Кинетика и катализ, 2023, T. 64, № 1, стр. 78-85
Супрамолекулярные катализаторы радикального распада гидропероксидов на основе производных холина
Н. В. Потапова a, *, О. Т. Касаикина a, М. П. Березин b, И. Г. Плащина c, А. А. Гулин a
a ФГБУН Федеральный исследовательский центр химической физики им. Н.Н. Семенова РАН
119991 Москва, ул. Косыгина, 4, корп. 1, Россия
b ФГБУН Институт проблем химической физики РАН
142432 Черноголовка, просп. Акад. Семенова, 1, Россия
c ФГБУН Институт биохимической физики им. Н.М. Эмануэля РАН
119334 Москва, ул. Косыгина, 4, Россия
* E-mail: pot.natalia2010@yandex.ru
Поступила в редакцию 12.07.2022
После доработки 29.09.2022
Принята к публикации 30.09.2022
- EDN: KHDOZU
- DOI: 10.31857/S0453881123010057
Аннотация
Исследовано влияние природных четвертичных аммониевых соединений (QAC) холина (Ch) и его производных — ацетилхолина (AСh) и L-карнитина (LCh), содержащих катион тетраалкиламмония (СН3)3RN+, на радикальный распад гидропероксидов (ROOH). В смесях AСh и Ch с ROOH в среде хлорбензола образуются смешанные супрамолекулярные наноагрегаты, и имеет место ускоренный распад ROOH на радикалы; скорости образования радикалов, измеренные методом ингибиторов, уменьшаются в ряду ACh > Ch $ \gg $ LCh. Иммобилизованные на микрокристаллической целлюлозе AСh и Ch сохраняют способность катализировать радикальный распад ROOH и инициируют с поверхности полимеризацию стирола, содержащего ROOH. LСh, адсорбированный на целлюлозе, не оказывает влияния на распад ROOH и скорость полимеризации. Методом сканирующей электронной микроскопии (СЭМ) показано, что адсорбированные на кремниевой пластинке AСh и Ch ускоряют радикальный распад ROOH и инициируют окислительную конденсацию яичного фосфатидилхолина на поверхности пластинки, тогда как адсорбированный LCh не влияет на распад ROOH. LCh, в отличие от AСh и Ch, является внутренней солью, в которой катион R4N+ нейтрализуется собственным карбокси-анионом, т.е. LCh не имеет внешнего противоиона и, вероятно, по этой причине отличается по механизму адсорбции и взаимодействия с ROOH от ACh и Ch.
ВВЕДЕНИЕ
Производные холина (Ch) ацетилхолин (ACh) и L-карнитин (LCh), содержащие катион тетраалкиламмония (СН3)3RN+, можно отнести к большому классу четвертичных аммониевых соединений (QAC), катионных биоцидов с широким спектром антимикробной активности [1]. Анализ бактерицидного действия сочетаний многих QAC с различными носителями, представленный в обзорах [2–4], показал, что объединение фрагментов QAC с полимерными материалами представляет собой одну из наиболее перспективных стратегий получения антимикробных биоматериалов. Однако отмечается, что молекулярный механизм биоцидных эффектов до конца не изучен. Ранее [5–7] на примере ряда катионных поверхностно-активных веществ (кПАВ), относящихся к QAC, нами было установлено, что кПАВ каталитически ускоряют распад на радикалы гидропероксидов (ROOH), первичных продуктов окисления многих соединений. Это явление обусловлено образованием супрамолекулярных структур – смешанных мицелл кПАВ–ROOH, в которых облегчается гомолитический распад пероксидной связи. Способность кПАВ катализировать распад ROOH и генерировать радикалы сохраняется при их иммобилизации на целлюлозе и монтмориллоните. В [8–11] было продемонстрировано, что в органических средах ацетилхолин (ACh), известный нейромедиатор, подобно кПАВ ускоряет окисление углеводородов и липидов, и что ключевая реакция, определяющая влияние ACh на скорость окисления, – это каталитическое разложение ROOH в смешанных супрамолекулярных наноагрегатах с образованием радикалов:
Эндогенные QAC, производные холина, синтезируются в живых организмах и играют важную роль в их функционировании [12]. Холин (Ch, 2-гидроксиэтилтриметиламмония, [(CH3)3N+CH2CH2OH] X−) является предшественником ацетилхолина [13] и способствует нейропластичности нервной системы. Допустимый верхний уровень потребления Ch для взрослых составляет 3500 мг в день.
Ацетилхолин (ACh, [(CH3)3N+CH2CH2O (O)CCH3] X−, N-триметил-2-аминоэтанола ацетат,) – это ключевой медиатор в центральной и периферической нервной системах, он играет решающую роль в обучении, памяти, вегетативном контроле и мышечных сокращениях [14]. С возрастом биосинтез ACh замедляется, и его сопровождают многие нейродегенеративные заболевания. Биомедицинские исследования последних лет показывают, что ACh синтезируется и функционирует не только в нейрональной системе, но принимает участие в других физиологических и патологических процессах. Способность продуцировать ACh обнаружена для Т-клеток, реагирующих на вирусную инфекцию [15], однако молекулярный механизм включения ACh в иммунную защиту пока не обсуждается.
L-карнитин (LCh) представляет собой небелковую β-гидрокси-γ-триметиламиномасляную кислоту (CH3)3N+CH2CH(OH)–CH2–C(O)O–), которая синтезируется из незаменимых аминокислот лизина и метионина [16]. LCh способствует β-окислению длинноцепочечных жирных кислот, участвует в метаболизме аминокислот с разветвленной цепью и стабилизирует клеточные мембраны [16, 17]. В работах [18, 19] показано, что модификация глинистых минералов L-карнитином специфически повышает адсорбционные свойства материала и может быть полезной стратегией для повышения селективности органоглин при удалении определенных органических токсинов.
В настоящей работе исследовано влияние природных QAC, производных холина, на распад гидропероксидов третбутила (HTB) и кумила (HC) (схема 1 ), проведено сопоставление размерных характеристик микроагрегатов, образованных AСh, Ch и LCh с гидропероксидами в растворе хлорбензола, и скоростей генерирования радикалов в этих системах. Рассмотрена возможность производных холина, будучи иммобилизованными на твердом носителе, в сочетании с ROOH выступать в качестве гетерогенного катализатора радикального распада гидропероксидов на поверхности носителя.
Схема 1 . Производные холина, гидропероксиды и кверцетин.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Ацетилхолин хлорид (ACh), яичный фосфатидилхолин (РСh), гидропероксид третбутила (HTB), гидропероксид кумила (HC) и кверцетин (Q) (все “Fluka”), холин хлорид (Ch), (“PanReac AppliChem”), L-карнитин (LCh) (“Merck”), хлорбензол (“Sigma-Aldrich”) использовали без дополнительной очистки.
Растворы гидропероксидов (20 мМ) готовили в хлорбензоле, концентрацию пероксида определяли методом йодометрического титрования. Базовые растворы ACh, Ch, LCh (2 × 10–2 М) готовили в смеси хлороформ : метанол (2 : 1).
Скорость образования радикалов при каталитическом распаде гидропероксидов в смешанных агрегатах с производными холина (Wi) определяли методом ингибиторов с применением в качестве акцептора радикалов кверцетина, концентрацию которого в ходе реакции контролировали спектрофотометрически. Реакцию проводили непосредственно в кварцевой кювете (1 см) однолучевого спектрофотометра СФ-2000 (“ОКБ Спектр”) при комнатной температуре (22°С). В кювете сравнения содержался раствор гидропероксида (20 мМ) и производного холина (1 мМ) в хлорбензоле, что близко к критической концентрации мицеллообразования (ККМ) для ACh в присутствии ROOH [12]. Затем добавляли кверцетин и проводили измерение. Коэффициент молярной экстинкции для Q при максимуме поглощения 374 нм в хлорбензоле ε = 3 × 104 л моль–1 см–1, коэффициент ингибирования f = 2. Погрешность определения скорости инициирования не превышала 15%. Пример изменения спектров поглощения Q в ходе реакции и кинетических кривых уменьшения оптической плотности в максимуме поглощения при λmax = 374 нм представлен на рис. 1а и 1б.
Средний размер микроагрегатов производное холина–гидропероксид определяли методом динамического светорассеяния (ДСР) с помощью анализатора Zetasizer NanoZS (“Malvern Instruments”, Великобритания), оснащенном 4 мВт He–Ne-лазером с длиной волны 633 нм, аналогично [11].
Путем адсорбции производных холина из их растворов в хлороформе (0.12 М) на поверхность микрокристаллической целлюлозы были получены потенциальные катализаторы радикального распада гидропероксидов. Их способность генерировать радикалы и инициировать радикальную полимеризацию исследовали методом изотермической калориметрии на приборе ДАК-1-1 (“ЭЗАН”, Россия) в модельной реакции радикальной полимеризации стирола при 60°С. Ампулы для калориметрических измерений, заполненные реакционной смесью, вакуумировали (давление не выше 10–4 Па) и запаивали. Погрешность определения скорости полимеризации не превышала 15%.
Возможность окислительной конденсации ненасыщенных липидов (яичного фосфатидилхолина) в присутствии гидропероксидов на поверхности кремниевых пластинок с адсорбированными ACh, Ch, LCh изучали методом сканирующей электронной микроскопии (СЭМ) на приборе Prisma E (“Thermo Scientific”, Чехия). Предварительно на пластинки напыляли 10 нм слой золота с помощью установки Quorum Q150R (“Quorum Technologies Ltd”, Великобритания).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Исследование размерных характеристик систем, образующихся при смешении производных холина с гидропероксидами кумила (рис. 2) и трет-бутила в хлорбензоле, методом ДСР показало, что во всех случаях имеет место образование наночастиц. Ch и AСh диспергируются только в сочетании с ROOH (рис. 2в, 2г), а LCh способен и в отсутствие ROOH (рис. 2а) образовывать микроагрегаты с характерным размером 100 нм, который практически не изменяется при добавлении ROOH (рис. 2б).
Скорости образования радикалов (Wi), измеренные методом ингибиторов по скорости расходования кверцетина, представлены в табл. 1. Видно, что при одинаковых начальных концентрациях реагентов скорость генерирования радикалов при распаде обоих гидропероксидов уменьшается в ряду: ACh > Ch $ \gg $ LCh.
Согласно [20], инициирование радикалов при участии гидропероксидов в жидкой фазе происходит преимущественно в реакциях второго порядка (I), которые протекают с меньшими энергиями активации по сравнению с мономолекулярным распадом пероксидной связи:
где Y может представлять ROOH, RH или >C=C<. Бимолекулярный распад 0.02 М НС (Y = = ROOH) с константой скорости k = 7.2 × × 104 exp(–81000/RT) M–1 c–1 [20] при 22°С может генерировать радикалы со скоростью Wi = 1.3 × × 10–13 М/с. Таким образом, ACh и Ch существенно увеличивают скорость радикального распада гидропероксида.Стоит отметить, что LCh практически не диспергируется в н-декане даже в присутствии гидропероксида, тогда как Ch, подобно ACh, совместно с ROOH образуют наноагрегаты размером 150–200 нм. Из табл. 1 видно, что в сочетании с HC все производные холина демонстрируют более высокие значения Wi по сравнению с HTB. В работе [11] было проведено детальное сопоставление Wi в смесях AСh с HC и HTB в н-декане и хлорбензоле при смешении реагентов и изменений Wi с течением времени, которое показало, что Wi относительно меньше в ароматическом растворителе. При смешении реагентов Wi было больше в системе ACh–HC, но в течение недели в этой системе происходило медленное уменьшение Wi, а в системе AСh–HTB, наоборот, имело место возрастание Wi в несколько раз. Все результаты, полученные для производных холина, согласуются с представлениями о катион-π-взаимодействии катионов R4N+ с ароматическими фрагментами в биологических сайтах связывания [21–23]: ароматические фрагменты в хлорбензоле и в гидропероксиде кумила способствуют связыванию с R4N+, но нарушают ориентацию, оптимальную для радикального распада гидропероксидов.
L-карнитин, в отличие от других производных холина, является внутренней солью, в которой аммонийный катион R4N+ нейтрализуется собственным карбоксильным анионом, т.е. LCh не требует внешнего противоиона и, очевидно, отличается от AСh и Сh по механизму формирования микроагрегатов с ROOH. Вероятно, LCh образует структуры, труднодоступные для включения ROOH, что отражается в величине скорости инициирования радикалов.
Ранее [11] нами было показано, что ACh, адсорбированный на твердой поверхности, сохраняет способность каталитически ускорять радикальный распад гидропероксидов и инициировать радикально-цепные процессы окисления и полимеризации. Гидрофильные производные холина хемосорбируются на целлюлозе (табл. 2), с которой они могут связываться не только как R4N+, но и за счет водородных связей. Гетерогенные катализаторы, полученные путем хемосорбции Ch, AСh и LСh на микрокристаллической целлюлозе, были испытаны в качестве катализаторов распада HC в модельной реакции радикальной полимеризации стирола. На рис. 3а, 3б представлены кинетические кривые конверсии и приведенной скорости полимеризации (W/[M], где М – мономер) в радикальной полимеризации стирола в присутствии 50 мМ HC и 4 мас. % катализаторов ACh/Cel, Ch/Cel и LCh/Cel при 60°С. Видно, что добавки катализаторов ACh/Cel и Ch/Cel увеличивают начальные скорости полимеризации, а LCh/Cel практически не оказывает действия на начальную скорость и конверсию стирола. Влияние LCh проявляется только в 5%-ном снижении максимальной приведенной скорости (рис. 3б, кривая 3).
Начальная скорость полимеризации в присутствии ACh/Cel и Ch/Cel выше в ~1.33 раза по сравнению с полимеризацией в отсутствие катализатора. На кривых зависимости W/[M] от конверсии (рис. 3б) наблюдаются 2 максимума: первый при конверсии 0.25, второй – 0.74–0.79. Если второй максимум связан с гель-эффектом и дальнейшим падением скорости в результате квадратичного обрыва цепи, то первый обусловлен, вероятно, дополнительным гетерогенным инициированием с поверхности твердого носителя с иммобилизованными AСh и Ch и дальнейшим падением скорости за счет экранирования макромолекулами и продолжением полимеризации в объеме, которой соответствует кривая без катализатора (1).
Согласно теории, уравнение для скорости радикальной полимеризации при небольших конверсиях имеет вид [20, 24]:
где Wi – скорость инициирования, a = kp/(2kt)0.5 – отношение констант скорости роста (kp) и обрыва (kt) цепи, которое определяется активностью мономера (М) и ведущего цепную реакцию макрорадикала. Как следует из уравнения (1), наряду с Wi параметр a в значительной степени определяет величину скорости полимеризации. Для стирола при 60°С a = 0.021 (л моль–1 с–1)0.5 [24], и скорость инициирования можно вычислить по уравнению (2):Несмотря на то что Ch и LCh лучше адсорбируются на поверхности твердого носителя, измерения скорости полимеризации и оценка скорости инициирования, полученные в присутствии гетерогенных катализаторов, показали: Ch и ACh близки по активности в генерировании радикалов, а иммобилизованный LCh практически не оказывает каталитического действия на распад ROOH. Скорость полимеризации в присутствии LCh/Cel очень близка к скорости полимеризации, инициированной только термическим распадом НС. Эти данные свидетельствуют о различиях в механизме адсорбции LCh в сравнении с ACh и Ch. Возможно, LCh образует сетку на поверхности порошка, недоступную для гидропероксида, и поэтому не влияет на его распад.
Сходные результаты были получены при изучении инициирования окислительной конденсации ненасыщенных липидов на плоской поверхности кремниевых пластинок с адсорбционным монослоем производных холина (рис. 4).
Такие пластинки с иммобилизованными на них ACh, Ch и LCh погружали на 2 ч в хлороформный раствор НС (20 мМ) и ненасыщенного липида – яичного фосфатидилхолина (РСh, 1 мМ), в состав которого входит около 60% остатков линолевой кислоты. Анализ методом сканирующей электронной микроскопии показал, что в среде, содержащей РСh и НС, на поверхности пластинок, предварительно обработанных холином и ацетилхолином, выросли “холмики” сшитых фосфолипидов (рис. 4а, 4б), а на пластинке с иммобилизованным L-карнитином “холмики” не обнаружены (рис. 4в). Эти результаты позволяют предположить, что окислительная полимеризация ненасыщенных липидов и липопротеинов на адсорбционных слоях ACh и Ch в условиях окислительного стресса, когда в крови повышается содержание пероксидов и других активных форм кислорода, может приводить к зарождению и развитию атеросклероза, и эксперименты с окислительной конденсацией фосфатидилхолина в присутствии гидропероксида на поверхности кремниевой пластинки с хемосорбированными ACh и Ch можно рассматривать как первый шаг в моделировании атеросклероза.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Полученные данные свидетельствуют о способности Сh и ACh катализировать распад ROOH на радикалы в смешанных супрамолекулярных наноагрегатах, образующихся в органических средах, и при адсорбции на целлюлозе и других поверхностях с отрицательным зарядом. Возможно, генерирование радикалов при взаимодействии QAC с гидропероксидами и последующие радикальные реакции в условиях окислительного стресса и стимулирующие окислительный стресс являются одним из механизмов бактерицидного действия QAC. Использование нетоксичных QAC холина и/или ацетилхолина в сочетании с гидропероксидами в качестве инициаторов радикалов открывает пути к получению интересных полимерных композитов.
LCh является внутренней солью и, в отличие от AСh и Сh, не требует наличия противоионов. LCh и в отсутствие ROOH способен в среде хлорбензола образовывать наноагрегаты (100 нм). LCh представляет собой менее активный катализатор радикального распада ROOH в органических средах и практически не влияет на распад ROOH при иммобилизации на твердом носителе. Вероятно, благодаря этому свойству именно LCh стабилизирует клеточные мембраны [16, 17] и повышает адсорбционные свойства и селективность органоглин, отмеченные в [18, 19], при удалении определенных органических токсинов.
Список литературы
Paulson D.S. // American Chemical Society: Washington, DC, USA, 2007. V. 967. P. 124.
Gerba C.P. // Appl. Env. Microbiol. 2015. V. 81. P. 464.
Jia Y., Niu L., MaS., Li J., Tay F.R., Chen J. // Progr. Polymer Sci. 2017. V. 71. P. 53. https://doi.org/10.1016/j.progpolymsci.2017.03.0013
Vereshchagin A.N., Frolov N.A., Egorova K.S., Seitkalieva M.M., Ananikov V.P. // Int. J. Mol. Sci. 2021. V. 22. P. 6793. https://doi.org/10.3390/ijms22136793
Карташева З.С., Максимова Т.В., Сирота Т.В., Коверзанова Е.В., Касаикина О.Т. // Нефтехимия. 1997. Т. 37. № 3. С. 249.
Касаикина О.Т., Карташева З.С., Писаренко Л.М. // Общая химия. 2008. Т. 8. С. 1298.
Касаикина О.Т., Круговов Д.А., Менгеле Е.А., Березин М.П., Фокин Д.А. // Нефтехимия. 2015. Т. 55. № 6. С. 535.
Круговов Д.А., Менгеле Е.А, Касаикина О.Т. // Изв. АН. Сер. Хим. 2014. № 8. С. 1837.
Касаикина О.Т., Потапова Н.В., Круговов Д.А., Березин М.П. // ВМС. Сер. В. 2017. Т. 59. № 3. С. 181.
Касаикина О.Т., Потапова Н.В., Круговов Д.А., Писаренко Л.М. // Кинетика и катализ. 2017. Т. 58. № 5. С. 567.
Потапова Н.В., Касаикина О.Т., Березин М.П., Плащина И.Г. // Кинетика и катализ 2020. Т. 61. № 5. С. 700. https://doi.org/10.1134/S0023158420050079
Al-Shareeda Z.A., Abramovich R.A., Potanina O.G., Alhejoj H. // Int. J. Pharm. Qual. Ass. 2020. V. 11. P. 361. https://doi.org/10.25258/ijpqa.11.3.10
Organization for Economic Co-operation and Development (OECD), SIDS Initial Assessment Reports: Choline Chloride, 2004.
Hall J.M., Savage L.M. // Exp. Neurol. 2016. V. 278. P. 62. https://doi.org/10.1016/j.expneurol.2016.01.018
Cox M.A., Bassi C., Saunders M.E., Nechanitzky R., Morgado-Palacin I., Zheng C., Mak T.W. // J. Intern. Med. 2020. V. 287. P. 120. https://doi.org/10.1111/joim.13006
Yonei Y., Takahashi Y., Hibino S., Watanabe M., Yoshioka T. // J. Clin. Biochem. Nutr. 2008. V. 42. P. 89.
Ferreira G.C., McKenna M.C. // Neurochem. Res. 2017. V. 42. P. 1661. https://doi.org/10.1007/s11064-017-2288-7
Wang M., Maki C.R., Deng Y., Tian Y., Phillips T.D. // Chem. Res. Toxicol. 2017. V. 30. P. 1694. https://doi.org/10.1021/acs.chemrestox.7b00154
Kobayashi S., Makino A. // Chem. Rev. 2009. V. 109. P. 5288.
Denisov E.T., Denisova T.G. Handbook of Antioxidants: Bond Dissociation Energies, Rate Constants, Activation Energies and Enthalpies of Reactions. Boca Raton: CRC press, 2000.
Dougherty D.A. // Acc. Chem. Res. 2013. V. 46. P. 885.
Van Arnam E.B., Dougherty D.A. // J. Med. Chem. 2014. V. 57. P. 6289.
Davis M.R., Dougherty D.A. // Phys. Chem. 2015. V. 17. P. 29262.
Иванчев С.С. Радикальная полимеризация. Ленинград: Химия, 1985.
Дополнительные материалы отсутствуют.
Инструменты
Кинетика и катализ