Известия РАН. Серия физическая, 2020, T. 84, № 11, стр. 1652-1656

ВВЕДЕНИЕ

Среди способов формирования трехмерных матриксов особо стоит выделить технологии 3D-печати, когда трехмерный матрикс формируется послойно, исходя из цифровой модели желаемого объекта. Одним из наиболее перспективных методов структурирования является метод двухфотонной микростереолитографии – уникальная технология 3D-печати микро- и нанообъектов с использованием фемтосекундного лазерного излучения и жидкого фотополимеризуемого композиционного материала [1–4]. Метод двухфотонной микростереолитографии позволяет формировать матриксы непосредственно в объеме фоточувствительного материала. Благодаря нелинейному характеру поглощения лазерного излучения, процесс структурирования происходит без нагрева материала, что дает возможность вводить различные биоактивные компоненты (факторы роста, цитокины) в материал матрикса непосредственно перед 3D-печатью. C помощью метода двухфотонной микростереолитографии уже получены трехмерные матриксы из фоточувствительных композиций на основе желатина [5], гиалуроновой кислоты [6, 7], фибрина [8], хитозана [9].

Данная работа является продолжением наших исследований по формированию трехмерных микроструктур из композиций на основе фоточувствительных разветвленных поли(D,L-лактидов). Ранее было показано, что такие матриксы обеспечивают остеогенную дифференцировку стволовых клеток жировой ткани, увеличивают скорость минерализации новообразованной костной ткани [10]. Были синтезированы гидрофобные производные антибактериального препарата ципрофлоксацина, которые дополнительно обладали абсорбцией в области двухфотонного поглощения. Это позволило использовать их в качестве фотоинициаторов 3D-печати, а также реализовать ковалентную фиксацию производных ципрофлоксацина в структуре трехмерных матриксов. В дальнейшем такой подход может обеспечить пролонгированное действие антибактериальных препаратов при хирургических операциях с использованием трехмерных матриксов из тетрафункционального поли(D,L-лактида), также избежать традиционную бактериальную терапию после имплантации.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Синтез гидрофобных производных ципрофлоксацина

Для получения производных ципрофлоксацина в работе использовали фармацевтическую субстанцию ципрофлоксацина (CPF) гидрохлорида, аллил-хлорид, 4-винилбензилхлорид, триэтиламин, метанол, K₂CO₃. Для подтверждения получения целевых соединений использовали масс-спектрометрический (ESI-MS) анализ с системой LCMS-2020, оснащенной масс-спектрометром.

Синтез производного CPF с аллил хлоридом (CPF-Allyl) осуществляли согласно схеме на рис. 1: ципрофлоксацина гидрохлорид (200 мг, 545 мкмоль, 1 эквивалент) растворяли в 10 мл метанола, добавляли аллилхлорид (50 мкл, 695 мкмоль, избыток 1.3 раза) и карбонат калия (115 мг, 0.833 мкмоль, избыток 3.0 раза). Полученную смесь кипятили в течение 2 ч в круглодонной колбе с обратным холодильником. По окончании реакции полученный раствор охлаждали, отфильтровывали от соли на целлюлозном фильтре, упаривали на ротационном испарителе при пониженном давлении. Получили белое твердое вещество, растворы которого в метаноле обладают характерной синей флуоресценцией при облучении УФ излучением на длине волны 365 нм. ESI-MS: m/z 372.15 [M⁺H]⁺ для ${{{\text{C}}}_{{{\text{2}}0}}}{{{\text{H}}}_{{{\text{23}}}}}{\text{F}}{{{\text{N}}}_{{\text{3}}}}{\text{O}}_{{\text{3}}}^{ + }$ (теор. 372.17).

Рис. 1.

Структура и схема синтеза аллил-ципрофлоксацина (CPF-Аllyl).

Синтез производного CPF с винилбензил хлоридом (CPF-VBC) осуществляли согласно схеме на рис. 2: ципрофлоксацина гидрохлорид (200 мг, 545 мкмоль, 1 эквивалент) растворяли в 10 мл метанола, добавляли винилбензил хлорид 90% (153 мкл, 1000 мкмоль, избыток 1.8) и карбонат калия (115 мг, 0.833 мкмоль, избыток 3.0 раза). Полученную смесь кипятили в течение 2 ч в круглодонной колбе с обратным холодильником. По окончании реакции полученный раствор охлаждали, отфильтровывали от соли на целлюлозном фильтре, хроматографировали на силикагеле с использованием этанола в качестве элюента, упаривали на ротационном испарителе при пониженном давлении. Получили белое твердое вещество, растворы которого в метаноле обладают характерной синей флуоресценцией при облучении УФ излучением на длине волны 365 нм. ESI-MS: m/z 448.2 [M⁺H]⁺ для ${{{\text{C}}}_{{26}}}{{{\text{H}}}_{{{\text{27}}}}}{\text{F}}{{{\text{N}}}_{{\text{3}}}}{\text{O}}_{{\text{3}}}^{ + }$ (теор. 448.20).

Рис. 2.

Структура и схема синтеза винилбензил-ципрофлоксацина (CPF-VBC).

Для регистрации спектров поглощения растворов производных ципрофлоксацина использовали спектрофотометр Cary-50 (Varian Optical Spectroscopy Instruments).

РЕЗУЛЬТАТЫ

В результате УФ-спектрометрии было подтверждено, что полученные производные ципрофлоксацина сохраняют характерную для исходного соединения оптические свойства, а именно способность к синей флуоресценции (максимум при 420–450 нм) при облучении светом светодиода с максимумом излучения при 365 нм. Следовательно, синтезированные производные ципрофлоксацина прозрачны в области работы фемтосекундного лазера, при этом имеют интенсивную полосу поглощения при 282 нм и более слабый максимум при 320 нм. Способность ципрофлоксацина претерпевать фотоиндуцированные радикальные превращения описана в литературе [11], однако новизна этой работы состоит в том, что это его свойство использовали для лазер-инициируемой контролируемой фотополимеризации функционализированного акрилатом полилактида. Введение аллиловой и винилбензиловой групп в структуру ципрофлоксацина дало производные с повышенной гидрофобностью. Это важно для лучшей растворимости соединения в полилактиде, а также сайты ковалентного присоединения к обсуждаемой полимерной матрице через механизмы радикальной полимеризации [12, 13]. Таким образом, введение двойной ‒С=С– связи в структуру ципрофлоксацина позволяет расширить возможности применения данного антибактериального препарата за счет использования его в качестве фотоинициатора и мономера материалов для двухфотонной полимеризации.

Результаты, представленные в табл. 1, количественно характеризуют увеличение липофильности аллильного и винилбензильного производных по сравнению с исходным ципрофлоксацином.

Из полученных данных по докингу следует, что данные соединения способны связываться с ДНК гиразой бактерии E. coli с различной аффинностью, однако различия в нюансах их связывания (аминокислотного окружение фторхинолонового фрагмента) могут вносить существенный вклад в возможность ингибирования активности этого фермента полученными соединениями (табл. 2).

Подбор параметров 3D-печати проводили в несколько этапов. Вначале, подбиралась минимальная мощность лазерного воздействия, при которой происходило формирование матрицы параметров с четкими контурами. Также оценивалась сохранность матрицы после процедуры отмывки. Затем, при фиксированной мощности лазера формировали матрицу параметров, меняя расстояние между отдельными слоями и расстояние между отдельными проходами луча. Результаты подбора параметров приведены на рис. 3 и 4.

Рис. 3.

Микрофотография (а) и СЭМ (б, в) матрицы подбора параметров для ФПК с CPF-Аllyl в качестве фотоинициатора. (в) – элемент матрицы параметров, структурированный при мощности 60 мВт, расстояние между отдельными слоями – 5 мкм, расстояние между проходами луча – 1 мкм.

Рис. 4.

Микрофотография (а) и СЭМ (б–г) матрицы подбора параметров для ФПК с CPF-VBC в качестве фотоинициатора. Элемент матрицы параметров, структурированный при мощности 35 мВт, расстояние между отдельными слоями – 5 мкм, расстояние между проходами луча – 1 мкм (в). Элемент матрицы параметров, структурированный при мощности 50 мВт, расстояние между отдельными слоями – 8 мкм, расстояние между проходами луча – 4 мкм (г).

Для матрицы параметров из ФПК и CPF-Аllyl в качестве фотоинициатора (рис. 3) мощность структурирования составила 60 мВт, при этом единичные элементы матрицы сохранялись после отмывки только в случае “плотной” заливки линиями c шагом 1 мкм.

Минимальная мощность лазерного излучения при структурировании ФПК с CPF-VBC в качестве фотоинициатора составила 35 мВт. Для ФПК с CPF-VBC (рис. 4) наблюдалась большая стабильность матрицы после отмывки в сравнении с CPF-Аllyl: единичные элементы матрицы сохранялись при расстоянии между проходами луча с шагом 4 мкм, при этом поверхность элементов представляла собой решетчатую структуру (рис. 4г).

Таким образом, методом 3D-печати с использованием фемтосекундного лазерного излучения впервые были сформированы трехмерные матриксы на основе тетрафункционального поли(D,L-лактида) и производных ципрофлоксацина, модифицированных аллил хлоридом и винилбензил хлоридом. Синтезированные производные ципрофлоксацина характеризуются большей липофильностью по сравнению с исходным ципрофлоксацином. В рамках продолжения работы будут изучены биосовместимость и антимикробные свойства трехмерных матриксов на основе разработанных ФПК.

Исследование выполнено при финансовой поддержке РФФИ и БРФФИ (проекты № 19-52-04020 и № Х19РМ-034), Министерства науки и высшего образования в рамках выполнения работ по государственному заданию ФНИЦ “Кристаллография и фотоника” РАН в части развития лазерных аддитивных технологий.