Известия РАН. Серия физическая, 2020, T. 84, № 11, стр. 1537-1541

ВВЕДЕНИЕ

В настоящее время одной из проблем мирового масштаба является борьба с патогенными микроорганизмами [1]. Особенно устойчивыми являются возбудители, способные к формированию биопленок. Биопленки являются формой микробных сообществ, фиксированных на различных поверхностях [2]. Большинство организмов обладает способностью формировать биопленки. Традиционными методами борьбы с микроорганизмами считаются антибиотики, дезинфицирующие химические средства [3]. Данные методы не являются панацеей и у них есть свои минусы. Так, у микробов может появляться резистентность к антибиотикам, а химические вещества по большой части вредны и для самого человеческого организма. Решение проблемы антимикробной резистентности является одной из ключевых в современной медицине. Поэтому на повестке дня современной медицинской микробиологии стоит поиск альтернативных способов борьбы с патогенными микроорганизмами.

В последние годы появилось большое количество работ, в которых предлагают новые методы борьбы с микроорганизмами. К таким разработкам можно отнести создание микро- или наноструктур на поверхности материалов [4–6]. Данные структуры могут обладать уникальными физико-химическими свойствами. Идею использовать наноструктуры в борьбе с микроорганизмами учёные почерпнули из природы. Известным примером является плотная текстура из наноиголок на крыльях цикады, которые обладают механическим бактерицидным эффектом, а также свойством гидрофобности.

Одним из наиболее востребованных методов получения микро-нанорельефа является лазерное текстурирование поверхности. Этот метод является востребованным благодаря своей простоте и эффективности, а также широкому кругу материалов, из которых можно получить нужные структуры. Так, искусственные нанопичковые структуры, сформированные с помощью лазерного излучения, были получены на поверхностях металлов, полупроводников, полимеров [7–9]. Успешно используются для борьбы с бактериями антибактериальные наночастицы, действующие посредством генерации синглетного кислорода или его других реакционноспособных форм [10–14]. Также, большое внимание исследователей привлекает антимикробная фотодинамическая терапия, которая благодаря окислительному характеру повреждений клеточных компонентов препятствует развитию устойчивости [15–18].

В настоящей работе исследовалась бактерицидная активность различных типов наноматериалов и поверхностных наноструктур, полученных с помощью современных лазерных технологий, в отношении патогенных микроорганизмов в форме планктона и биопленок. Также, изучались возможности инновационного лазерно-аппликационного метода полного подавления биопленок in situ.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Лазерная фабрикация квазирегулярных микро-наноструктур на поверхности полированной пластины кремния n-типа и нержавеющей стали марки 12X18H10T осуществлялась с помощью волоконного фемтосекундного лазера Satsuma с длиной волны 1030 нм, длительностью импульса: 300 фс и частотой сканирования 160 кГц. На поверхности выбирался участок размерами 1 × 1 см. Лазерное излучение фокусировалось на поверхности в пятно размером 1/e ≈ 15 мкм. В качестве среды обработки использовались дистиллированная вода и воздух.

Генерация наночастиц и перенос металлических пленок в виде наночастиц на бактериальные биопленки осуществляли с помощью волоконного наносекундного лазера HTF MARK (Булат) (длина волны – 1064 нм, длительность импульса на полувысоте – 120 нс, максимальная энергия в импульсе – 1мДж, частота повторения импульсов – до 80 кГц). Излучение фокусировалось и сканировалось гальваносканнером с фокусным расстоянием объектива 160 мм. Металлические пленки напылялись на полимерные подложки методом магнетронного распыления в атмосфере аргона. Пластик с напыленной на него тонкой (≈120 нм) металлической (Au, Ag, Cu) пленкой подвергали воздействию лазерного излучения с энергией в импульсе 0.2 мДж, частотой следования импульса 20 кГц и скоростью сканирования 1500 мм/с. Минимальный размер пятна фокусировки при этом составлял ≈80 мкм, интенсивность излучения достигала 100 МВт/см². Расстояние между мишенью и стеклом с биопленкой составляло 2 мм.

Визуализация структурированных поверхностей и наночастиц производилась с помощью сканирующего электронного микроскопа (СЭМ, JEOL 7001F). Элементный состав анализировался методом энергодисперсионной рентгеновской спектроскопии (ЭДРС, INCA (Oxford Instruments)).

Антибактериальное действие образцов было проверено на грамположительных бактериях золотистого стафилококка и грамотрицательных синегнойной палочки. Эти бактерии использовались в планктонной форме и форме их биопленок – прочных полимерных матриц, которые позволяют бактериям оставаться в гидратированной среде, обеспечивая тем самым их высокое антибиотическое сопротивление. 18-часовая культура каждой бактерии, которая выращивалась в питательной среде (лизогенный бульон, LB), разбавлялась свежим LB 1 : 100. Затем, 2 мл лизогенного бульона в чашке Петри помещали под исследуемое стекло. Для формирования биопленок требовалась 4-часовая инкубация при температуре 37°С.

Для исследований планктонных бактерий ночную бульонную культуру разводили 100 раз, центрифугировали и удаляли питательный бульон. Осевшие на дне пробирки бактерии ресуспендировали в физиологический раствор и разливали по 1 мл в лунки 24-луночного планшета. В лунки помещали образцы одинакового размера. Планшет с образцами ставили на качалку и инкубировали в течение 60 мин в термостате при температуре 37°С. Затем бактерии высевали на плотную питательную среду и считали КОЕ (колониеобразующая единица). Контролем в этих опытах служили пластины чистого (неструктурированного) металла и/или стекла. Опыты проводили в трех повторах. Жизнеспособность бактерий оценивали с помощью набора красителей Live/Dead Bacterial Viability Kit. Для этого, вначале на поверхность исследуемых и контрольных образцов наносили бактериальные культуры (капли объемом 200 мКл) и инкубировали в течение 60 мин во влажной камере. Затем образцы окрашивали флуоресцентными красками пропидиум иодидом и Цито9, следуя протоколу метода окрашивания LIVE/DEAD, а после окрашивания промывали стерильной водой. Такой метод исследования позволяет выявлять живые и мертвые клетки бактерий. Живые бактерии флюоресцируют зеленным цветом, а мертвые – красным.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Периодические поверхностные наноструктуры, генерируемые ультракороткими лазерными импульсами в дистиллированной воде на поверхности кремния, демонстрируют уменьшение КОЕ/мл патогенных грам-положительных микроорганизмов S.aureus от начальной концентрации примерно на 1 порядок, что в микробиологической практике обычно считается незначительным (значительным считается уменьшение на 3–4 порядка). При этом, бактерицидное действие этих наноструктур на культуру грам-отрицательных бактерий P. aeruginosa места не имеет (табл. 1). Несколько лучшую бактерицидную эффективность показали кремниевые структуры с нанесенными на них коллоидными серебряными наночастицами – снижение на 2 порядка для культуры S. aureus и полпорядка для культуры P. aeruginosa (табл. 1). Примечательно, что для нано-структурированной стали, содержащей значительное количество цито-токсичного никеля [5], характерно снижение на 1 порядок по обеим культурам (табл. 1). Таким образом, проведённое исследование показало, что нано/микро-структурированные образцы не обладают ярко выраженным бактерицидными свойствами по отношению к планктонной форме патогенных бактерий этих культур. Бактерицидный эффект структурированных поверхностей проявлялся только при непосредственном контакте с бактериями в красном окрашивании образцов (рис. 1). Механизм гибели бактерий обусловлен, по-видимому, механическим фактором (влияние острых шипов наноструктур) [4], а также фотодинамической активностью составляющих их наночастиц [10].

Рис. 1.

СЭМ-снимки структурированной поверхности кремния (а); кремния с серебряными наночастицами (б); нержавеющей стали (в); живые и мертвые бактериальные клетки на соответствующих структурированных поверхностях (г–е). Красный флуоресцентный краситель окрасил мертвые клетки, а зеленый – живые.

В связи с тем, что нано/микро-структурированные поверхности не проявляют значимое бактерицидное действие по отношению к биопленкам, был разработан новый эффективный метод борьбы с биопленками с помощью лазерного переноса металлических наночастиц с поверхности полимера непосредственно на поверхность биопленки. На рис. 2 показана схема аппликационного лазерного переноса наночастиц с прозрачной подложки на биопленки патогенных микроорганизмов. При воздействии умеренно интенсивного (∼10 МВт/см²) наносекундного лазерного излучения на нанокристаллиты металлической пленки происходило тепловое расширение материала, более выраженное в атмосферу, чем в полимерную подложку, что приводило к быстрому смещению центра масс кристаллитов от поверхности и отрыву при преодолении энергии адгезии с полимерной подложкой. Этот “прыжковый” механизм хорошо известен в технологии лазерной очистки наночастиц с критических поверхностей [19, 20]. Дополнительно, существенный импульсный нагрев нанокристаллитов вызывал нагревание и разложение полимера в области их контакта, создающее трамплино-образную реактивную выталкивающую силу [19, 20]. В итоге, металлическая пленка в виде совокупности составляющих ее кристаллитов отлетала от мишени и через воздушный промежуток шириной в 2 мм попадала на стеклянную подложку с бактериальной биопленкой, где в итоге образовывались наблюдаемые с помощью сканирующей электронной микроскопии скопления нанокристаллитов (наночастиц), частично покрытые полимером подложки. Роль данного полимера в проявление бактерицидной активности металлических наночастиц в настоящее время активно исследуется методами ИК-микроскопии и конфокальной КР-микроскопии.

Рис. 2.

Схема/принцип аппликационного лазерного переноса наночастиц с прозрачной подложки на биопленки патогенных микроорганизмов.

После проведения стандартных микробиологических процедур, определялось КОЕ. Результаты представлены в табл. 2. При использовании предложенного метода в ряде случаев – для серебряных и медных наночастиц – выявлена полная гибель живой суточной биопленки. При переносе золотых наночастиц и при воздействии лазера через пластиковую подложку без металлической пленки бактерицидного воздействия не выявлено. Эти результаты показывают, что бактерицидность перенесенных наночастиц не связана непосредственно с воздействием лазера и температурой наночастиц. Напротив, эффективность метода обусловлена химическими свойствами наночастиц серебра и меди – их токсичностью в отношении патогенных бактерий. Предложенный экономичный и потенциально мобильный способ позволяет повысить локальность, доступность и эффективность разрушения биопленки за счет бактерицидного эффекта металлических наночастиц при незначительном прямом лазерном воздействии на биопленку.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Проведенные исследования показали, что лазерно-нано/микро структурированные поверхности обладают бактерицидным действием в отношении патогенных бактерий в планктонной форме, причем это воздействие особенно эффективно проявляется при непосредственном контакте микробов с поверхностью. Предложенный иновационный мобильный способ аппликационного лазерного переноса наночастиц серебра или меди на поверхность зрелых бактериальных биопленок патогенных микроорганизмов S. aureus и P. aeruginosa приводит к их практически полной гибели.

Исследования поддержаны Российским научным фондом (проект № 18-15-00220).