Вопросы ихтиологии, 2020, T. 60, № 1, стр. 82-93

МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА

Зрелые преднерестовые производители мойвы получены 16–21.03.2009 г. из уловов кошелькового невода на борту сейнера MS “Libas” во время промысла мойвы к северу от м. Нордкапп (72°08′ с.ш. 26°15′ в.д.). Производителей отбирали немедленно после поступления на борт. Самцов и самок определяли по внешним половым признакам и размещали отдельно в резервуарах (1 × 1 × 1 м) с постоянным протоком свежей морской воды (~100 л/мин) и непрерывной интенсивной аэрацией. Все использованные самки были разделены на четыре группы: две возрастные группы были разделены по размеру относительно среднего ещё на две группы – на мелкие и крупные (табл. 1). После сцеживания половых продуктов измеряли полную длину (TL) и массу рыб; для определения возраста извлекали отолиты.

Икру осеменяли “сухим” способом; через 10−15 мин её тщательно промывали сначала чистой, потом стерилизованной морской водой. Икру инкубировали в стандартных (128 × 86 мм) культуральных 24-луночных планшетах Nunc (“Thermo Fisher Scientific”, Дания) с рабочим и общим объёмом лунки 1 и 2 мл каждая. В лунку планшета помещали по одной икринке и в одну из них − две. Таким образом, в каждом планшете инкубировали по 25 яиц. Икру каждой пары производителей инкубировали в двух планшетах (всего 50 яиц) при температуре 5 и 8°С (± 0.1°C), размещённых в двух охлаждающих инкубаторах Termaks KB8182 (“Termaks”, Норвегия). После прибытия судна в порт развивающуюся икру доставили в Институт морских исследований (г. Берген), где инкубацию продолжили в двух термостатированных комнатах, настроенных на соответствующую условиям эксперимента температуру − 5 и 8°С (± 0.1–0.3°C). Полную замену стерилизованной морской воды проводили каждые 2 сут Всего в эксперименте индивидуально отслежено развитие 3850 яиц мойвы, полученных от 77 пар и размещённых в 154 планшетах.

Весь использованный в экспериментах живой эмбриологический материал непрерывно обследовали. За период проведения исследований каждое яйцо прошло от пяти до семи индивидуальных инспекций; каждый цикл занимал от 1 до 4 сут Результаты наблюдений заносили в специальные протоколы, по которым для каждого яйца можно определить номер самки, время оплодотворения, номер планшета и расположение лунки. При каждом просмотре в протокол вносили все данные о состоянии эмбриона, стадию его развития, морфологическое состояние, наличие и тип отклонений. Период времени от осеменения до начала регулярных наблюдений (начало 1-й инспекции) составил для разных групп яиц от 4 до 5 сут

При выделении этапов развития и описании зарегистрированных отклонений использованы понятия и терминология по Болларду (Ballard, 1973а, 1973б, 1981). Каждое отклонение определённого типа, сформированное у конкретной особи, учитывали только один раз и только в категории, соответствующей его первой регистрации, т.е., если у особи было не одно отклонение, учитывали только отклонение, зарегистрированное первым. Особей с высокой степенью резорбции запаса желтка и готовых к переходу на внешнее питание, но погибших до завершения опытов при учёте смертности в эксперименте не учитывали, так как их гибель, по нашему мнению, была обусловлена несоответствием условий существования в чрезвычайно ограниченном объёме лунки планшета потребностям эмбрионов на достигнутых стадиях развития.

Достоверность различий в частоте формирующихся отклонений и смертности при инкубации при разной температуре, а также в потомстве от самок разных размерных и возрастных групп оценивали на основании коэффициента угловой трансформации (φ – преобразования Фишера) – аналога t-критерия Стьюдента (Лакин, 1990).

РЕЗУЛЬТАТЫ

Использованные в работе производители относились к двум возрастным группам − 3 и 4 года. Самки были мельче самцов (13.0–19.5 против 16.0–19.5 см), 3-летние самки − меньше 4-летних (табл. 1).

Продолжительность эмбрионального периода развития под оболочкой при температуре 5°С варьировала в пределах 30−36 (в среднем 34) сут, а при 8°C − 22−25 (24) сут

При инкубации мойвы наблюдали возникновение аномалий развития, которые мы разделили на десять типов. Каждое нарушение развития было связано с определённым этапом онтогенеза и соответствующим ему комплексом морфогенетических движений и других процессов, что в большинстве случаев определяло характер этих отклонений и хронологию их появления и регистрации.

1. Нарушение оплодотворения и дробления. К этой группе отнесены яйца либо не приступавшие к развитию, либо погибшие на этапе дробления. Вследствие проведения 1-й инспекции спустя 4−5 сут после осеменения нарушения этого типа были выявлены после гибели яиц по остаточным морфологическим признакам. Для них было характерно полное отсутствие признаков дробления цитоплазматического диска или наличие в перивителлиновом пространстве остатков относительно крупных бластомеров, фрагментов диска дробления.

2. Нарушение бластуляции или остановка развития после завершения бластуляции. Все яйца с аномалиями этого типа во время проведения 1-й инспекции были мертвы. Внутри яйцевых оболочек сохранялся желток с расположенным на его анимальном полюсе остатком бластодиска или в перивителлиновом пространстве присутствовали его фрагменты в виде отдельных или объединённых в мелкие группы относительно мелких клеток. Бластодиск сохранял относительно нормальную форму или имел признаки деформации, однако причиной изменения формы могла быть гибель зародыша.

3. Нарушение гаструляции − дезорганизация процесса гаструляции, формирование нерегулярных агрегатов клеток гипобласта с образованием в разных частях зародышевого кольца двух или более центров их конвергенции. Формирование этой аномалии наблюдалось с первых стадий гаструляции, наступавших почти одновременно с началом эпиболии, и завершалось к моменту обрастания желтка ~ 30–40%. Особи из этой группы после формирования отклонения сохраняли жизнеспособность в течение 6–7 сут Признаки ранней дезорганизации процесса осевой конвергенции относительно легко идентифицировали во время проведения 1-й инспекции.

4. Остановка эпиболии желточного синцитиального слоя, блокирующая дальнейшее распространение клеточного материала к вегетативному полюсу, приводит к тому, что в течение 1–3 сут зародыш развивается на очень ограниченной площади, формируя уродливое образование.

5. Микроцефалия – нарушение процесса осевой конвергенции клеточного материала зародыша на этапе органогенеза, приводящее в ходе дальнейшей дифференцировки к деформациям, диспропорциям и недоразвитию различных участков осевого зачатка. Чаще всего наблюдали формирование зародышей меньшего размера, с нарушением пропорций, чаще с недоразвитым головным отделом (микроцефалия). Встречались случаи удвоения некоторых участков осевых структур. Многие из таких зародышей были способны развиваться от нескольких суток до выхода из яйцевых оболочек.

6. Некрозы. Помутнение тканей в разных отделах центральной нервной системы, вероятно, является следствием непрограммированной гибели клеток (Oppenheim, 1991), вызывающей некротические явления в соответствующем месте. Такие помутнения приводят к постепенным деформациям осевых структур, прилегающих к поражённому участку, и не вызывают быстрой гибели зародыша. В зависимости от размера поражённого участка зародыши погибали на поздних стадиях эмбриогенеза или в начале личиночного периода. Иногда при слабых повреждениях формировалась внешне почти нормальная предличинка.

7. Поздняя эмбриональная смертность − гибель эмбрионов, не имевших идентифицированных морфологических отклонений, на поздних стадиях эмбриогенеза. Обычно это происходило после заметного замедления темпа развития зародыша.

8. Аномальные предличинки − вылупление предличинок аномального строения. В подавляющем большинстве случаев эти предличинки имели искривления отделов тела или осевых структур. Такие отклонения, очевидно, формировались ещё в эмбриональном периоде, но оставались не замеченными у эмбрионов, находящихся в сгруппированном состоянии внутри яйцевых оболочек.

9. Гибель после вылупления − гибель в течение 1.0−1.5 сут после вылупления или непосредственно в процессе вылупления, когда эмбрион только что полностью или частично вышел из яйцевой оболочки. Некоторые особи с такими отклонениями имели лёгкие помутнения тканей, пониженную подвижность, немного уменьшенные размеры и т.д., но определить причину их гибели однозначно было невозможно.

10. Невылупившиеся зародыши − неспособность эмбрионов к самостоятельному выходу из яйцевых оболочек. К этому типу отнесены зародыши, которые, имея внешне нормальную морфологию, не вылупились или погибли внутри яйцевых оболочек в течение 3 сут после окончания процесса вылупления остальных эмбрионов.

Отклонения всех выделенных типов были зарегистрированы при развитии мойвы в условиях обоих значений температуры, но частоты их встречаемости и соотношение, их общее число и смертность различались (табл. 2). Различия в числе отклонений 1–5-го и 8-го типов были недостоверны (p > 0.05). При 8°С было отмечено гораздо больше, чем при 5°C, аномалий 6-го, 7-го (p < 0.01) и 9-го типа (p < 0.05), а 10-го типа – меньше (p < 0.05). Все суммарные показатели (общее число отклонений, смертность внутри яйцевых оболочек и за эмбриональный период, а также в течение первых 3 сут после вылупления) достоверно (p < 0.01) больше при 8°C.

Отклонения 1−4-го типа были зарегистрированы при проведении 1-й инспекции, 5−6-го – 2-й и 3-й, 7−10 типа – 4-й–6-й. Инспекции развивающегося материала следовали непрерывно одна за другой в хронологическом порядке. Каждый цикл просмотров занимал определённый период времени, началу и концу которого соответствовало определённое морфологическое состояние или событие в онтогенезе развивающегося материала. В течение каждой инспекции было зарегистрировано соответствующее число отклонений и погибших особей, что демонстрирует характерную динамику этих показателей (табл. 3, 4).

Число отклонений, обнаруженных в развитии потомства самок разных размерно-возрастных групп, в условиях разной температуры несколько различалось (табл. 5), однако отчётливых закономерностей не обнаружено. В частности, при 5°С качество развития потомства 3-летних самок всех размеров было достоверно лучше (φ = 2.3, р < 0.05) по сравнению с потомством 4-летних самок всех размеров, а при 8°С в потомстве молодых самок отклонений было достоверно больше (φ = 4.43, р < 0.01). При 5°С икра мелких младших самок развивалась достоверно лучше (φ = = 3.72, р < 0.01), чем крупных, а при 8°С − хуже (φ = 5.44, р < 0.01). Потомство мелких старших самок при 8°С развивалось достоверно хуже (φ = = 2.39, р < 0.05), чем потомство крупных. Различия в общем числе отклонений, формирующихся в раннем развитии потомства мелких и крупных старших самок при 5°С недостоверны (φ = 1.04, р > 0.05).

ОБСУЖДЕНИЕ

Полученные в наших экспериментах данные о длительности эмбрионального развития мойвы под оболочкой при температуре 5 и 8°C хорошо согласуются с некоторыми опубликованными данными (табл. 6). Однако привёденная в этих работах продолжительность периода вылупления при близких значениях температуры значительно различается и существенно больше, чем установленная в наших экспериментах. Разница в сроках вылупления определяется как индивидуальными особенностями эмбрионов, так и различиями в условиях инкубации разных особей в пределах одной порции или кладки. Ухудшение кислородных условий, например, снижает темп развития, как это, в частности, было показано на атлантическом лососе Salmo salar (Hamor, Garside, 1976), и, соответственно, увеличивает диапазон продолжительности инкубационного периода. При использовании метода индивидуальных наблюдений все особи находятся в одинаковых условиях и различия в хронологических характеристиках определяются исключительно индивидуальными особенностями, что, по-видимому, и определяет большую синхронность вылупления.

В наших опытах моделировались условия глубинного нереста, в результате которого потомство развивается при относительно постоянной низкой температуре. При 8°С общее число зарегистрированных отклонений и смертность были значимо больше, чем при 5°С, что позволяет считать последнее значение более благоприятным для развития исследуемого вида. По сравнению с известными для других видов костистых рыб данными смертность мойвы в период развития внутри яйцевых оболочек даже при 8°С была невысока − в среднем 7.5 (5.0−12.4)%. Для сравнения: в процессе инкубации икры японского угря Anguilla japonica (Okamura et al., 2007) и атлантического лосося Salmo salar (Gunnes, 1979) при оптимальной температуре смертность в яйцевых оболочках составляет ~ 14%, речного окуня Perca fluviatilis – ~20% (Guma’a, 1978), пустынного карпозубика Cyprinodon macularius – ~9% (Kinne, Kinne, 1962), пятнистой зубатки Anarhichas minor – ~60% (Hansen, Falk-Petersen, 2001), сероспинки, или элевайфа, Alosa pseudoharengus – 62% (Edsall, 1970). Смертность осеменённой нормальной по протеканию раннего дробления икры атлантической трески достигает 23% (Avery et al., 2009), а в потомстве колючего хромиса Acanthochromis polyacanthus от производителей наивысшего качества минимальная смертность внутри оболочек – 20% (Donelson et al., 2008).

Границы толерантной зоны температуры для раннего развития мойвы не определены, но значения 5 и 8°С, вероятнее всего, находятся в её пределах. Результаты проведённых опытов позволяют предположить, что с дальнейшим увеличением температуры качество развития будет продолжать снижаться. При меньшей суммарной частоте встречаемости отклонений в развитии при 5°С доля эмбрионов, не способных выйти самостоятельно из яйцевых оболочек, была значимо больше. При дальнейшем снижении температуры инкубации этот тип отклонений, вероятно, будет вносить ещё больший вклад в увеличение смертности. В экспериментах по инкубации икры мойвы при температуре 2°С (Gjøsæter, Gjøsæter, 1986), близкой к нижнему пределу диапазона, продолжительность вылупления была сопоставима с продолжительностью развития под оболочкой (табл. 6), что может являться косвенным признаком негативного влияния низкой температуры на реализацию онтогенеза. В экспериментах с инкубацией икры мойвы при разной постоянной температуре (4.2, 7.4 и 11.2°С) с целью имитации демерсальных и пляжных условий развития наилучший результат был получен при 7.4°С (Penton, Davoren, 2013). При 4.2°С развитие сопровождалось более высокой смертностью, а при 11.2°С кроме повышения смертности в двух вариантах опытов из трёх произошло заметное снижение темпа развития. Этот феномен авторы не обсуждают, однако очень вероятно, что он является признаком негативного воздействия высокой температуры.

Опыты по инкубации икры мойвы при постоянной температуре моделируют естественные условия глубинных нерестилищ только в приблизительной степени, так как не учитывают эффект постепенного прогрева в процессе длительного эмбрионального периода, а от крайне изменчивых условий приливно-отливной зоны они отличаются принципиально. Очевидно, что временный характер воздействия экстремальных значений температуры в случае пляжного нереста смягчает отрицательный эффект на развитие мойвы, однако вклад в воспроизводство вида каждой из двух локаций нереста и биологическое значение такой диверсификации в настоящее время остаётся не вполне понятным.

Динамика формирования аномалий при 5 и 8°C имела сходный характер. Наибольший прирост числа отклонений зарегистрирован на первых этапах развития (от осеменения до органогенеза, когда происходит закладка основных систем органов зародыша) и в процессе вылупления. В середине эмбрионального периода прирост также продолжался, но заметно меньшими темпами. Показатель смертности в процессе развития при разной температуре также изменялся сходным образом, но в отличие от динамики формирования отклонений в середине эмбрионального периода смертность практически отсутствовала. Точно такая же динамика смертности отмечена в эмбриональном развитии пятнистой зубатки (Hansen, Falk-Petersen, 2001).

В процессе первой инспекции регистрировались отклонения 1–4-го типов, которые в это время преимущественно определяли и величину смертности. Основную долю в этой совокупности составляли неоплодотворённые яйца, икринки с сильными нарушениями деления и бластуляции. Мы учитывали только яйца, погибшие в результате предыдущих нарушений, но, по-видимому, нарушений было больше, так как показано, что многие яйца с аномальным дроблением способны развиваться в личинки с нормальной морфологией (Kjǿrsvik, 1994; Avery, Brown, 2005; Avery et al., 2009). По частоте формирования отклонений 1–4-го типов в условиях обоих значений температуры значимые различия не обнаружены. По-видимому, это объясняется тем, что преобладающие аномалии 1−2-го типов (нарушение оплодотворения и дробления и нарушение бластуляции) в основном определяются состоянием ооцитов, качеством спермы, проблемами с включением собственного ядерного генома зародыша и запуском морфогенеза (Neyfakh, 1959; Кафиани, Тимофеева, 1964; Kane, Kimmel, 1993), а не температурными условиями.

Дальнейшее увеличение общего числа регистрируемых отклонений происходило за счет некрозов и микроцефалии, которые не вызывают быстрой гибели зародышей или не вызывают её вообще. Этим объясняется практически полное отсутствие увеличения гибели зародышей в середине эмбриогенеза. К концу эмбриогенеза смертность начинает увеличиваться, значительно опережая темп увеличения числа отклонений. Увеличение смертности в конце эмбриогенеза и в процессе вылупления происходит преимущественно за счёт гибели эмбрионов от не идентифицированных ранее нарушений, которые были объединены в группы “поздняя эмбриональная смертность” и “гибель после вылупления”, а также эмбрионов, отнесённых к группам “микроцефалия”, “некрозы”.

При инкубации мойвы при температуре 8°С общее число отклонений, суммарная смертность за эмбриональный период и вскоре после вылупления, а также смертность внутри яйцевых оболочек значимо больше, чем при 5°C (табл. 2). При этом достоверные различия между двумя вариантами выявлены по частоте формирования отклонений 6−7-го и 9−10-го типов. В составе общего числа отклонений наиболее значимую долю при 5 и 8°C составляли аномалии пяти типов (нарушение оплодотворения и дробления, микроцефалия, некрозы, поздняя эмбриональная смертность и невылупившиеся) − соответственно 84.8 и 77.5%. При этом разные температурные условия инкубации определяли существенные различия в соотношении типов отклонений. Особенно заметно это проявилось в случае некрозов, которых зарегистрировано намного больше при 8°С, и невылупившихся, доля которых значительно больше при 5°С. Причиной более высокого числа невылупившихся при 5°С, возможно, является некоторое снижение активности фермента желёз вылупления (Luczynski et al., 1987) и снижение двигательной активности эмбриона при пониженной температуре. Подвижность эмбриона является в этом процессе вторичным (Yamagami, 1981), но необходимым фактором (Armstrong, 1936).

Ранее с помощью аналогичной методики были проведены многолетние исследования арктонорвежской трески (Solemdal et al., 1998; Makhotin et al., 2001). Динамика формирования аномалий в раннем онтогенезе этого вида и мойвы в целом имеет высокое сходство, однако первый пик у трески выражен значительно слабее, а второй − значительно сильнее. При этом среднее значение частоты формирования отклонений у трески в разные годы проведения исследований составляло 22–34% (Makhotin et al., 2001), что значительно превышает число отклонений, выявленных у мойвы при развитии в условиях и 5, и 8°С (10.2 и 14.3%). Динамика суммарной смертности у трески (Solemdal et al., 1998) в общих чертах сходна с таковой у мойвы, но отличается меньшей выраженностью пиков в конце эмбриогенеза и в начале вылупления. При этом суммарная смертность трески в раннем онтогенезе в два–три раза больше, чем у мойвы (23.8−31.0 против 7.9 и 12.5%). Качественный состав отклонений и их соотношение, выявленные в развитии мойвы, отличаются от описанного для трески (Makhotin et al., 2001). У мойвы отсутствуют нарушения водно-солевого баланса, проявляющиеся в виде избыточного обводнения или потери воды, которое отражается на объёме головного гидросинуса, и протоптеригия, присутствующие у эмбрионов трески. Также не зарегистрированы нарушения клеточных контактов провизорных покровов предличинок, вызывавшие их разрыв и быструю гибель особи. Таким образом, с помощью методики индивидуального отслеживания мы показали, что развитие трески по сравнению с мойвой сопровождается формированием гораздо бóльшего числа отклонений и более высокой смертностью. По-видимому, причина этих различий определяется видоспецифическим комплексом особенностей репродуктивной биологии. Треска характеризуется высокой индивидуальной плодовитостью, многопорционностью, особенностями гормональной регуляции синхронного созревания больших порций ооцитов, сложной структурой нерестовой популяции. Короткоцикловая мойва с её практически всегда одноразовым нерестом по всем этим показателям занимает почти противоположное положение. В пользу видоспецифичности отмеченных особенностей раннего развития трески говорит то, что в её икре, выловленной в экологически чистых заливах Норвегии, было обнаружено до 60% хромосомных аберраций (Kjǿrsvik et al., 1984) при среднем значении 18.5% (Stene, 1987).

В исследованиях разных аспектов материнского эффекта на качество раннего развития потомства выявлены связи его различных характеристик с размерами, возрастом, темпом роста, показателями состояния самки и последовательным номером нереста, от которого он получено. Эти связи у разных видов проявляются в разной степени (Владимиров, 1975; Knutsen, Tilseth, 1985; Bromage, Cumaranatunga, 1988; Kjesbu et al., 1991, 1996; Solemdal et al., 1995; Chambers, Leggett, 1996; Brooks et al., 1997; Trippel et al., 1997; Marteinsdottir, Steinarsson, 1998; Trippel, 1998; Laine, Rajasilta, 1999; Marteinsdottir, Begg, 2002; Berkeley et al., 2004; Donelson et al., 2008). На основании приведённых в этих работах данных можно предполагать, что наиболее успешно будет развиваться потомство крупных самок мойвы старшего возраста при 5°С, однако полученные результаты не подтвердили это предположение. Лучший результат был получен в развитии потомства мелких 3-леток при 5°С, т.е. медленно растущих и молодых рыб. Второй результат был в группе крупных 4-леток при 8°С, что вполне соответствует выдвинутой гипотезе, но противоречие в том, что он лучше, чем развитие потомства самок этой группы при 5°С. Во всех остальных вариантах потомство более крупных рыб развивалось лучше, однако не все различия достоверны. Положительная связь качества развития потомства с размером самки заметно слабее связи с её качественными показателями, имеющими, очевидно, ведущее значение, и иногда может не проявляться вовсе (Knutsen, Tilseth, 1985; Chambers et al., 1989; Marteinsdottir, Steinarsson, 1998). Однако размер одновозрастных рыб в высокой степени является отражением качества их питания и других условий жизни, что проявилось в большинстве вариантов наших экспериментов. Связь с возрастом обнаружить не удалось. Мелкие 4-летки были мельче крупных 3-леток, и в этом случае потомство старших самок развивалось хуже при обоих значениях температуры. В потомстве молодых рыб не наблюдалось заметного снижения выживаемости, как это описано для видов с более сложной структурой нерестовой популяции, у которых констатировано более низкое качество потомства от первого нереста по сравнению с последующими (Bromage, Cumaranatunga, 1988; Solemdal et al., 1995; Kjesbu et al., 1996; Brooks et al., 1997; Trippel, 1998). Это согласуется с тем, что у мойвы практически не встречается повторного нереста (Collett, 1903; Расс, 1933; Поздняков, 1960, 1962; Sætre, Gjøsæter, 1975; Christiansen et al., 2008) и потомство как старших, так и младших рыб является потомством первого нереста.