Известия РАН. Серия физическая, 2022, T. 86, № 9, стр. 1352-1357

ВВЕДЕНИЕ

Облучение ионизирующей радиацией широко применяется при лечении онкологических заболеваний. Этот метод показан главным образом в тех случаях, когда опухоль не может быть удалена радикально хирургическим путем, или при наличии противопоказаний к оперативному вмешательству. До 70% онкологических больных подвергаются лучевой терапии как самостоятельному методу или в качестве компонента комбинированного лечения (в сочетании с хирургическим лечением, химиотерапией) [1]. Принцип действия радиационной терапии основан на фундаментальном законе, сформулированном еще в 1906 г. И. Бергонье и Л. Трибондо: клетки тем более радиочувствительны, чем менее они дифференцированы и чем интенсивнее они делятся [2]. Гибель таких клеток наступает в процессе деления, в результате повреждений в ДНК. Таким образом, для клеток злокачественной опухоли, быстро и неограниченно пролиферирующих и менее зрелых, чем клетки здоровой ткани, летальная доза будет ниже, чем для окружающих опухоль здоровых клеток [1, 3].

В настоящее время разработано множество методик радиационной терапии, направленных на усиление избирательности повреждения клеток опухоли и ослабления радиационной нагрузки на здоровые ткани [3–5]. Различные виды излучений характеризуются разной линейной передачей энергии (ЛПЭ) и зависимостью ЛПЭ от глубины проникновения в организм. Для фотонов эта зависимость имеет максимум в самом начале пробега частицы (для излучения ⁶⁰Co с энергией фотонов 1.3 МэВ на глубине около 2 см в воде) [2], и затем медленно спадает. Такое распределение поглощенной энергии не благоприятно для лечения опухолей, локализованных глубоко внутри организма, так как доза радиации, полученная здоровыми тканями, оказывается выше, чем полученная опухолью. В случае же тяжелых заряженных частиц (протонов, α-частиц, ядер углерода) зависимость ЛПЭ от длины пробега в ткани имеет характерный максимум в конце трека (пик Брэгга), положение которого можно подобрать, варьируя начальную энергию частицы, так чтобы максимальная плотность ионизаций пришлась на опухоль [2]. Также в терапии используются пучки адронов высоких энергий, вдали от пика Брэгга – это так называемая технология “pencil beam”, особенно эффективная при лечении внутричерепных патологий [3–5]. Точная фокусировка, малое сечение пучка, практически не рассеивающегося в биологических тканях – неоспоримые преимущества этого метода. Подобный метод лечения успешно применялся в течение десятков лет в Комплексе лучевой терапии “на пролет” на базе ускорителя протонов СЦ-1000 в ФГБУ ПИЯФ им. Б.П. Константинова НИЦ “Курчатовский институт” (Гатчинский метод) [5–7]. На счету специалистов Комплекса более 1300 излеченных больных. Протоны высоких энергий имеют низкую ЛПЭ, сравнимую с ЛПЭ гамма-излучения [3]. Однако, взаимодействие этих ионизирующих частиц с веществом существенно различаются: гамма-кванты вызывают первичную ионизацию атомов в результате фотоэффекта и комптоновского эффекта, возникшие при этом быстрые электроны в свою очередь производят ионизацию и возбуждение окружающих атомов за счет электромагнитного взаимодействия с электронными оболочками. Треки этих электронов в веществе искривлены, длина пробега варьирует от 1 до 1000 мкм в зависимости от энергии фотона, переданной электрону. Протоны высоких энергий непосредственно вызывают множественные ионизации и возбуждение атомов в результате электромагнитного взаимодействия с электронными оболочками [2]. Целью данной работы является анализ повреждений в молекуле ДНК под действием γ-излучения ⁶⁰Co (используется в терапевтическом устройстве гамма-нож) и протонов с энергией 1 ГэВ (на синхроциклотроне СЦ-1000 Санкт-Петербургского НИИ ядерной физики НИЦ “Курчатовский институт”). Эти два вида излучения имеют одинаковое значение ЛПЭ = $0.3\,\,{\text{кэВ}} \cdot {\text{мк}}{{{\text{м}}}^{{ - 1}}}.$

Радиационные нарушения в структуре ДНК подразделяют на одиночные и локальные множественные повреждения (ЛМП) [2, 8]. Одиночные повреждения являются, в основном, результатом косвенного действия радиации, т.е. взаимодействия макромолекулы с продуктами радиолиза воды. Эти повреждения быстро и эффективно репарируются в клетках. ЛМП – это два и более одиночных повреждений, расположенные на расстоянии менее 10 пар оснований. Такие повреждения труднорепарируемые либо нерепарируемые, особенно если нарушения возникли на обеих комплиментарных нитях ДНК. ЛМП играют основную роль в радиационной гибели клетки [8].

В данной работе нарушения в структуре ДНК изучали методом спектрофотометрического плавления [9, 10]. На параметры перехода спираль-клубок в облучаемой макромолекуле влияют различные типы радиационных повреждений. Одно- и двухцепочечные разрывы, разрушение, модификация и высвобождение азотистых оснований приводят к дестабилизации вторичной структуры и понижают температуру плавления ДНК (T_m) [9–12], в то время как межнитевые сшивки увеличивают T_m [9, 10].

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Для исследования использовали натриевую соль ДНК из тимуса теленка (Sigma) молекулярной массы $M = \left( {6.3 \pm 0.5} \right) \cdot {{10}^{6}}\,\,{\text{Da,}}$ химически чистый NaCl, деионизованную воду. Растворы NaCl необходимой концентрации готовили из насыщенного раствора.

Облучение протонами с энергией 1 ГэВ проводили в аэробных условиях при комнатной температуре в ФГБУ ПИЯФ им. Б.П. Константинова НИЦ “Курчатовский институт” в комплексе Лучевой терапии “на пролет” на базе ускорителя СЦ-1000. Интенсивность пучка составляла 4 ${\text{Гр}} \cdot {\text{ми}}{{{\text{н}}}^{{ - 1}}}.$ Гамма-облучение проводили в аэробных условиях при комнатной температуре на установке Исследователь (⁶⁰Co) в Отделении молекулярной и радиационной биофизики ПИЯФ им. Б.П. Константинова. Мощность дозы составляла 85 Гр мин^–1. Концентрация ДНК в облучаемых растворах ${\text{С}} = \left( {1.4 \pm 0.1} \right) \cdot {{10}^{{ - 4}}}$ М нуклеотидов.

Измерения кривых плавления ДНК в исследуемых растворах проводили на приборе Specord 200 plus (Analytik Jena, Germany) с приставкой Пельтье, с шагом 1°, скорость нагрева 1° · мин^–1. Использовали кварцевые кюветы с длиной оптического пути $l = 1\,\,{\text{см}}.$ В экспериментах измеряли оптическое поглощение раствора в максимуме поглощения ДНК D₂₆₀ в зависимости от температуры T. Сбор данных и управление экспериментом осуществлялись с помощью программы WinASPECT (Analytik Jena, Germany). Обработку данных проводили в пакете OriginPro. Значение температуры плавления ДНК Т_m определяли по положению максимума на дифференциальной кривой плавления $\frac{{d{{D}_{{260}}}}}{{dT}}$ [13]. Прежде, чем приступить к плавлению, регистрировали спектр УФ поглощения ДНК при температуре 25°С. После завершения плавления регистрировали спектр при максимальной температуре 95°С. Далее проводили охлаждение раствора до 25°С в течение 10 мин и регистрировали спектр ДНК. Используя полученные спектры поглощения, определяли величину гиперхромного эффекта [10]:

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Выполнены измерения температуры плавления ДНК Т_m в растворах 5 мМ NaCl и 150 мМ NaCl, облученной протонами 1 ГэВ и гамма-излучением ⁶⁰Co в дозах 0–100 Гр. На рис. 1 показаны дифференциальные кривые плавления ДНК, использованные для определения Т_m. С ростом ионной силы раствора увеличивается степень экранировки отрицательно заряженных фосфатных групп, что стабилизирует вторичную структуру ДНК. Это проявляется в увеличении температуры плавления T_m нативной ДНК и сужении температурного интервала перехода спираль-клубок в растворе 150 мМ NaCl по сравнению с этими параметрами для раствора 5 мМ NaCl. Облучение вызывает снижение температуры плавления ДНК и уширение перехода для обеих использованных ионных сил. Отметим, что в растворе 5 мМ NaCl при дозе гамма-облучения 100 Гр определить значение температуры плавления ДНК не представляется возможным, очевидно, вследствие весьма значительного нарушения структуры ДНК, тогда как при той же дозе протонного облучения Т_m определить удается (рис. 1а, 1б). Уширение интервала перехода говорит о повышении гетерогенности структуры ДНК, т.е. о появлении в цепи ДНК участков, сильно различающихся по термостабильности.

Рис. 1.

Дифференциальные кривые плавления ДНК в растворах с ионной силой μ = 5 мМ NaCl (а, б) и μ = 150 мМ NaCl (в, г), облученной гамма-излучением (а, в) и протонным излучением (б, г). Поглощенные дозы в Гр указаны на графиках.

Несколько максимумов на кривой $\frac{{d{{D}_{{260}}}}}{{dT}} = f\left( T \right)$ наблюдается для ДНК, облученной в дозе 100 Гр при μ = 150 мМ NaCl (рис. 1в, 1г) – т.е. различие в термостабильности различных участков ДНК становится еще более резким. В этих условиях можно предположить образование сшивок (как между двумя комплиментарными нитями, так и между удаленными по цепи участками ДНК) в процессе облучения. Вследствие более эффективной экранировки фосфатных групп противоионами раствора, объем клубка ДНК при μ = 150 мМ NaCl примерно в 2 раза меньше, чем при μ = 5 мМ NaCl [14]. Размер мишени с ростом ${{\mu }}$ уменьшается, но плотность ДНК в клубке возрастает, что повышает вероятность образования и сшивок (т.е. сайтов с повышенной по сравнению с нативной ДНК T_m), и ЛМП (т.е. сайтов с пониженной T_m) [8, 15]. Так, например, если появились два близко расположенных однонитевых разрыва в одной из комплиментарных нитей ДНК, то этот участок макромолекулы денатурирует при более низкой температуре [10]. Известно, что ЛМП могут быть результатом как прямого, так и косвенного действия радиации; вероятность их появления возрастает с ростом дозы облучения [2, 8, 15, 16]. Таким образом, можно заключить, что наличие нескольких максимумов на дифференциальной кривой плавления свидетельствует о накоплении в ДНК значительного количества радиационных повреждений – сшивок и ЛМП.

На рис. 2 показаны дозовые зависимости снижения температуры плавления ДНК, облученной протонным и гамма-излучением: ∆T = T_m0 – T_m (где T_m0 – температура плавления нативной ДНК, T_m – температура плавления облученной ДНК). Опыт показывает, что протонное облучение вызывает меньшее падение T_m ДНК, чем гамма-облучение в растворе 150 мМ NaCl при дозах 0–100 Гр и в растворе 5 мМ NaCl при дозах 70–100 Гр.

Рис. 2.

Снижение температуры плавления ДНК, облученной протонным и гамма-излучением в растворах с μ = 5 мМ NaCl (а) и μ = 150 мМ NaCl (б).

На рис. 3 показаны дозовые зависимости гиперхромного эффекта δ в изучаемых системах. В растворе 150 мM NaCl (рис. 3б) гиперхромный эффект монотонно снижается с ростом дозы облучения, причем данные, полученные при протонном и гамма-облучении ложатся на одну зависимость. Однако, в растворе 5 мM NaCl после протонного облучения в дозах 10 и 20 Гр гиперхромизм заметно возрос, и достиг значений, даже превышающих δ нативной ДНК (рис. 3а). Снижение гиперхромизма под действием ионизирующего излучения вполне ожидаемо (см. формулу (1)), и объясняется нарушениями во вторичной структуре ДНК (рост величины $D_{{260}}^{{25^\circ {\text{C}}}}$) и, одновременно, снижением количества хромофоров (уменьшение величины $D_{{260}}^{{95^\circ {\text{C}}}}$). Чем же можно объяснить рост гиперхромного эффекта при дозах 10 и 20 Гр протонного облучения в растворе 5 мМ NaCl (рис. 3а)? Можно предположить, что в этих системах при нагревании до 95°С происходит более полное нарушение стэкинг-взаимодействий между азотистыми основаниями ДНК, чем при тех же условиях в нативной макромолекуле. Это может осуществляться, если нагревание индуцирует не только расхождение комплементарных нитей, но и фрагментацию одиночных нитей [10]. Подобная фрагментация при нагревании может происходить, если в ДНК в результате облучения появились близко расположенные однонитевые разрывы в одной из комплиментарных нитей. Это предположение согласуется с литературными данными о том, что протоны высоких энергий производят как минимум в 2 раза больше однонитевых и примерно в 6 раз больше двунитевых разрывов в цепи ДНК, чем гамма-излучение [16–19]. При дозах протонного облучения больше 40 Гр гиперхромизм ДНК уже не превышает значения δ нативной ДНК (рис. 3а), вероятно, из-за того, что рост δ из-за фрагментации ДНК компенсируется падением δ вследствие нарастания других радиационных эффектов: снижения количества хромофоров и частичной денатурации ДНК. Интересно отметить, что такое аномальное поведение δ наблюдается только в растворе малой ионной силы. В 150 мМ NaCl дозовые зависимости δ монотонны и одинаковы для протонного и гамма-излучения. Это может объясняться разным объемом макромолекул-мишеней в этих системах.

Рис. 3.

Гиперхромный эффект ДНК, облученной протонным и гамма-излучением в растворах с μ = 5 мМ NaCl (а) и μ = 150 мМ NaCl (б).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Полученные данные свидетельствуют о том, что протонное излучение оказывает меньший разрушительный эффект на вторичную структуру ДНК, чем гамма-излучение с той же ЛПЭ и поглощенной дозой. Однако, при протонном облучении более четко наблюдаются признаки ЛМП – близко расположенные однонитевые разрывы в цепи макромолекулы. Распределение дефектов первичной и вторичной структуры в облученной ДНК определяет структура трека и распределение ионизаций и возбужденных молекул на пути ионизирующей частицы, и эти параметры различаются для гамма-излучения и высокоэнергетических протонов. Фотонное излучение характеризуется однородным распределением актов ионизации и возбуждения в облучаемом веществе, и в гамма-облученной ДНК возникают равномерно распределенные по цепи макромолекулы одиночные повреждения. В случае же протонного излучения ионизованные и возбужденные молекулы сосредоточены, в основном, в окрестности прямолинейного трека протона [20]. Этим объясняются ЛМП в цепи ДНК, подвергнутой облучению протонами. Таким образом, протоны с энергией 1 ГэВ индуцируют труднорепарируемые либо нерепарируемые повреждения в ДНК и, следовательно, проявляют более выраженное летальное действие. Можно заключить, что высокоэнергетичные протоны более эффективны в радиационной терапии опухолей, чем гамма-излучение.