляцию разных микроРНК, так и для одной и той же микроРНК в качестве конкурирующих могут выступать разные lncРНК. Например, для miR-376-3p в качестве ceРНК может выступать не только KCNQ1OT1, но и LINC01703 и MEG3 [115].

Kcnq1ot1, выступая в качестве губки для miR-466k и miR-466i-5p, обусловливает увеличение экспрессии транскрипционного фактора Tead1, тем самым вызывая повреждение кардиомиоцитов в процессе острого инфаркта миокарда [128], связываясь с miR-204-5p усугубляет ишемическо-реперфузионное повреждение миокарда у мышей за счет увеличения экспрессии LGALS3 [139], а с miR-223-3p – вовлекается в патогенез мерцательной аритмии [140], ослабляет гипертрофию сердца за счет модуляции оси miR-2054/AKT3 [141]. In vivo и in vitro показано, что ось KCNQ1OT1/miR-26a-5p/ ATG12 регулирует аутофагию и апоптоз кардиомиоцитов [142].

Уровень Kcnq1ot1 в митохондриях кардиомиоцитов значительно снижен по сравнению с контролем у пациентов с сахарным диабетом (СД) 2-го типа и 25-недельных мышей Db/Db (в данном случае была задействована метаболическая ось Kcnq1ot1/miR-378a/mt-ATP6/ATP) [122]. В то же время повышенный уровень экспрессии KCNQ1OT1 регистрировали в кардиомиоцитах человека, обработанных высокими концентрациями глюкозы, что приводило к увеличению уровня PDCD4 и снижению – miR-181a-5p (т.е. задействована ось KCNQ1OT1/miR-181a-5p/PDCD4) [92]. На мышиных моделях СД показано, что сайленсинг Kcnq1ot1 ингибировал апоптоз кардиомиоцитов у мышей с диабетической КМП, индуцированной стрептозотоцином, путем регуляции метаболической цепочки с участием miR-181a-5p/PDCD4 [92]. Однако 6-гингерол (растительное вещество, которое содержится преимущественно в корневище имбиря) препятствовал экспрессии KCNQ1OT1, и кардиомиоциты были защищены от повреждения, вызванного гипоксией через пути KCNQ1OT1/miR-340-5p/PI3K/AKT [126].

Длинная нкРНК KCNQ1OT1, выступающая в качестве губки miR-7-5p (имеет мишени на мРНК генов METTL14 и TFRC), подвергается модификации m6A при участии N6-метилтрансферазного комплекса (включает METTL14), при этом ассоциация KCNQ1OT1 с РНК-связывающим белком IGF2BP1 повышает стабильность данной lncРНК и надежность ингибирования активности miR-7-5p [120]. Эта ось – METTL14/ KCNQ1OT1/miR-7-5p/METTL14/TFRC, имеющая петлю положительной обратной связи, значима для регуляции ферроптоза в кардиомиоцитах желудочков новорожденных крыс [120].

Вовлеченность в эпигенетические процессы установлена и для других lncРНК. Так, уровни РНК-деметилазы FTO и Mhrt снижены в миокарде мышей с сердечной недостаточностью, при этом наблюдалось увеличение общего уровня метиладенозина N6 (m6A) и уровня m6A Mhrt, тогда как сверхэкспрессия FTO приводит к повышению уровня Mhrt и снижению m6A Mhrt в обработанных гипоксией/реоксигенацией клетках миокарда [143].

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, эффекты регуляторных нкРНК, в том числе тех, чьи гены перекрываются по локализации с генами КМП, проявляются в результате сложных взаимодействий как между собой [21, 43, 47, 130], так и с другими РНК (lncРНК, микроРНК, circРНК, мРНК) и белковыми молекулами, в том числе и задействованными в эпигенетической регуляции на уровне модификации гистонов и ремоделирования хроматина [21, 47, 53, 90, 130, 132]. Нарушения в таких взаимодействиях могут определять функциональное состояние сердца и риск развития патологий. При этом экспрессия регуляторных нкРНК – это динамический процесс, специфичный для клеток и тканей на разных стадиях онтогенеза, чувствительный к эндогенным преобразованиям организма и экзогенным воздействиям.

микроРНК и lncРНК, рассмотренными в настоящей статье, не исчерпывается перечень тех регуляторных элементов, гены которых перекрываются с генами КМП. В связи с этим следует ожидать расширение спектра как генов нкРНК и кодируемых ими регуляторных элементов, так и патофизиологических процессов, участие в которых может быть значимым для формирования риска развития и определения характера течения КМП. Для моногенных форм КМП данные нкРНК могут выступать в качестве факторов, способствующих пенетрантности патогенных вариантов. Кроме того, в патологические процессы могут быть вовлечены также нкРНК, локализованные в других регионах генома.

Работа выполнена в рамках Государственного задания Министерства науки и высшего образования № 122020300041-7.

Настоящая статья не содержит каких-либо исследований с использованием в качестве объекта животных.

Настоящая статья не содержит каких-либо исследований с участием в качестве объекта людей.

Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов.