Координационная химия, 2022, T. 48, № 1, стр. 45-56

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Реагенты NiCl₂ ∙ 2H₂O, CuSO₄ ∙ 5H₂O, NaOH, Na₂CO₃, сульфаниламид, 25%-ый аммиачный раствор и растворители (“x. ч.”), полученные из коммерческих источников и дихлорглиоксим, полученный синтетическим путем, использовались без дополнительной очистки.

Cинтез DsamH₂ (L) выполняли по методике [21, 22], но при более долгом перемешивании в течении 5–6 ч. Выход 0.28 г (63%). Вещество растворимо в ДМФ, ДМСО, менее растворимо в спиртах.

Для получения соединений I и II использовали методику [22].

Cинтез [Ni(DsamH)₂] · 2H₂O (I). К теплому раствору 0.214 г (0.5 ммоль) дисульфаниламидглиоксима в 30 мл метанола добавляли 0.06 г (0.25 ммоль) NiCl₂ · 6H₂O в 15 мл метанола. Смесь перемешивали в течении 15 мин при 60°C. При перемешивании добавляли 5–6 капель аммиака, после чего в растворе появлялся осадок коричневого цвета. Осадок отфильтровывали, промывали холодным метанолом, эфиром, после чего высушивали на воздухе. Выход 0.2 г (43%). Вещество растворимо в ДМФ, ДМСО, но слабо растворимо в метаноле. Получить качественные монокристаллы, пригодные для PCA не удалось, вероятно, из-за слабой растворимости комплекса в легко улетучиваемых растворителях.

Cинтез [Cu(DsamH₂)₃]SO₄ · 5H₂O (II). Дисульфаниламидглиоксим массой 0.214 г (0.5 ммоль) растворяли в 40 мл метанола, раствор нагревали на водяной бане до 60°C (раствор 1). Сульфат меди(II) пятиводный массой 0.063 г (0.25 ммоль) растворяли в минимальном количестве воды, после чего добавляли 20 мл метанола (раствор 2). Раствор 2 капельно, при постоянном перемешивании, добавляли к раствору 1, полученный раствор отфильтровывали и оставляли для медленного испарения при комнатной температуре. В течение 5 сут в растворе образовывались кристаллы в виде продолговатых пластинок. Выход 0.4 г (52%). Вещество слабо растворимо в ДМФ, ДМСО.

Состав и строение соединений L, I, II устанавливали на основе элементного анализа, ИК-, УФ- и ЯМР-спектроскопии, а для монокристаллов L и II – методом РСА. ИК-спектры снимали на FT-IR Perkin-Elmer Spectrum 100 в вазелиновом масле в области 4000–400 см^–1, ATР – 4000–650 cм^–1, УФ-спектры – на спектрофотометре Perkin-Elmer Lambda 25. Спектры ЯМР ¹H, ¹³C регистрировали на спектрометрe 400 Brucker с рабочей частотой для ¹H 400.13 МГц и для ¹³C 100.61 МГц в растворах ДМСО-d₆, используя внутренний стандарт TMC. Сигналы выражены в м.д.

РСА. Экспериментальные данные для L и II получены при комнатной температуре 293(2) К на дифрактометре Xсalibur Е (МоK_α-излучение, графитовый монохроматор). Параметры элементарной ячейки уточнены по всему массиву, и остальные экспериментальные данные получены с использованием комплекса программ CrysAlis Oxford Diffraction [23]. Структура соединений решена прямыми методами и уточнена методом наименьших квадратов в анизотропном полноматричном варианте для неводородных атомов (SHELX-97) [24]. Позиции атомов водорода сольватных молекул воды определены из разностного Фурье-синтеза, остальных атомов Н – рассчитаны геометрически. Все атомы Н уточнены изотропно в модели “жесткого тела” c U_эфф = 1.2U_экв или 1.5U_экв соответствующих атомов – C, N и O. Характеристики эксперимента и уточнения структуры соединений L и II приведены в табл. 1, некоторые межатомные расстояния и валентные углы – в табл. 2 , геометрические параметры межмолекулярных водородных связей (МВС) – в табл. 3.

Позиционные и тепловые параметры атомов соединений L и II депонированы в Кембрижском банке структурных данных (КБСД) (№ 2080777, 2080778 соответственно); deposit@ccdc.cam.ac.uk или http://www.ccdc.cam.ac.uk/data_request/cif).

Биологические методы. Oбъектами исследований служили штаммы мицелиальных грибов Fusarium gibbosum CNMN FD 12 и Trichoderma koningii Oudemans CNMN FD 15 – активные продуценты комплекса протеолитических ферментов (кислых, нейтральных и щелочных протеаз) [25, 26]. Эти штаммы хранятся в Национальной коллекции непатогенных микроорганизмов Республики Молдова при Институте микробиологии и биотехнологии.

Культивирование продуцентов осуществлялось глубинным способом.

Активность кислых (pH 3.6) и нейтральных (pH 7.4) протеаз в культуральной жидкости определяли по методу Вильштеттера, который основан на определении количества свободных карбоксильных групп, образующихся при гидролизе 5%-ного раствора желатина. При этом за единицу протеолитической активности принимали количество фермента, которое образует 1 мг аминного азота за 1 ч в стандартных условиях опыта [27]. Статистическую обработку результатов проводили с использованием компьютерных программ по методу Доспехова [28].

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

При конденсации дихлорглиоксима с сульфаниламидом в молярном соотношении 1 : 2 был получен дисульфаниламидглиоксим (схема 1 ) [22].

Схема 1 .

В ИК-спектре DsamH₂ наблюдаются полосы при 3424, 3357, 3283 ν(NH), 3076 cм^–1 ν(OH), которые смещены в сторону более низких значений частот благодаря молекулярным ассоциациям на основе оксимных NОН- и NH-групп, а также при 1642 ν(C=N), 1592 ν(CC)_aром, 1302, 1150 ν(SO), 935 ν(NO) и 767, 725 cм^–1 δ(CH) [29–32].

В спектре ЯМР ¹H DsamH₂ два дублета при 7.54 м.д. (2H, J = 8.78 Гц) и 6.89 м.д. (2H, J = 8.78 Гц) принадлежат ароматическому кольцу, сигнал при 7.16 м.д. соответствует NH₂-группе, а сигнал при 8.77 м.д. принадлежит NH-группе сульфаниламидного фрагмента. Результаты спектра ЯМР ¹H подтверждают, что конденсация сульфаниламида с дихлордиоксимом происходит через NH₂-группу, непосредственно связанную с ароматическим кольцом, поскольку она претерпевает самое сильное смещение в слабое поле, а при интегрировании сигналов становится заметным потеря протона у этой группы. Сигнал, соответствующий протонам оксимной группы, присутствует при 10.89 м.д. В спектре ЯМР ¹³C DsamH₂ сигналы 118.71 и 126.77 м.д. соответствуют третичным атомам углерода, при 136.17 и 143.01 м.д. – углерода ароматического кольца, а сигнал при 142.50 м.д. принадлежит оксимному атому углерода.

При взаимодействии солей меди или никеля с дисульфаниламидглиоксимом получены два различных комплексных соединения – бис-диоксимат никеля и трис-диоксимин меди, так как учитывалось, что образование трис-диоксиминов характерно при pH ~2, а бис-диоксиматов при pH ~5–6. При этом получение слабокислой среды осуществлялось добавлением 1–2 капель аммиачного раствора, а кислотной – добавлением соляной кислоты, подобно получению комплексов с дианилинглиоксимом [33].

В случае диоксимата Ni(II) с DsamH₂ в УФ-спектре присутствуют полосы при 202 и 280 нм, которые указывают на наличие лиганда в комплексе. При этом при добавлении капли раствора аммиака наблюдается уменьшение интенсивности полосы в области 280 нм, связанное, по-видимому, с образованием внутримолекулярных водородных связей, характерных для бис-диоксиматов, что способствует сдвигу электронного облака с ароматического кольца к металлоциклу.

В ИК-спектре бис-диоксимата Ni(II) (I) значение ν(ОН) 3076 см^–1 – следствие сильной внутримолекулярной водородной связи типа О–Н∙∙∙О. Так как оксимные группы =NOH в бис-диоксиматах переходных металлов образуют сильные водородные связи типа О–Н∙∙∙О, полоса при 3650–3100 см^–1, соответствующая колебанию ν(ОН) некоординированных оксимных молекул [30, 32], смещается в спектрах в области 2350 и 2340 см^–1, например для Ni(Dmg)₂ и Pd(Dmg)₂ соответственно (Dmg – анион диметилглиоксима). При этом установлена зависимость частоты ν(ОН) от расстояния О–Н∙∙∙О [30, 32]. В ИК-спектре трис-диоксимина Cu(II) (II) присутствуют полосы (cм^–1): 3469–3208 ν(NH), 3071–3075 ν(OH), 1643–1646 ν(C=N), 1588–1595 ν(CC)_aром, 900–913 ν(NO) и 741–747 δ(CH). Однако в спектре бис-диоксимата Ni(II) (I) проявляются как большинство из вышеприведенных полос, так и полосы, характерные для ионизированной оксимной группы при 1255 и 1093 cм^–1.

В спектре ЯМР для I присутствует сигнал протона оксимной группы, который подтверждает образование внутримолекулярных водородных связей. Существенные сдвиги претерпевают сигналы протонов групп NH и атомов углерода ароматических колец, связанных с этими группами, что объясняется смещением электронной плотности от диоксимных фрагментов к металлоциклу. То же cамое наблюдается и в спектрах ЯМР ¹³C комплексов I и II.

Сoeдинение L кристаллизуется в тригональной пространственной группе P3₁2₁ (табл. 1). Независимая часть элементарной ячейки L содержит 1/2 органической молекулы DsamH₂ с симметрией С₂. Молекулярная структура L показана на рис. 1. Диоксимный фрагмент DsamH₂ стабилизирован в анти (E,E) конформацию, при этом торсионные углы NCCN, образованные с вовлечением атомов азота N(1) и N(2), равны, соответственно, 57.5° и –49.1°. Анализ результатов КБСД [34] указывает на подобное строение некоординированных диоксимов, при этом кристаллизованных как в виде нейтральных молекул, так и как протонированных органических катионов. Межатомные расстояния O–N и N–C в оксимных фрагментах в L несущественно отличаются от подобных в нейтральных и в органических катионах модифицированных диоксимов с аминогруппой [35–38]. Например, в L межатомное расстояние O–N равно 1.420(3) Å (табл. 2), а в нейтральных молекулах N,N'-бис(2-(морфолино)этиламино)глиоксима [35] – 1.434 и (2Z,3Z)хиноксалин-2,3(1Н,4Н)диондиоксима [36] – 1.422 Å.

Рис. 1.

Структура молекулы DsamH₂ и нотация кристаллографически независимых атомов в L.

В кристалле L молекулы DsamH₂ объединены системой МВС O–H···N и N–H···O (табл. 3), в которых в качестве доноров протонов вовлечены ОН-группы оксимных фрагментов и NH-группы как внутренних, так и концевых фрагментов молекулы, а как акцепторы выступают атомы азота оксимных фрагментов и атомы кислорода сульфо-групп. При этом в кристалле можно выделить формирование различных слоев (рис. 2).

Рис. 2.

Объединение молекул DsamH₂ водородными связями в слои вдоль оси z в кристалле L.

Соединение II кристаллизуется в моноклинной пространственной группе Р2₁/c. В независимой части элементарной ячейки соединения II ионного типа находится один комплексный катион [Cu(DsamH₂)₃]²⁺ в общем положении (рис. 3), один aнион ${\text{SO}}_{4}^{{2 - }}$ и семь молекул кристаллизационной воды, четыре из которых с коэффициентом заполнения 1/2. Координационный полиэдр Cu(II) в комплексном катионе имеет форму искаженной тетрагональной бипирамиды, образованной набором донорных атомов N₆; все атомы азота, принадлежащие оксимным группам трех нейтральных лигандов DsamH₂. Каждый органический лиганд DsamH₂ координируется к центральному атому металла хелатно-бидентатным способом, образуя пятичленные металлоциклы. Длины связей Cu–N в координационном полиэдре находятся в интервале 1.978(6)–2.508(5) Å (табл. 2). Подобное строение найдено в трис-комплексах Ni(II) [21, 33, 39–42] и Co(II) [43–46], в которых производные этого лиганда координированы бидентатно-хелатным способом в основном как нейтральный лиганд. Комплексные катионы [Cu(DsamH₂)₃]²⁺ дополнительно стабилизированы слабыми внутримолекулярными π…π-взаимодействиями между ароматическими фрагментами лигандов, при этом расстояния центроид…центроид в них равны 3.580, 3.680 и 3.868 Å.

Рис. 3.

Структура комплексного катиона [Cu(DsamH₂)₃]²⁺ с нотацией атомов в II.

Анализ КБСД [34] выявил моноядерные моно- и бис-комплексы меди с оксамидоксимом [47–51], один биядерный комплекс и один координационный полимер Cu(II), содержащие по одному из этих лигандов, координированному бидентатно-хелатно к каждому атому металла, в которых мостиковыми лигандами служат анионы ${\text{SO}}_{4}^{{2 - }}$ [49]. При этом в комплексе Ni(II) c оксамидоксимом [52] для дополнительного сульфанилато-лиганда обнаружены два различных монодентатных способа координирования – как через один атом О, так и через один атом N. Так как в КБСД [34] обнаружены комплексы переходных металлов с лигандами, содержащими бензолсульфамидный фрагмент, координированные через атом О или N [53, 54], можно предположить, что при определенных условиях лиганд DsamH₂ может быть вовлечен в комплекс как мостиковый.

В кристалле II комплексные катионы [Cu(DsamH₂)₃]²⁺, aнионы ${\text{SO}}_{4}^{{2 - }}$ и кристаллизационные молекулы воды объединены сложной системой МВС (табл. 3), в которых в качестве доноров протонов вовлечены ОН-группы оксимных фрагментов и NH-групп как внутренних, так и концевых фрагментов комплексных катионов и молекулы воды, а как акцепторы выступают атомы азота и кислорода концевых SO₂NH₂-групп лигандов, а также атомы О анионов ${\text{SO}}_{4}^{{2 - }}$ и кристаллизационных молекул воды. Комплексные катионы между собой связаны как МВС O–H···O и N–H···O, так и слабыми межмолекулярными π…π-взаимодействиями между ароматическими кольцами соседних молекул (расстояние центроид…центроид 4.044–4.284 Å). При этом комплексные катионы объединены между собой МВС с вовлечением внешнесферных компонентов: O–H···O с анионом ${\text{SO}}_{4}^{{2 - }},$ O–H···O(w), N–H···O(w), O(w)–H···O и O(w)–H···N с вовлечением молекул воды, а также МВС O(w)–H···O между молекулами воды и анионами (рис. 4). В кристалле II комплексные катионы [Cu(DsamH₂)₃]²⁺ и aнионы ${\text{SO}}_{4}^{{2 - }}$ упаковываются сравнительно плотно, так что пустоты, доступные для кристаллизационных молекул, составляют 670.7 ų из объема элементарной ячейки (или 10.2%), при этом без сравнительно объемного аниона ${\text{SO}}_{4}^{{2 - }}$ пустоты составляют 989.8 ų из объема элементарной ячейки (или 15.1%). Таким образом, в II комплексные катионы [Cu(DsamH₂)₃]²⁺, объединенные МВС, образуют собственную супрамолекулярную структуру, а внешние анионы ${\text{SO}}_{4}^{{2 - }}$ и кристаллизационные молекулы воды, располагаясь в полостях посредством МВС, стабилизируют ее и существенно влияют на стабильность кристаллической структуры в целом.

Рис. 4.

Фрагмент кристаллической структуры II.

Влияние координационного соединения II на биосинтез протеаз штаммом микроскопического гриба Fusarium gibbosum CNMN FD 12 изучалось в динамике на 4-е, 5-е и 6-е сут культивирования – период, соответствующий максимуму биосинтеза изучаемых ферментов при классическом культивировании продуцента.

При добавлении комплекса меди II в питательную среду, максимальное значение энзиматической активности регистрируется при концентрации 5.0 мг/л, на 5-е сут культивирования продуцента, и совпадает со временем проявления максимума в контрольном варианте. Активность кислых протеаз в этот момент составляет 4.284 ед./мл по сравнению с 2.77 ед./мл в контроле, превышая уровень контроля на 54.5%. С увеличением концентрации до 10.0 и 15.0 мг/л активность кислых протеаз уменьшается в среднем на 5% по сравнению с контролем (табл. 4).

Aктивность нейтральных протеаз в экспериментальном варианте значительно превышает уровень контроля при всех испытуемых концентрациях, составляя 6.30, 5.96 и 4.79 ед./мл соответственно, по сравнению с 3/36 ед./мл в контрольном варианте, что на 42.5–87.5% выше контроля.

Максимум биосинтеза кислых протеаз мицелиального гриба Trichoderma koningii Oudemans CNMN FD (1.76–1.93 ед./мл) зарегистрирован на 8-е сут культивирования, превышая значение максимума контроля (1.59 ед./мл, 9-е сут) на 10.7–21.4%. Благоприятными концентрациями для биосинтеза являются 5.0 и 10.0 мг/л, a самые высокие значения достигнуты при концентрации 10 мг/л (1.93 ед./мл) (табл. 5).

Максимум активности нейтральных протеаз 4.53 ед/мл при концентрации комплекса 5.0 мг/л, проявляется на 9-e cут культивирования продуцента и совпадает с проявлением максимума биосинтеза в контрольном варианте, превышая уровень контроля на 52.5%. При данной концентрации активность нейтральных протеаз выше контроля в течение всего периода культивирования (8–10-е сут), превышая на 36.0% максимальный уровень контроля уже на 8-е сут. При концентрации комплекса в 10 мг/л активность нейтральных протеаз превышает уровень контроля (на 10.1%) только на 10-е сут культивирования.

Таким образом, выявлено, что новый диоксим – дисульфаниламидглиоксим – ведет себя подобно дианилинглиоксиму: трис-диоксимины и бис-диоксиматы получаются в зависимости от рН растворов. Введение дополнительных фрагментов, содержащих различные функциональные группировки, в диоксимный лиганд увеличивает его дентатность, а также влияет на способы вовлечения его в систему водородных связей. Комплексное соединение Cu(II) с лигандом DsamH₂ в оптимально подобранных концентрациях обеспечивает стимулирующее действие на синтез протеаз штаммов микромицетов биотехнологического значения Fusarium gibbosum CNMN FD 12 и Trichoderma koningii Oudemans CNMN FD 15, увеличивая активность кислых и нейтральных протеаз на 21.4–54.5% и, соответственно, 52.5–87.5% по сравнению с контролем. В результате это соединение представляет интерес в биотехнологических разработках как потенциальный биостимулятор ферментообразования у штаммов мицелиальных грибов-продуцентов.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.