Коллоидный журнал, 2019, T. 81, № 1, стр. 16-23

ВВЕДЕНИЕ

Наноразмерные материалы находят все большее применение в различных отраслях техники, науки и медицины [1–3]. Благодаря набору уникальных свойств [4] наноразмерный диоксид титана широко используется в биомедицине [5], что делает особенно необходимым понимание природы взаимодействий его поверхностных групп с биообъектами [6–8]. Такие контакты сложны, поскольку они включают в себя образование множества различных по природе связей с участием многочисленных группировок биомолекул и функциональных групп поверхности твердого тела. Исследования взаимодействий поверхности наноразмерных оксидов с мономерными биомолекулами – нуклеотидами, аминокислотами, моносахаридами, из которых образуются соответствующие биополимеры, могут служить основой установления механизма на молекулярном уровне.

Целью настоящего исследования было получение количественных характеристик адсорбции нуклеотидов пуринового ряда и определение механизма их взаимодействия с поверхностью диоксида титана.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

В работе использовали нанокристаллический порошок диоксида титана (Aldrich) с удельной поверхностью 62 ± 5 м²/г (Nova 1200, Quantachrome), который по данным рентгенофазового анализа представляет собой анатаз с размером частиц 30 нм, что соответствует величине, заявленной производителем (<25 нм).

Пуриновые нуклеотиды в виде натриевых солей – аденозин-5'-монофосфат (АМФ, “ч.”, Reanal), гуанозин-5'-монофосфат (ГМФ, “ч.”, Reanal) и инозин-5'-монофосфат (ИМФ, “ч. д. а.”, Sigma) и хлорид натрия (“ч. д. а.”, Merck) были использованы без дополнительной очистки.

Для установления необходимых значений pH растворов и суспензий применяли стандарт-титры HCl и NaOH (Titrisol, Merck, Германия). Все растворы и суспензии были приготовлены на бидистиллированной воде.

Адсорбцию пуриновых нуклеотидов изучали при температуре 20 ± 2°C по методике, подробно описанной в [9].

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Взаимодействие пуриновых нуклеотидов и функциональных групп диоксида титана было интерпретировано как образование адсорбционных комплексов. В состав таких комплексов могут входить протонированные в различной степени нуклеотиды и гидроксильные группы сорбента.

Нуклеотиды являются мономерными единицами нуклеиновых кислот, состоящими из гетероциклического основания, в котором атом водорода при одном из атомов азота замещен фосфорилированным углеводным остатком. Кроме обычных пуриновых оснований – аденина и гуанина в составе нуклеиновых кислот встречается “минорное” основание гипоксантин, нуклеозид которого называется инозин, а соответствующий нуклеотид – инозинмонофосфат.

Формулы исследованных пуриновых мононуклеотидов и константы их ионизации, рассчитанные для разных значений ионной силы, представлены в табл. 1.

Таблица 1.  

Константы ионизации пуриновых мононуклеотидов

Нуклеотид	Константы ионизации
	lg Ka1 (–NH+)	lg Ka2 (–OP(=O)(OH)O–)
		–6.19 0.1 M [9]
		–6.47 0.01 M
		–6.59 0.001 M
Инозин-5'-монофосфат, HL–
	–N7H+
	–2.32 0.1 M [9]	–6.20 0.1 M [9]
	–2.48 0.01 M	–6.48 0.01 M
	–2.54 0.001 M	–6.66 0.001 M
Гуанозин-5'-монофосфат, H2L±
	–N1H+
	–3.80 0.1 M [9]	–6.18 0.1 M [9]
	–3.96 0.01 M	–6.46 0.01 M
	–4.01 0.001 M	–6.58 0.001 M
Аденозин-5'-монофосфат, H2L±

Атомы азота пуринового кольца изученных нуклеотидов существенно различаются по оснóвности. Отщепление протона от группы N₁–Н⁺ аденозин-5'-монофосфата происходит при pH ~ 4; депротонирование группы N₇–Н⁺ гуанозин-5'-монофосфата наблюдается при pH > 2.3; атом азота N₇ инозин-5'-монофосфата протонирован только в очень кислых растворах. К этим кислотно-основным равновесиям добавляются общие для всех мононуклеотидов реакции ионизации фосфатных групп. В табл. 1 приведены константы ионизации вторичной фосфатной группы, поскольку отщепление протона от первичной группы происходит в кислой области (рН < 2). На рис. 1 представлены диаграммы распределения различных форм изученных пуриновых нуклеотидов в зависимости от pH.

Рис. 1.

Диаграммы распределения частиц АМФ (а), ГМФ (б) и ИМФ (в) в растворе в зависимости от pH: цвиттер-ион H₂L^± (1), моноанион HL^– (2) и дианион L^2– (3).

Для того чтобы выбрать возможные реакции комплексообразования необходимо учесть состояние функциональных групп поверхности оксида и формы, в виде которых адсорбирующиеся вещества присутствуют в растворе в зависимости от pH.

Для интерпретации экспериментальных данных о зависимости адсорбции пуриновых нуклеотидов от pH и ионной силы были использованы основная модель комплексообразования на поверхности Штерна [11] и программа GRFIT [12]. В соответствии с положениями этой модели на поверхности оксида присутствуют нейтральные (≡TiOH), протонированные ($ \equiv {\kern 1pt} {\text{TiOH}}_{2}^{ + }$) и ионизированные (≡TiO^–) группы, которые частично связаны с ионами фонового электролита, образуя внешнесферные комплексы – ионные пары (≡Ti${\text{OH}}_{2}^{ + }$Cl^– и ≡TiO^–Na⁺). В кислой среде гидроксильные группы в основном протонированы, при pH выше точки нулевого заряда (6.5) преобладают ионизированные группы [13]. Поверхность подразделяется на 2 плоскости, одна из которых обозначается символом 0, в ней непосредственно происходит адсорбция потенциалопределяющих ионов и сильно сорбирующихся веществ. Во второй плоскости, обозначенной символом 1, располагаются противоионы фонового электролита и слабо сорбирующиеся вещества. Частицы, расположенные в этих плоскостях, определяют величину и знак заряда поверхности.

При моделировании кислотно-основных свойств и адсорбционных кривых по программе GRFIT составляется матрица компонентов, взаимодействие которых приводит к образованию всех частиц в системе. К материальным компонентам относятся гидроксильные группы диоксида титана, ионы фонового электролита, адсорбат и протоны. Кроме того, матрица компонентов дополняется электрическими составляющими ехр0 и ехр1, которые соответствуют величинам зарядов частиц в плоскостях 0 и 1. Матрица частиц для системы диоксид титана–нуклеотид–хлорид натрия приведена в табл. 2. В матрице представлены реакции протонирования и ионизации функциональных групп поверхности, их взаимодействия с ионами Na⁺ и Cl^–, а также реакции ионизации нуклеотидов. Концентрация OH^–-групп задается через ионное произведение воды при данной ионной силе. Константы равновесия реакций образования комплексов на поверхности, отмеченные звездочкой, подбираются при обработке экспериментальных данных с помощью программы. В качестве исходного компонента нуклеотида может быть выбрана любая его форма, присутствующая в растворе. В табл. 2 первые 9 частиц одинаковы для всех исходных компонентов – цвиттер-иона, моно- и дианионов. Частицы нуклеотидов 10−12, которые находятся в равновесии в водном растворе, и образующиеся на поверхности (13, 14), различаются стехиометрией по протонам и величинами констант равновесия соответствующих реакций.

Реакции комплексообразования на поверхности и соответствующие им константы равновесия реакций могут быть записаны различным образом в зависимости от выбора исходной частицы.

Исходный компонент цвиттер-ион H₂L^±:

Исходный компонент моноанион HL^–:

Исходный компонент дианион L^2–:

В уравнениях констант равновесия коэффициенты при значениях потенциалов (${{\Psi }_{0}}$ и ${{\Psi }_{1}}$) соответствуют величинам зарядов в плоскостях 0 и 1. Заряд протонированной группы $ \equiv {\kern 1pt} {\text{TiOH}}_{2}^{ + }$ в плоскости 0 равен +1, а заряд в плоскости 1 определяется зарядом частицы нуклеотида, которая образует адсорбционный комплекс: –1 или –2.

Так, образование комплекса с однозарядным анионом ≡Ti${\text{OH}}_{2}^{ + }$HL^– по уравнению (1) не сопровождается выделением или поглощением протона, по уравнению (3) один протон присоединяется к гидроксильной группе TiO₂. Образование этого же комплекса по уравнению (5) требует присоединения 2 протонов, один из которых необходим для протонирования TiOH-группы, а другой – для образования однозарядного аниона из двухзарядного. Аналогичные рассуждения можно привести для образования комплекса с двухзарядным анионом.

На рис. 2 приведены кривые зависимости адсорбции пуриновых нуклеотидов из водных растворов на поверхности TiO₂ от pH. Адсорбционные кривые исследованных пуриновых нуклеотидов различаются только в кислой области, выше pH 5 они практически совпадают. Это, по-видимому, связано с разной оснóвностью атомов азота пуринового кольца и зарядом исходной частицы. Так, для ИМФ исходная частица – моноанион, для АМФ и ГМФ – цвиттер-ионные формы, различающиеся величинами констант депротонирования азотистых оснований. Наличие максимумов на адсорбционных кривых АМФ и ГМФ свидетельствует о том, что частицы с положительным зарядом на атоме азота пуринового кольца не адсорбируются на поверхности диоксида титана. Рост адсорбции наблюдается после значения pH, примерно соответствующего константе депротонирования. Уменьшение адсорбции всех нуклеотидов при pH > 6–7 можно объяснить отталкиванием одноименно заряженных анионов и ионизированных поверхностных групп. Вероятно, анионные формы нуклеотидов взаимодействуют с протонированными гидроксильными группами диоксида титана. При этом образуются внешнесферные комплексы, компоненты которых связаны электростатическими связями. Подтверждением этому может служить зависимость адсорбции ИМФ от ионной силы раствора (рис. 3). В кислой области проявляется конкуренция фосфат-анионов с анионами фонового электролита: чем больше концентрация последнего, тем меньше адсорбция фосфатных анионов. При увеличении pH адсорбция из растворов с высокой ионной силой становится больше по сравнению с адсорбцией из менее концентрированных растворов. По-видимому, это является следствием повышения концентрации протонированных групп с увеличением ионной силы раствора.

Рис. 2.

Адсорбция ИМФ (1), ГМФ (2) и АМФ (3) на поверхности диоксида титана в зависимости от pH; C_ПМФ = = 0.1 ммоль/л, ${{C}_{{{\text{Ti}}{{{\text{O}}}_{2}}}}}$ = 1 г/л, 0.01 М NaCl.

Рис. 3.

Адсорбция ИМФ на поверхности диоксида титана в зависимости от pH при разной ионной силе раствора: 0.001 (1), 0.01 (2) и 0.1 М NaCl (3); C_ИМФ = 0.1 ммоль/л, ${{C}_{{{\text{Ti}}{{{\text{O}}}_{2}}}}}$ = 1 г/л.

Константы равновесия всех реакций комплексообразования были определены по программе GRFIT, при работе которой эти величины подбираются таким образом, чтобы разница между экспериментальными и рассчитанными значениями была минимальной. В табл. 3 приведены константы равновесия реакций образования комплексов АМФ по всем шести уравнениям реакций. Оказалось, что все эти константы могут быть пересчитаны в константы устойчивости комплексов с учетом констант равновесия реакций протонирования ТiОН-групп диоксида титана и реакций ионизации/протонирования нуклеотида:

Константы устойчивости одного и того же комплекса, как и ожидалось, оказались одинаковыми: для однозарядного аниона АМФ ${\text{lg}}K_{{{\text{SC}}}}^{{{\text{HL}}}}$ = = 5.43 ± 0.04, для двухзарядного аниона ${\text{lg}}K_{{{\text{SC}}}}^{{\text{L}}}$ = = 6.60 ± 0.02, – поскольку они определяют прочность связывания между одними и теми же частицами.

Выбранные реакции комплексообразования и рассчитанные для них константы равновесия позволяют воспроизвести адсорбционные кривые всех исследованных нуклеотидов (табл. 4). Константы устойчивости комплексов одного и того же типа для разных нуклеотидов примерно одинаковы: ${\text{lg}}K_{{{\text{SC}}}}^{{{\text{HL}}}}$ комплексов с однозарядным анионом изменяется от 5.11 до 5.40, ${\text{lg}}K_{{{\text{SC}}}}^{{\text{L}}}$ комплексов с двухзарядным анионом − от 6.18 до 6.60. Комплексы с двухзарядным анионом более устойчивы, чем комплексы с однозарядным анионом. Такая же закономерность наблюдается и для комплексных соединений неорганического фосфата с ионами некоторых переходных металлов: константы устойчивости комплексов ионов меди Cu(H₂PO₄)⁺ и Cu(HPO₄) различаются на 2 порядка [14], а для ионов Fe(III) даже больше [15]. Влияние пуриновых оснований на устойчивость комплексов на поверхности невелико, что, по-видимому, связано с участием в адсорбционных взаимодействиях одинаковых для всех нуклеотидов фосфат-анионов. Сходство адсорбционных кривых пуриновых нуклеотидов и неорганического фосфата [9] служит подтверждением этого предположения.

На основании рассчитанных констант равновесия реакций были построены диаграммы распределения адсорбционных комплексов нуклеотидов на поверхности диоксида титана в зависимости от pH. На рис. 4 в качестве примера приведены диаграммы распределения комплексов ИМФ, образующихся на поверхности TiO₂ при адсорбции из растворов с различной концентрацией фонового электролита. Следует отметить, что кривые, отражающие содержание различных комплексов, пересекаются при pH > 6. Эта величина соответствует константе ионизации однозарядного аниона, т.е. ионизация адсорбированного однозарядного аниона на поверхности происходит примерно при тех же значениях рН, что и в растворе.

Рис. 4.

Диаграммы распределения адсорбционных комплексов ИМФ $ \equiv {\kern 1pt} {\text{TiOH}}_{2}^{ + }$HL^– (1) и $ \equiv {\kern 1pt} {\text{TiOH}}_{2}^{ + }$L^2– (2) на поверхности диоксида титана в зависимости от pH при разной ионной силе раствора: 0.001 (а), 0.01 (б) и 0.1 М NaCl (в).

Таким образом, установлено, что пуриновые нуклеотиды адсорбируются из водных растворов на поверхности диоксида титана с образованием устойчивых комплексов одно- и двухзарядных анионов. Можно предположить, что и нуклеиновые кислоты, в составе которых активные группы оснований заняты в образовании водородных связей, а фосфатные группы свободны, взаимодействуют с поверхностью диоксида титана с формированием подобных комплексов.