Химическая физика, 2021, T. 40, № 2, стр. 11-17

ВВЕДЕНИЕ

Широкое использование цианиновых (полиметиновых) красителей в науке и технике обусловлено уникальным набором спектрально-флуоресцентных и фотохимических свойств, в частности зависимостью их свойств от молекулярного окружения [1]. Это особенно характерно для мезо-замещенных карбоцианиновых красителей, для которых наблюдается подвижное равновесие между цис- и транс-изомерами красителя, которое зависит от полярности среды. При этом в полярных растворителях равновесие сдвинуто в сторону цис-изомера, а в неполярных – в сторону транс-изомера [2]. Спектрально-флуоресцентные и фотохимические свойства цис- и транс-изомеров мезо-замещенных цианинов сильно различаются [2], что дает возможность использовать такие красители в качестве зондов для анализа и изучения различных структурно-организованных сред. В частности, мезо-замещенные карбоцианины были использованы в качестве спектрально-флуоресцентных зондов для биомолекул: ДНК, сывороточных альбуминов, коллагенов, гиалуроновой кислоты, хондроитин-4-сульфата, солей желчных кислот [3–9]; при этом подробно изучались спектрально-флуоресцентные свойства красителей в присутствии биомолекул. Изучены также элементарные фотохимические процессы с участием цианиновых красителей в комплексах с биомолекулами, однако эти работы были посвящены главным образом красителям в комплексах с ДНК и в мицеллах солей желчных кислот [10–13]. Хотя известно, что ряд анионных полиметиновых красителей образует нековалентные комплексы с сывороточными альбуминами с высокими константами связывания [14], фотохимические процессы в таких комплексах ранее не изучались.

В настоящей работе методом импульсного фотолиза изучены элементарные фотохимические процессы в молекулах мезо-замещенных анионных тиакарбоцианиновых красителей в комплексах с сывороточными альбуминами – человеческим и бычьим (САЧ и САБ соответственно). При этом изучались образование и гибель фотоизомеров и триплетного состояния красителей, а также тушение триплетного состояния кислородом. Были взяты анионные цианиновые красители, образующие с альбуминами комплексы с высокими константами связывания [14, 15]: 3,3'-ди(γ-сульфопропил)-4,5,4',5'-дибензо-9-этилтиакарбоцианин-бетаин (ДЭЦ), 3,3'-ди(γ-сульфопропил)-4,5,4',5'-дибензо-9-метилтиакарбоцианин-бетаин (ДМЦ), 3,3'-ди(γ-сульфопропил)-5,5'-диметокси-9-этилтиакарбоцианин-бетаин (ДМЭЦ) и 3,3'-ди-(γ-сульфопропил)-5,6,5',6'-ди-(метилендиокси)-9-этилтиакарбоцианин-бетаин (ДОЭЦ). Для сравнения изучалась также фотохимия данных красителей в растворах (в воде и диоксане).

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Красители ДЭЦ, ДМЦ, ДМЭЦ и ДОЭЦ предоставлены проф. Б.И. Шапиро (НИИ “Химфотопроект”, Москва); их чистота проверена методом тонкослойной хроматографии. Сывороточные альбумины (САЧ и САБ) приобретены у компании Sigma-Aldrich (USA). В качестве растворителей использовались: дистиллированная вода, диметилсульфоксид, диоксан (х.ч.). Для изучения фотохимии красителей в присутствии альбуминов были взяты концентрации альбуминов, достаточные для эффективного связывания красителей в комплекс с альбуминами. Для приготовления раствора красителей в диоксане предварительно готовили концентрированный раствор красителя в диметилсульфоксиде, затем его небольшой объем растворяли в диоксане (разбавление 1 : 1000, в случае ДМЦ и ДЭЦ – 1 : 16). Переход красителей в транс-форму в диоксане контролировали по спектру поглощения: возникала длинноволновая полоса поглощения с максимумом при 603 нм для ДЭЦ [15], 595 нм – для ДМЦ, 585 нм – для ДМЭЦ, 600 нм для – ДОЭЦ. Спектры поглощения регистрировали на спектрофотометре СФ-2000 (Россия). Эксперименты по импульсному фотолизу проводили на установке с возбуждением светом ксеноновой лампы типа ИФП-5000 (длительность вспышки на полувысоте – 10 мкс, энергия разряда – 50 Дж), использовали кварцевую кювету с длиной оптического пути, равной 20 см. Фотовозбуждение красителей осуществлялось через светофильтры ЗС-8. Освобождение растворов от кислорода при регистрации триплет-триплетного поглощения проводили на вакуумной установке. При определении констант скорости тушения триплетного состояния красителей кислородом изменяли давление воздуха в равновесии с раствором красителя в кювете, которое измеряли с помощью манометрической установки и использовали для определения концентрации кислорода в растворе [16] (по закону Генри с учетом парциального давления растворителя – воды). Все эксперименты выполнены при температуре (22 ± 2) °С.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Одно из основных фотохимических свойств цианиновых красителей – фотоизомеризация (в результате поворота относительно одной из С–С-связей полиметиновой цепи) при фотовозбуждении, за которым следует обратная темновая изомеризация фотоизомера – превращение в исходный изомер красителя. Процесс протекает через короткоживущее S₁-состояние красителя (время жизни < 1 нс), поэтому кислород воздуха на фотоизомеризацию практически не влияет. Вследствие стерического влияния мезо-заместителя изучаемые красители в воде и других полярных растворителях находятся главным образом в виде цис-изомеров [2, 9, 15]. Как правило, мезо-замещенные тиакарбоцианиновые красители в форме цис-изомеров не фотоизомеризуются [2]. В соответствии с этим при импульсном фотолизе изучаемых красителей в водных растворах сигналы фотоизомеров не наблюдались (для ДЭЦ см. также [13]). Однако в неполярном растворителе – диоксане, где красители находятся в виде транс-изомеров [2, 9, 15], в присутствии воздуха наблюдаются сигналы, характерные для образования и гибели фотоизомеров красителей: отрицательное поглощение (выцветание) в области стационарного спектра поглощения транс-изомера красителя (λ_max = 585–600 нм) и положительное поглощение в более коротковолновой области (< 560–570 нм). Это указывает на расходование исходного транс-изомера в результате фотоизомеризации в цис-изомер и последующего возврата транс-изомера вследствие обратной темновой изомеризации образовавшегося цис-фотоизомера (дифференциальные спектры и кинетические кривые приведены на рис. 1):

Рис. 1.

Дифференциальные спектры поглощения фотоизомеров, полученные при импульсном фотолизе воздушно-насыщенных растворов красителей ДЭЦ (1), ДМЦ (2), ДОЭЦ (3) и ДМЭЦ (4) ((1–2) ⋅ 10^–6 моль/л) в диоксане через 70 мкс после появления переднего фронта вспышки; на вставках – кинетические кривые гибели фотоизомера ДМЦ при λ = 570 и 595 нм и их экспоненциальные аппроксимации.

где Кр – молекула красителя в форме транс- или цис-изомера в основном (S₀) или возбужденном (S₁) синглетном состоянии; k_i = 1/τ_i – константа скорости обратной цис-транс-изомеризации (τ_i – время жизни фотоизомера). Времена жизни цис-фотоизомеров изученных красителей близки и составляют 0.25–0.35 мс. Эти величины гораздо меньше, чем для цис-фотоизомера красителя 3,3'-диэтилтиакарбоцианина (DTC), не имеющего мезо-заместителя (2–7 мс в различных растворителях [17]), что можно объяснить понижением изомеризационного барьера вследствие стерического влияния мезо-заместителя, приводящего к искажению плоской структуры цис-изомера красителя.

При импульсном фотолизе красителей в растворах (в воде и диоксане) в отсутствие кислорода не обнаружено сигналов помимо вышеописанных сигналов фотоизомеров в диоксане, что указывает на отсутствие интеркомбинационной конверсии красителей (в виде как цис-, так и транс-изомеров) в триплетное состояние при прямом фотовозбуждении (для ДЭЦ см. также [13]). В то же время в водном растворе в присутствии САЧ и САБ данные красители, связываясь в нековалентные комплексы с альбуминами, по крайней мере частично, переходят из цис-изомера (в мономерной и димерной форме) в форму транс-мономера, что можно наблюдать по появлению в спектре поглощения длинноволновой полосы (или плеча) с максимумом при 585–610 нм и росту интенсивности флуоресценции [15]. При импульсном фотолизе таких растворов в присутствии воздуха сигналов, которые можно было бы отнести к образованию фотоизомеров, не наблюдается, а в отсутствие воздуха регистрируются сигналы поглощения в длинноволновой области (> 600 нм). Тушение сигналов кислородом, а также сопоставление сигналов для ДЭЦ и ДМЦ с сигналами, наблюдавшимися ранее для триплетного состояния ДЭЦ в присутствии солей желчных кислот [13], а для ДМЭЦ и ДОЭЦ – с сигналами триплетного состояния других мезо-замещенных цианинов в присутствии биомолекул [12, 13], позволяют приписать данные сигналы образованию триплетного состояния красителей в результате интеркомбинационной конверсии S₁ → T. Образование и гибель красителей в триплетном состоянии (путем интеркомбинационной конверсии T → S₀) можно описать следующей схемой:

где k_T = 1/τ_T – константа скорости интеркомбинационной конверсии T → S₀; τ_T – время жизни красителя в триплетном состоянии. Дифференциальные спектры триплет-триплетного поглощения красителей в присутствии САЧ и САБ приведены на рис. 2.

Рис. 2.

Дифференциальные спектры поглощения триплетных состояний: а – ДЭЦ (1, 2) и ДМЭЦ (3, 4), б – ДМЦ (1, 2) и ДОЭЦ (3, 4) ((5–8) ⋅ 10^–6 моль/л) в водном растворе в присутствии САЧ (1, 3) или САБ (2, 4) (5 ⋅ 10^–5 моль/л) через 70 мкс после появления переднего фронта вспышки.

Усиление интеркомбинационной конверсии в триплетное состояние наблюдалось ранее при импульсном фотолизе мезо-замещенных тиакарбоцианинов 3,3',9-триэтилтиакарбоцианина (ТЭТЦ) и 3,3'-диэтил-9-метилтиакарбоцианина (ДЭМТЦ) в комплексе с ДНК [18, 19], а также 3,3',9-триметилтиакарбоцианина (Cyan 2) с ДНК и хондроитин-4-сульфатом [12]. Аналогичный эффект наблюдался при связывании ДЭЦ и Cyan 2 с мицеллами солей желчных кислот [13]. Рост квантового выхода в триплетное состояние для вышеперечисленных красителей в присутствии биомолекул, так же как и рост интенсивности флуоресценции, объяснялся подавлением конкурирующих процессов безызлучательного рассеяния (путем внутримолекулярных вращений и колебаний) энергии возбуждения состояния S₁ вследствие повышения жесткости молекулы красителя при ее связывании с биомолекулами [10, 11, 13]. Очевидно, аналогичным образом объясняется и рост интеркомбинационной конверсии в триплетное состояние при связывании красителей ДЭЦ, ДМЦ, ДМЭЦ и ДОЭЦ с САЧ и САБ. Повышение жесткости молекул красителей в комплексах с альбуминами проявляется также в отсутствии фотоизомеризации красителей, связанных с альбуминами, хотя транс-изомеры красителей в растворе диоксана фотоизомеризуются.

Отметим следующие особенности генерации триплетного состояния при импульсном фотолизе изучаемых красителей в комплексах с альбуминами.

1. Дифференциальные спектры триплет-триплетного поглощения красителей ДЭЦ и ДМЦ в комплексах с САЧ и САБ качественно сходны (см. рис. 2а), хотя красители взаимодействуют с альбуминами по-разному: эффективно взаимодействуют с САЧ и гораздо менее эффективно – с САБ [6]. При этом ДЭЦ и ДМЦ в комплексе с САЧ практически полностью переходят в транс-изомер, в то время как в комплексе с САБ красители находятся в виде транс- и цис-изомеров (при этом в случае ДЭЦ цис-изомер является основным в комплексе [6]). Спектры триплет-триплетного поглощения транс- и цис-изомеров ДЭЦ близки [13]; то же можно предположить и для его близкого аналога ДМЦ. Следовательно, можно считать, что в интеркомбинационной конверсии в триплетное состояние участвуют оба изомера ДЭЦ и ДМЦ в комплексах с альбуминами.

2. В случае красителей ДМЭЦ и ДОЭЦ дифференциальные спектры триплет-триплетного поглощения их комплексов с САЧ и САБ несколько различаются: спектры для комплексов с САБ более длинноволновые, чем для комплексов с САЧ (рис. 2). ДМЭЦ, как ДЭЦ и ДМЦ, в комплексе с САЧ находится главным образом в виде транс-изомера, тогда как в комплексе с САБ – в виде обоих (транс и цис) изомеров. Поэтому несовпадение спектров триплет-триплетного поглощения для ДМЭЦ можно объяснить различием спектров триплетного состояния транс- и цис-изомеров для этого красителя. Краситель ДОЭЦ в комплексах с обоими альбуминами практически полностью переходит в транс-изомер, но его спектры поглощения в комплексах с САЧ и САБ несколько различаются и имеют максимумы при 603 и 587 нм соответственно. При этом спектр поглощения ДОЭЦ в комплексе с САЧ соответствует спектру ДОЭЦ в диоксане (транс-изомер) с максимумом при 603 нм. Можно предположить, что ДОЭЦ в комплексе с САЧ имеет обычную транс-конфигурацию, в то время как коротковолновый сдвиг спектра поглощения ДОЭЦ в комплексе с САБ по сравнению с наблюдаемым в диоксане вызван несколько искаженной формой транс-изомера. Такое искажение конфигурации может являться причиной длинноволнового сдвига спектра триплет-триплетного поглощения красителя в комплексе с САБ.

3. Кинетические кривые гибели триплетного состояния исследованных красителей в ряде случаев несколько отклоняются от моноэкспоненциальных и хорошо аппроксимируются суммой двух экспонент, что особенно ярко проявляется для комплексов красителей ДЭЦ, ДМЦ и ДМЭЦ с САБ (рис. 3). Это также можно объяснить одновременным связыванием транс- и цис-изомеров красителей с альбумином и, соответственно, наложением кинетик гибели триплетных состояний обоих изомеров при регистрации. Следует заметить, что в случае комплексов ДЭЦ, ДМЦ и ДМЭЦ с САЧ, когда красители практически полностью переходят в единственную форму – транс-изомер, кинетики гибели триплетного состояния хорошо описываются моноэкспоненциальными зависимостями. Усредненные (аппроксимированные одной экспонентой) времена жизни триплетного состояния красителей в комплексах с альбуминами находятся в интервале 0.35–1.2 мс (табл. 1).

Рис. 3.

Кинетическая кривая гибели триплетного состояния ДЭЦ в водном растворе в присутствии САБ (5 ⋅ 10^–5 моль/л) и ее экспоненциальные компоненты (1 и 2) (длина волны регистрации – 800 нм).

Были проведены эксперименты по тушению триплетного состояния красителей кислородом воздуха. Из наклона кривых линейных зависимостей константы скорости гибели триплетного состояния от концентрации кислорода в растворе определены константы скорости тушения триплетного состояния изучаемых красителей молекулярным кислородом k_q:

где k_T0 – усредненная константа скорости гибели триплетного состояния в отсутствие тушителя, k_T – константа скорости гибели триплетного состояния в присутствии тушителя (рис. 4).

Рис. 4.

Кривые линейных зависимостей из уравнения (3) тушения кислородом триплетных состояний ДЭЦ (1) и ДМЭЦ (2) в присутствии САБ и ДОЭЦ в присутствии САЧ (3), из которых были определены константы скорости тушения k_q = 1.7 ⋅ 10⁸, 1.5 ⋅ 10⁸ и 2.4 ⋅ 10⁸ л ⋅ моль^–1 ⋅ с^–1 соответственно; концентрации альбуминов – 5 ⋅ 10^–5 моль/л.

Значения k_q оказались в интервале (1.3–2.5) ⋅ ⋅ 10⁸ л ⋅ моль^–1 ⋅ с^–1, что гораздо ниже, чем у константы скорости диффузионно-контролируемого тушения триплетного состояния красителя кислородом (порядка 1.2 ⋅ 10⁹ л ⋅ моль^–1 ⋅ с^–1 [18]). Низкая величина k_q = 3 ⋅ 10⁸ л ⋅ моль^–1 ⋅ с^–1, близкая к значениям, полученным в настоящей работе, наблюдалась ранее при тушении кислородом триплетного состояния красителя DTC в комплексе с ДНК, что объяснялось затрудненным доступом кислорода к молекулам красителя в комплексе [18, 19]. Аналогичным образом, вероятно, можно объяснить низкие значения констант k_q для изучаемых красителей в комплексах с альбуминами.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

При импульсном фотолизе воздушно-насыщенных растворов красителей ДЭЦ, ДМЦ, ДМЭЦ и ДОЭЦ в диоксане наблюдаются сигналы, обусловленные фотоизомеризацией транс-изомеров красителей и обратной темновой изомеризацией образующихся цис-фотоизомеров. Времена жизни фотоизомеров красителей близки и составляют 0.25–0.35 мс. При импульсном фотолизе водных растворов данных красителей в присутствии САЧ и САБ в отсутствие кислорода наблюдается интеркомбинационная конверсия в триплетное состояние красителей и последующий возврат в исходное основное синглетное состояние. Фотоизомеризации красителей при этом не наблюдается. Предполагается, что в интеркомбинационной конверсии в триплетное состояние участвуют как транс-, так и цис-изомеры красителей в комплексах с альбуминами. Кинетические кривые гибели триплетного состояния ДЭЦ, ДМЦ и ДМЭЦ в комплексах с САБ хорошо описываются суммой двух экспонент, что можно объяснить одновременным связыванием транс- и цис-изомеров красителей с альбумином. Определены константы скорости тушения триплетного состояния красителей молекулярным кислородом, которые оказались гораздо ниже константы скорости диффузионно-контролируемого тушения, что, вероятно, обусловлено затрудненным доступом кислорода к молекуле красителя в комплексе с альбумином.

Автор выражает благодарность проф. Б.И. Шапиро за предоставление полиметиновых красителей.

Работа выполнена в рамках госзадания № 001201253314 (ИБХФ РАН).