1. На главную
  2. Электронные версии
  3. Вопросы ихтиологии
  4. T. 59, № 3, 2019

Вопросы ихтиологии, 2019, T. 59, № 3, стр. 364-368

Влияние тиомочевины и голодания на физиолого-биохимическое состояние и репродуктивную систему анабаса Anabas testudineus

Е. Д. Павлов 1, *, Е. В. Ганжа 1, Д. С. Павлов 1

1 Институт проблем экологии и эволюции РАН – ИПЭЭ РАН
Москва, Россия

* E-mail: p-a-v@nxt.ru

Поступила в редакцию 24.09.2018
После доработки 24.09.2018
Принята к публикации 11.10.2018

Полный текст (PDF)

Аннотация

Изучено воздействие тиомочевины (содержание рыб в течение 32 сут. в 0.05%-ном растворе) и голодания (в течение 12 сут.) на физиолого-биохимическое состояние и репродуктивную систему половозрелых самцов анабаса Anabas testudineus. Установлено, что сочетание действия этих двух факторов приводит к снижению уровня половых стероидных гормонов (тестостерона и эстрадиола-17β) в крови, изменениям в синтезе тироксина, его переходе в трийодтиронин и к ускорению сперматогенеза.

Ключевые слова: анабас Anabas testudineus, самцы, тиомочевина, тиреоидные гормоны, половые стероидные гормоны, голодание.

Одними из гормонов-регуляторов миграционной активности у рыб являются тиреоидные гормоны (Woodhead, 1975; Høgåsen, Prunet, 1997; Павлов и др., 2014). Присутствующие в воде химические вещества могут оказывать влияние на синтез этих гормонов. Одним из таких реагентов является тиомочевина (ТМ). Показано, что выдерживание кефали Chelon saliens в 0.05%-ном растворе ТМ до 20 сут. катализирует синтез щитовидной железой тиреоидных гормонов, а при более длительном воздействии, напротив, подавляет их синтез (Моисеева, 1989).

Ранее мы провели работу по оценке влияния ТМ той же концентрации на миграционное поведение анабаса Anabas testudineus (Павлов и др., 2018). Установлено, что содержание опытных рыб в растворе ТМ в течение 20 сут. стимулирует их двигаться преимущественно вверх против течения. Последующее голодание анабаса в течение 12 сут., которое применялось в качестве катализатора миграционной активности рыб (Pavlov et al., 2010; Павлов и др., 2010), нивелирует различия в миграционном поведении между рыбами, продолжающими находиться в растворе ТМ (опыт), и особями, которых содержали в чистой воде (контроль). В упомянутой работе влияние ТМ на физиолого-биохимическое состояние рыб рассмотрено не было. В то же время воздействие ТМ на поведение рыб происходит опосредованно путём изменения гормональной регуляции в организме. Изучение уровня гормонов и оценка состояния репродуктивной системы дают возможность определить внутреннюю реакцию организма рыб на воздействие ТМ.

Цель настоящей работы − выяснить цитологическое состояние гонад и уровень тиреоидных и половых стероидных гормонов у анабаса по завершении указанного выше эксперимента (после содержания рыб в течение 32 сут. в растворе тиомочевины и 12-суточного голодания).

МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА

Материал собран в феврале–марте 2014 г. в Приморском отделении Российско-вьетнамского тропического научно-исследовательского и технологического центра (СРВ, провинция Кханьхоа, г. Нячанг). Объект исследования – половозрелые самцы анабаса (средняя длина 8.1 см, масса 12.7 г), приобретённые на рынке близ г. Камрань.

Рыб содержали в двух круглых бетонных бассейнах диаметром 1.9 м при уровне воды около 0.2 м (по 100 экз. в каждом бассейне). Температура воды составляла 27–30°C. В бассейн с опытными рыбами добавляли тиомочевину CS(NH2)2, концентрация полученного раствора составляла 0.05% действующего вещества. Кристаллы тиомочевины предварительно растворяли в 10 л воды. Смену воды в бассейнах и последующее добавление ТМ осуществляли один раз в неделю. Рыбы во втором бассейне находились в чистой воде и служили в качестве контроля. В течение 20 сут. анабаса кормили ежедневно сухим гранулированным кормом Humpy Head (“Yi Hu Fish Farm Traiding”, Сингапур) с диаметром гранул 1–3 мм из расчёта 15% средней массы особи (корм давали в избытке). Затем в течение 12 сут. рыб обеих групп содержали без кормления. В конце эксперимента (после 12 сут. голодания ‒ на 32-е сут. влияния ТМ на опытных рыб) у рыб опытной (44 экз.) и контрольной (36 экз.) групп взяли пробы крови и фрагменты гонад.

Кровь отбирали из хвостовой вены рыб при помощи шприца объёмом 1 мл3 и центрифугировали в течение 5 мин при скорости 5000 об/мин. Полученную плазму переливали в стерильные пробирки и хранили в морозильной камере при температуре от –30 до –20°С. Методом иммуноферментного анализа с использованием тест-наборов (“DRG”, ФРГ) у каждой особи определяли концентрацию тироксина (Т4), трийодтиронина (Т3), тестостерона и эстрадиола-17β. Каждая проба была исследована на содержание этих гормонов в трёх повторностях. Рассчитывали отношение тиреоидных гормонов (Т4/Т3) для установления зависимой динамики их содержания в крови, поскольку известно, что за счёт процесса дейодирования Т4 расщепляется до Т3 (Cyr, Eales, 1996; Hulbert, 2000).

Фрагменты генеративной ткани для оценки цитологического состояния половых желёз фиксировали в жидкости Буэна. Гистологические препараты изготавливали по стандартным методикам (Ромейс, 1953; Павлов и др., 2014). Фотографии срезов половых желёз получены при помощи моторизованного микроскопа Keyence Biorevo BZ-9000 (Япония). Оценивали цитологическое состояние половых желёз, определяли стадию их зрелости (Макеева, 1992). Скорость сперматогенеза оценивали по отношению занимаемой площади созревшими клетками (сперматозоидами) к общей площади среза генеративной ткани, захваченной объективом микроскопа. Расчёт числа клеток на срезе семенника проводили при помощи программного обеспечения ImageJ ver. 1.51k.

Статистическая обработка материала выполнена по индивидуальным показателям с использованием дисперсионного анализа, критерия Стьюдента для долей, а также t-критерия Стьюдента и U-критерия Манна−Уитни.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Половые железы. Как у опытных, так и у контрольных рыб выделены III, IV и переходная IV–V стадия зрелости гонад. В опытной группе обнаружены особи с гонадами V стадии зрелости (табл. 1). В пределах стадии зрелости цитологические различия между рыбами сравниваемых групп не выявлены.

Таблица 1.  

Соотношение особей анабаса Anabas testudineus с гонадами разных стадий зрелости в опытной (32 сут. в 0.05%-ном растворе тиомочевины) и контрольной (чистая вода) группах, %

Группа Стадия зрелости гонад
III IV IV–V V
Опыт 50.0 17.5 – 32.5
Контроль 86.0 3.0 11.0 –

В семенниках III стадии зрелости присутствуют сперматоциты I и II порядка, сперматиды, сперматозоиды. Преобладают сперматоциты I и II порядков. Сперматоциты II порядка примерно в 1.5 раза меньше сперматоцитов I порядка. Клетки раннего состояния – сперматогонии – единичны (рисунок, а). Появляются цисты со сперматидами. Сперматозоиды немногочисленны, интенсивнее окрашены, чем другие типы клеток, лежат в генеративной ткани компактно, имеют жгутик.

Для гонад IV стадии зрелости характерно наличие тех же типов клеток, но в другом количественном соотношении: возрастает число сперматозоидов в просветах семенных канальцев, увеличивающихся в размерах; снижается число клеток раннего состояния – сперматоцитов и сперматид (рисунок, б).

В половых железах IV–V стадии зрелости генеративная ткань преимущественно заполнена достигшими максимальных размеров семенными канальцами со сперматозоидами. В периферической части канальцев локализованы немногочисленные клетки более раннего состояния – сперматоциты и сперматиды (рисунок, в).

На гистологических срезах гонад, находящихся на V стадии зрелости, семенные канальцы целиком заполнены сперматозоидами (рисунок, г). Во многих половых железах на этой стадии зрелости присутствуют клетки ранней генерации – сперматогонии (рисунок, д). По всей видимости, это клетки, относящиеся к следующей порции половых продуктов. В некоторых гонадах сперматогонии многочисленны, что, по всей видимости, на фоне небольшой гипертрофии соединительной ткани приводит к хаотичному расположению семенных канальцев разного размера и формы, содержащих сперматозоиды (рисунок, е).

Доля особей с гонадами той или иной стадии зрелости различалась (p < 0.05 по критерию Стьюдента для долей) в опыте и контроле (табл. 1). У многих рыб опытной группы скорость сперматогенеза была выше, чем у особей из контрольной. У опытных особей в семенниках III, IV и IV–V стадий зрелости сперматозоиды занимают бóльшую площадь среза (p < 0.001 по t-критерию Стьюдента), чем в гонадах контрольных рыб, – 44.4 ± 0.02 (22.2–72.2) против 26.2 ± 0.017 (11.9–52.1)%.

Тиреоидные и половые стероидные гормоны. По данным однофакторного дисперсионного анализа, концентрация всех исследованных гормонов в крови анабаса и показатель отношения T4 к T3 связаны (р < 0.001) с принадлежностью особей к опытной или контрольной группе. У опытных рыб по сравнению с контрольными выше уровень тироксина в крови и значение T4/T3 на фоне более низкой концентрации тестостерона и эстрадиола-17β (табл. 2). Концентрация T3 у рыб из двух групп практически не различается.

Таблица 2.  

Уровень тиреоидных и половых стероидных гормонов у особей анабаса Anabas testudineus опытной (32 сут. в 0.05%-ном растворе тиомочевины) и контрольной (чистая вода) групп на 12-е сут. голодания

Показатель Опыт
(44 экз.) 		Контроль
(36 экз.) 		U-критерий Манна−Уитни, p
Трийодтиронин (T3), нг/мл $\frac{{1.6 \pm 0.06}}{{0.3{\kern 1pt} --{\kern 1pt} 2.4}}$ $\frac{{1.8 \pm 0.08}}{{0.3{\kern 1pt} --{\kern 1pt} 2.8}}$ >0.05
Тироксин (T4), нг/мл $\frac{{19.3 \pm 0.81}}{{10.2{\kern 1pt} --{\kern 1pt} 35.4}}$ $\frac{{17.7 \pm 1.05}}{{8.8{\kern 1pt} --{\kern 1pt} 47.0}}$ <0.01
T4/T3 $\frac{{28.9 \pm 7.51}}{{5.1{\kern 1pt} --{\kern 1pt} 270.0}}$ $\frac{{11.2 \pm 0.75}}{{4.0{\kern 1pt} --{\kern 1pt} 26.0}}$ <0.05
Тестостерон, нг/мл $\frac{{9.4 \pm 0.90}}{{1.9{\kern 1pt} --{\kern 1pt} 27.3}}$ $\frac{{17.2 \pm 0.22}}{{13.7{\kern 1pt} --{\kern 1pt} 20.8}}$ <0.001
Эстрадиол-17β, пг/мл $\frac{{104 \pm 8.2}}{{41{\kern 1pt} --{\kern 1pt} 318}}$ $\frac{{248 \pm 56.2}}{{64{\kern 1pt} --{\kern 1pt} 2060}}$ <0.01

Примечание. Над чертой – среднее значение показателя и его ошибка, под чертой – пределы варьирования показателя.

ОБСУЖДЕНИЕ

Результаты исследования показали, что содержание анабаса в растворе ТМ в течение 32 сут. в значительной степени модифицирует репродуктивную систему у самцов – ускоряет сперматогенез и изменяет концентрацию половых стероидных гормонов. Об этом свидетельствуют как присутствие в опытной группе особей с гонадами V стадии зрелости, так и бóльшая площадь гистологического среза, занимаемая сперматозоидами на III и IV стадиях зрелости гонад. Уровень половых стероидных гормонов зависит от степени созревания половых желёз. При достижении гонадами поздних стадий зрелости нет необходимости сохранять высокую концентрацию этих гормонов в организме (Sisneros et al., 2004). Поэтому концентрация половых стероидных гормонов в крови опытных рыб снижается по сравнению с контрольными особями в среднем примерно в два раза. При содержании анабаса в растворе тиомочевины (32 сут.) и сопряжённом с ним продолжительном голодании (12 сут.) у опытных рыб по сравнению с контрольными повышается уровень Т4 в крови, а концентрация Т3 не изменяется.

Семенники анабаса Anabas testudineus разных стадий зрелости: а – III, б – IV, в – IV–V; г – е – V (г – семенные канальцы заполнены сперматозоидами, д – сперматогонии (→) в периферической части семенных канальцев со сперматозоидами, е – семенные канальцы разного размера и формы среди сперматогониев (→) и разросшейся соединительной ткани); 1 – сперматоциты I порядка, 2 – сперматоциты II порядка, 3 – сперматиды, 4 – сперматозоиды. Масштаб: 100 мкм.

Т3 является гормоном-индикатором изменения миграционной активности рыб (Павлов и др., 2014). Отсутствие различий по этому гормону в данном исследовании подтверждает выявленное ранее (Павлов и др., 2018) в конце опыта сходное миграционное поведение у рыб, помещённых в раствор тиомочевины, и особей, содержащихся в чистой воде. В целом отсутствие значимых отличий в поведении указывает либо на изменение направленности действия ТМ к 32-м сут., либо на значительное влияние фактора голодания на миграционное поведение опытных рыб.

Повышение концентрации Т4 у рыб, содержащихся 32 сут. в растворе ТМ, не оказывает значимого влияния на их миграционную активность: как отмечено выше, она не различается между исследованными группами (Павлов и др., 2018). Изменение уровня этого гормона, по-видимому, связано либо с воздействием ТМ, либо с голоданием особей.

Различия по величине Т4 и показателю T4/T3 между особями опытной и контрольной групп могут быть обусловлены и разной реакцией рыб на продолжительное голодание. По нашим наблюдениям (Павлов и др., 2018), через несколько суток после пересадки в раствор ТМ рыбы потребляли заметно меньше корма по сравнению с особями, содержащимися в чистой воде. Вероятно, влияние ТМ привело к изменению реакции рыб на последующее голодание и выразилось также в более раннем увеличении доли скатывающихся особей по сравнению с контрольной группой (Павлов и др., 2018). Кроме того, следует отметить, что уровень Т4 выше у рыб с интенсивно протекающим гаметогенезом (Павлов и др., 2014), поэтому рост концентрации этого гормона у рыб, содержащихся в ТМ, может быть связан с тем, что у них быстрее идёт созревание половых желёз.

Таким образом, сочетание действия тиомочевины и голодания модифицирует как функционирование тиреоидной оси у анабаса, так и работу его репродуктивной системы. Изменение уровня Т4 у рыб, содержащихся в растворе тиомочевины, вероятно, носит временный характер и при нивелировании её действия установится на прежнем уровне. Реакция репродуктивной системы на воздействие тиомочевины более выраженна – заметно ускоряется сперматогенез.

БЛАГОДАРНОСТИ

Авторы благодарны сотрудникам Приморского отделения Российско-вьетнамского тропического научно-исследовательского и технологического центра за помощь при сборе материала; М.М. Шаровой (ИПЭЭ РАН) – за участие в обработке материала; А.О. Касумяну (МГУ) – за ценные замечания по тексту рукописи.

ФИНАНСИРОВАНИЕ РАБОТЫ

Работа выполнена при финансовой поддержке программы фундаментальных исследований президиума РАН “Биоразнообразие природных систем и биологические ресурсы России”.

Список литературы

  1. Макеева А.П. 1992. Эмбриология рыб. М.: Изд-во МГУ, 216 с.

  2. Моисеева Е.Б. 1989. Дифференцировка тиреотропных клеток и гипофизарно-тиреоидные отношения у молоди кефали Liza saliens // Биология моря. № 1. С. 32‒39.

  3. Павлов Д.С., Костин В.В., Пономарева В.Ю. 2010. Поведенческая дифференциация сеголеток черноморской кумжи Salmo trutta labrax: реореакция в год, предшествующий смолтификации // Вопр. ихтиологии. Т. 50. № 2. С. 251–261.

  4. Павлов Д.С., Павлов Е.Д., Ганжа Е.В. и др. 2014. Цитологическое состояние гонад и уровень тиреоидных и половых стероидных гормонов у двух фенотипических форм молоди черноморской кумжи Salmo trutta labrax // Там же. Т. 54. № 4. С. 470–478.

  5. Павлов Е.Д., Павлов Д.С., Ганжа Е.В. и др. 2018. Влияние тиомочевины на поведение анабаса Anabas testudineus в потоке воды // Там же. Т. 58. № 5. С. 584–588.

  6. Ромейс Б. 1953. Микроскопическая техника. М.: Изд-во иностр. лит-ры, 719 с.

  7. Cyr D.G., Eales J.G. 1996. Interrelationships between thyroidal and reproductive endocrine systems in fish // Rev. Fish Biol. Fish. V. 6. P. 165–200.

  8. Høgåsen H.R., Prunet P. 1997. Plasma levels of thyroxine, prolactin, and cortisol in migrating and resident wild Arctic charr, Salvelinus alpinus // Can. J. Fish. Aquat. Sci. V. 54. P. 2947–2954.

  9. Hulbert A.J. 2000. Thyroid hormones and their effects a new perspective // Biol. Rev. V. 75. P. 519–631.

  10. Pavlov D.S., Kostin V.V., Zvezdin A.O., Ponomareva V.Yu. 2010. On methods of determination of the rheoreaction type in fish // J. Ichthyol. V. 50. № 11. P. 977–984.

  11. Sisneros J.A., Forlano P.M., Knapp R., Bassa A.H. 2004. Seasonal variation of steroid hormone levels in an intertidal-nesting fish, the vocal plainfin midshipman // Gen. Comp. Endocrinol. V. 136. P. 101–116.

  12. Woodhead A.D. 1975. Endocrine physiology of fish migration // Oceanogr. Mar. Biol. Ann. Rev. V. 13. P. 287–382.

Дополнительные материалы отсутствуют.

Инструменты

следующая статья выпуска предыдущая статья выпуска содержание выпуска

Вопросы ихтиологии

Архивы выпусков Информация о журнале Отправить рукопись в журнал