Известия РАН. Серия физическая, 2023, T. 87, № 6, стр. 766-772

ВВЕДЕНИЕ

Скэффолды для тканевой инженерии выполняют функцию внеклеточного матрикса, обеспечивая временную поддержку клеток в процессе восстановления натурального внеклеточного матрикса [1]. В настоящее время наибольший интерес для изготовления нано- и микроволоконных скэффолдов представляет электроформование (ЭФ) ввиду большой поверхностной площади на единицу объема материала и контролируемой пористой структуры, обеспечивающей перенос нутриентов и факторов роста [2].

Магнитоактивные имплантаты обеспечивают направленную и контролируемую стимуляцию клеток во внешнем магнитном поле (МП). Комбинация магнитных частиц и пьезоэлектрического полимера предлагает возможность генерировать локальный пьезоэлектрический потенциал на поверхности скэффолда во внешнем МП и, таким образом, стимулировать восстановление тканей [1, 3].

Бактериальный поли-3-оксибуитарат (ПОБ) представляет собой пьезоэлектрический биосовместимый биоразлагаемый полимер [4]. Скэффолды на основе ПОБ способны поддерживать длительную регенерацию ткани ввиду низкой скорости биодеградации [5]. Продукт разложения ПОБ (D-3-гидроксибутановая кислота) входит в состав крови человека, поэтому он нетоксичен и не вызывает воспалительных реакций [6]. Благодаря пьезоэлектрическим свойствам ПОБ способен деформироваться во внешнем электрическом поле или генерировать электрический заряд при механической деформации, обеспечивая электрическую стимуляцию клеток [7]. Пьезоотклик и физико-механические свойства полимерных скэффолдов могут быть усилены путем добавления наполнителей за счет изменения структуры полимера [8–11].

В качестве магнитоактивного агента широко применяются наночастицы магнетита (МНЧ) ввиду их высокой намагниченности и механической прочности, биосовместимости и стабильности в физиологических условиях [12]. Композит на основе магнетита (Fe₃O₄) и восстановленного оксида графена (ВОГ) используется в биомедицине благодаря комбинации высокой намагниченности Fe₃O₄ с проводимостью и большой удельной площадью ВОГ [13].

Таким образом, скэффолды на основе ПОБ и композитного наполнителя Fe₃O₄-ВОГ являются перспективными магнитоактивными биоматериалами. В данном исследовании впервые изучено влияние данного наполнителя и диаметра электроформованных волокон на морфологию, структуру, физико-механические, магнитные и пьезоэлектрические свойства скэффолдов ПОБ.

ЭЛЕКТРОФОРМОВАНИЕ СКЭФФОЛДОВ ПОБ/Fe₃O₄-ВОГ

Скэффолды из чистого ПОБ и композиты ПОБ/Fe₃O₄-ВОГ с разной структурой были получены следующим образом. Для контрольных образцов (из чистого полимера) порошок ПОБ (Sigma-Aldrich) растворяли в хлороформе (CHCl₃, Sigma-Aldrich) в концентрации 6 мас. %. В случае композитов ПОБ/Fe₃O₄-ВОГ наполнитель в количестве 8% от массы полимера диспергировали в хлороформе с помощью ультразвуковой ванны Scientz-IID (Ningbo SCienta Biotechnology Co. Ltd., China) при комнатной температуре в течение 2 ч. Затем 6 мас. % порошка ПОБ добавляли в суспензию Fe₃O₄-ВОГ и растворяли при перемешивании (400 об ⋅ мин^–1) и нагревании (60°С) в течение 2 ч. Полученные растворы подвергали ЭФ при следующих параметрах:

ПОБ_G27 – игла калибра G27 (∅0.2 мм); скорость вращения коллектора 200 об ⋅ мин^–1; вольтаж 5.2 кВ; скорость подачи раствора 0.3 мл ⋅ ч^–1; дистанция от иглы до коллектора 10 см;

ПОБ_G21 – игла калибра G21 (∅0.51 мм); скорость вращения коллектора 200 об ⋅ мин^–1; вольтаж 9.1 кВ; скорость подачи раствора 0.85 мл ⋅ ч^–1; дистанция от иглы до коллектора 14 см;

ПОБ/Fe₃O₄-ВОГ_G27 – игла калибра G27 (∅0.2 мм); скорость вращения коллектора 200 об ⋅ мин^–1; вольтаж 7.2 кВ; скорость подачи раствора 0.32 мл ⋅ ч^–1; дистанция от иглы до коллектора 10 см;

ПОБ/Fe₃O₄-ВОГ_G21 – игла калибра G21 (∅0.51 мм); скорость вращения коллектора 200 об ⋅ мин^–1; вольтаж 10.6 кВ; скорость подачи раствора 0.85 мл ⋅ ч^–1; дистанция от иглы до коллектора 14 см.

ХАРАКТЕРИЗАЦИЯ СКЭФФОЛДОВ ПОБ/Fe₃O₄-ВОГ

Морфологические исследования проводилось с помощью СЭМ Quanta 600 (Thermo Fisher, Japan). На рис. 1 представлены снимки СЭМ и распределения диаметров d изготовленных скэффолдов. В отличие от гладких бездефектных волокон из чистого полимера, волокна композитов ПОБ/Fe₃O₄-ВОГ имеют выступающие агломераты наполнителя Fe₃O₄-ВОГ. Тем не менее, волокна во всех полученных скэффолдах практически не имеют дефектов, что свидетельствует о верном подборе параметров растворов и ЭФ. Диаметры волокон из чистого ПОБ составляют 1.6 ± 0.3 и 2.4 ± 0.5 мкм в случае скэффолдов, полученных иглами с диаметрами 0.2 и 0.51 мм, соответственно. Диаметры волокон в композитах равны 1.7 ± 0.3 и 3.0 ± 0.5 мкм для скэффолдов ПОБ/Fe₃O₄-ВОГ_G27 и ПОБ/Fe₃O₄-ВОГ_G21, соответственно. Увеличение диаметра волокон при использовании иглы с большим диаметром связано с большим объемом раствора, проходящим в единицу времени, а также увеличенным вольтажом. Добавление композитного наполнителя Fe₃O₄-ВОГ не приводит к значительному изменению диаметра волокон.

Рентгенофазовый анализ каждого из исследуемых скэффолдов (рис. 2) выявил рефлексы, характерные орторомбической α-фазе ПОБ, а именно пики при углах 2θ = 13.6°, 16.9°, 22.4°, 25.5°, 26.9° и 19.9° кристаллографических плоскостей (020), (110), (111), (121), (040) и (021), соответственно (ICDD PDF № 00-068-1411). В случае композитных скэффолдов наблюдаются также рефлексы магнетита с шпинельной гранецентрированной решеткой при 30.35°, 35.63°, 43.49°, 53.56°, 57.12° и 62.81°, соответствующие плоскостям (220), (311), (400), (422), (511) и (440), соответственно. При этом рефлексов, соответствующих ВОГ, не обнаружено. Согласно данным табл. 1, введение композитного наполнителя Fe₃O₄-ВОГ в матрицу ПОБ снижает размер кристаллитов полимера в плоскостях (020) и (110). Это объясняется затрудненной кристаллизацией, ограниченной агрегатами наполнителя [14–16]. Помимо этого, в случае композитных скэффолдов обнаружено снижение размеров кристаллитов ПОБ при уменьшении диаметра иглы для ЭФ, что объясняется снижением кристаллизации ПОБ из-за пространственных ограничений (т.е. меньшего диаметра волокон) [17].

Для установления влияния наполнителя Fe₃O₄-ВОГ и диаметра волокон на механические свойства полученных скэффолдов были проведены механические испытания на растяжение (табл. 2). Для этого полоски скэффолдов 8 × 1 см закреплялись плоскими зажимами испытательной машины Instron 3369 (Великобритания) и растягивались со скоростью нагружения 1 мм/мин до разрыва. В результате получены кривые “деформация–напряжение” (рис. 3а), по которым установлены удлинения при разрыве (δ), максимальные прочности на растяжение (σ_max) и модули Юнга (E) чистых и композитных скэффолдов. Значение δ увеличивается с уменьшением диаметра волокон как для чистых, так и композитных скэффолдов (рис. 3б). В случае чистых скэффолдов из ПОБ удлинение увеличивается от 10.0 ± 1.5 до 15.0 ± 3.0%; в случае композитов наблюдается более резкое увеличение данного параметра от 7.8 ± 2.6 до 18.5 ± 5.7%. Помимо этого, значения σ_max для волокон с меньшим диаметром составляют 2.50 ± 0.27 и 1.05 ± 0.18 МПа в случае чистых и композитных скэффолдов, соответственно, что в ~2 раза превышает этот параметр, полученный для волокон с большим диаметром (рис. 3в). Максимальная прочность на растяжение композитных скэффолдов снижается с добавлением наполнителя Fe₃O₄-ВОГ от 1.35 ± 0.10 до 0.49 ± 0.15 МПа и от 2.50 ± 0.27 до 1.05 ± 0.18 МПа для волокон, полученных с помощью игл диаметром 0.2 и 0.51 мм, соответственно. Аналогичное снижение зафиксировано для E композитов (рис. 3г). Ухудшение механических характеристик композитных скэффолдов связано с образованием агрегатов композита Fe₃O₄-ВОГ внутри волокон, наблюдаемых на снимках СЭМ (рис. 1), которые могли выступать как точки концентрации напряжений [18].

Для оценки изменений степени кристалличности (X_c) чистых и композитных волокон различного диаметра была использована дифференциальная сканирующая калориметрия. Из табл. 2 видно, что в случае чистых скэффолдов из ПОБ X_c значительно уменьшается от 58 до 53% с уменьшением диаметра волокон от 2.4 ± 0.5 до 1.6 ± 0.3 мкм. Снижение кристалличности также зафиксировано для композитных скэффолдов с уменьшением диаметра волокон. Согласно уравнению Аврами [19], степень кристалличности можно представить, как возрастающую функцию времени кристаллизации:

где θ_с(t) – объемная доля полимера, кристаллизовавшегося за время t; n – параметр, отражающий индивидуальные особенности роста новых фаз; k – константа скорости кристаллизации. Ранее было показано, что растворитель испаряется значительно быстрее из струи раствора полимера меньшего диаметра [20]. Поэтому время кристаллизации и, следовательно, X_c тонких волокон меньше в сравнении с более толстыми волокнами. Меньшие значения X_c волокон с меньшим диаметром соответствуют большим значениям δ, установленным в ходе механических испытаний (табл. 2).

В процессе ЭФ электрическое поле вызывает выравнивание полимерных цепей, приводящее к высокой молекулярной ориентации и, соответственно, к образованию кристаллической фазы полимера [21]. Поэтому волокна с большим диаметром (ПОБ_G21, ПОБ/Fe₃O₄-ВОГ_G21), полученные с применением более высокого вольтажа, проявляют большую степень ориентации цепей и большую X_c.

Добавление филлера Fe₃O₄-ВОГ приводит к снижению X_c скэффолдов от 58 до 51% и от 53 до 50% для скэффолдов из толстых и тонких волокон, соответственно. Это связано с образованием агрегатов частиц Fe₃O₄ и ВОГ, которые ограничивают мобильность цепей ПОБ, затрудняя кристаллизацию [14–16]. Сниженная X_c композитных скэффолдов (в сравнении со скэффолдами из чистого ПОБ) соответствует меньшим значениям σ_max и E композитов (табл. 2).

Магнитные частицы могут оказывать магнитомеханическую стимуляцию роста клеток при приложении внешнего МП [12]. Поэтому важное значение при разработке магнитных биоматериалов имеют магнитные характеристики, включая намагниченность насыщения σ_s, остаточную намагниченность σ_r и коэрцитивную силу H_c. Магнитные свойства композитного наполнителя и разработанных скэффолдов представлены в табл. 3, а кривые магнитного гистерезиса – на рис. 4. Композитный наполнитель Fe₃O₄-ВОГ обладает высоким значением σ_s, равным 96.27 ± ± 1.42 эме/г. Низкие значения H_c (60 ± 4 Э) и σ_r (3.5 ± 0.2 эме/г) являются характеристиками мягкомагнитного материала. σ_s композитных скэффолдов составляют 6.50 ± 0.39 и 6.83 ± ± 0.41 эме/г для скэффолдов ПОБ/Fe₃O₄-ВОГ_G27 и ПОБ/Fe₃O₄-ВОГ_G21, соответственно. Насколько нам известно, эти значения превышают намагниченность всех альтернативных материалов, описанных в литературе [22–24].

H_c композитных скэффолдов значительно увеличивается по сравнению с наполнителем Fe₃O₄-ВОГ от 60 ± 4 до 160 ± 10 и 113 ± 7 Э для образцов ПОБ/Fe₃O₄-ВОГ_G27 и ПОБ/Fe₃O₄-ВОГ_G21, соответственно. Известно, что H_c зависит от анизотропии размера и формы кристаллитов магнетита, а также от наличия примесей в материале [12]. Повышенная H_c композитных скэффолдов по сравнению с наполнителем свидетельствует о том, что волокна ПОБ препятствуют выравниванию магнитных моментов наполнителя. При сравнении композитных скэффолдов с различными диаметрами волокон стоит отметить значительное увеличение H_c от 113 ± 6.78 до 160 ± 9.60 Э при снижении диаметра волокон от 3.0 ± 0.5 до 1.7 ± 0.3 мкм.

Методом зонда Кельвина было измерено распределение поверхностного потенциала композитных скэффолдов. Установлено, что среднее значение поверхностного электрического потенциала значительно снижается от 0.89 ± 0.034 до 0.65 ± 0.012 эВ при снижении диаметра волокон от 3.0 ± 0.5 до 1.7 ± 0.3 мкм. Ранее было показано значительное увеличение поверхностного электрического потенциала скэффолда ПОБ при добавлении хлопьев ВОГ [25]. Это объяснялось увеличением числа полярных групп C=O на поверхности волокон после добавления ВОГ в полимерную матрицу. В свою очередь, в нашем исследовании методом рентгеновской фотоэлектронной спектроскопии установлено увеличение числа полярных групп C = O на поверхности композитных волокон с большим диаметром (ПОБ/Fe₃O₄-ВОГ_G21) в сравнении с более тонкими волокнами (ПОБ/Fe₃O₄-ВОГ_G27) вследствие большей площади поверхности. Соответственно, поверхностный электрический потенциал волокон ПОБ/Fe₃O₄-ВОГ_G21 больше по сравнению с образцом ПОБ/Fe₃O₄-ВОГ_G27.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Методом ЭФ получены новые скэффолды на основе ПОБ с композитным магнитоактивным наполнителем Fe₃O₄-ВОГ. Выполнено комплексное исследование влияния наполнителя и диаметра волокон на структуру, физико-механические, магнитные и пьезоэлектрические свойства скэффолдов. Диаметр волокон в композитных скэффолдах составляет 1.7 ± 0.3 и 3.0 ± 0.5 мкм для скэффолдов, полученных с помощью игл калибра G27 и G21, соответственно. Обнаружено что уменьшение диаметра иглы от 0.51 до 0.2 мм и добавление наполнителя Fe₃O₄-ВОГ приводит к снижению кристалличности скэффолдов. Кроме того, частицы Fe₃O₄-ВОГ снижают размер кристаллитов в плоскостях (020) и (110) орторомбической α-фазы ПОБ. Уменьшение диаметра волокон повышает пластичность и механическую прочность электроформованных скэффолдов. Значение δ увеличивается от 10 ± 1.5 до 15 ± 3.0% в случае скэффолдов из чистого ПОБ и от 7.8 ± 2.6 до 18.5 ± 5.7% для композитов ПОБ/Fe₃O₄-ВОГ. Скэффолды с тонкими волокнами, полученные иглой G27, обладают σ_max 2.50 ± 0.27 и 1.05 ± 0.18 МПа для чистых и композитных скэффолдов, соответственно, что в ~2 раза превышает σ_max скэффолдов с более толстыми волокнами. Добавление наполнителя Fe₃O₄-ВОГ снижает σ_max скэффолдов ПОБ от 1.35 ± 0.10 до 0.49 ± 0.15 МПа и от 2.50 ± ± 0.27 до 1.05 ± 0.18 МПа в случаях ПОБ/Fe₃O₄-ВОГ_G21 и ПОБ/Fe₃O₄-ВОГ_G27, соответственно. Помимо этого, наблюдается снижение E композитных скэффолдов в сравнении с чистыми. Поверхностный электрический потенциал магнитоактивных скэффолдов ПОБ/Fe₃O₄-ВОГ значительно увеличивается от 0.650 ± 0.012 до 0.890 ± ± 0.034 эВ с увеличением диаметра волокон вследствие большего числа полярных функциональных групп на поверхности волокон. Разработанные скэффолды ПОБ/Fe₃O₄-ВОГ_G21 и ПОБ/Fe₃O₄-ВОГ_G27 обладают высокой σ_s, равной 6.83 ± 0.41 и 6.50 ± 0.39 эме/г, соответственно, что превышает альтернативные разработки, описанные в литературе.

Таким образом, добавление магнитного композита Fe₃O₄-ВОГ не влияет на пьезоотклик, но придает высокие значения намагниченности скэффолдов на основе ПОБ. Нами показано, что физико-механические свойства, кристалличность и поверхностный электрический потенциал скэффолдов можно контролировать, изменяя диаметр волокон. Разработанные скэффолды ПОБ/Fe₃O₄-ВОГ, способные обеспечивать внешнюю механоэлектрическую стимуляцию роста клеток, являются перспективным биоматериалом для инженерии костной ткани.

Исследование проводилось в Томском политехническом университете в рамках Программы развития Томского политехнического университета при финансовой поддержке Министерства науки и высшего образования (грантовое соглашение № 075-15-2021-588 от 01.06.2021) и Российского научного фонда (проект № 20-63-47096; материалы, исследование свойств). Работы проводились с применением оборудования Томского областного центра коллективного пользования Национального исследовательского Томского государственного университета.