Кристаллография, 2020, T. 65, № 6, стр. 896-899

ВВЕДЕНИЕ

Цинкзависимые металлокарбоксипептидазы являются важной группой экзопептидаз, участвующих во многих процессах жизнедеятельности организма в норме и патологии, в том в числе в пищеварении, процессинге нейропептидов, иммунном ответе, канцерогенезе [1–3]. Условно их можно разделить на две группы – эволюционно молодая группа карбоксипептидаз эукариотов и древняя группа карбоксипептидаз прокариотов, к которым относится и термостабильная металлокарбоксипептидаза Т (КПТ) из Thermoactinomyces vulgaris [4]. Карбоксипептидазы эукариотов, к которым относятся карбоксипептидазы А и В (КПА и КПВ) млекопитающих, часто представляют собой специализированные ферменты с узкой субстратной специфичностью. Например, КПА отщепляет только гидрофобные, а КПВ – только положительно заряженные остатки с С-концов пептидов и белков.

Если механизм субстратной специфичности карбоксипептидаз эукариотов изучен достаточно хорошо благодаря работам Вейли, Кристиансона, Липскомба, Гарделла, то структурные основы субстратной специфичности микробных карбоксипептидаз изучены недостаточно. Центральную роль в селективности карбоксипептидаз эукариотов, например карбоксипептидаз А, В, О, U, играет карман первичной селективности с расположенным на его дне ключевым аминокислотным остатком, замена которого часто приводит к полному переключению селективности. Так, замена остатка аспарагиновой кислоты 255 на аргинин переключила КПВ в глутаматспецифичную карбоксипептидазу [5]. Замена остатка аргинина на дне кармана первичной специфичности карбоксипептидазы О на остатки аспарагиновой кислоты и изолейцина превратила карбоксипептидазу О в фермент, селективно отщепляющий положительно заряженные и гидрофобные остатки соответственно [6]. Это связано с жесткостью активных центров карбоксипептидаз, способных связывать только определенные структуры субстратов [7]. В результате для каждой группы субстратов в случае панкреатических карбоксипептидаз имеется свой пищеварительный фермент – карбоксипептидаза А, А2, В.

В связи с ограниченностью геномного пространства микроорганизмы имеют меньшее число пищеварительных ферментов, но зато они обладают широкой субстратной специфичностью и могут отщеплять практически любые аминокислотные остатки. Комплементарность субстрата и кармана первичной специфичности в этом случае играет меньшую роль. Так, замена остатка аспарагиновой кислоты на дне кармана первичной специфичности КПТ на остаток изолейцина не превращает ее в КПА-подобный фермент [8]. Полная замена кармана первичной специфичности на карман КПВ не только не превратила КПТ в КПВ-подобную карбоксипептидазу, но и не изменила преимущественно гидрофобную первичную специфичность КПТ [9, 10]. Дистантные структурные детерминанты специфичности КПТ, такие как ионы кальция [11], не отвечали за пониженную эффективность гидролиза положительно заряженных субстратов КПТ. Таким образом, КПТ представляет собой интересный объект для изучения неканонических механизмов субстратной специфичности простейших молекулярных машин, какими являются монодоменные металлокарбоксипептидазы.

В настоящей работе для изучения роли еще одного структурного элемента карбоксипептидазы, отличающего КПВ и КПТ, – подвижной петли активного центра – получен мутант КПТ, воспроизводящий не только сайт первичной специфичности, но и петлю активного центра. Петля активного центра состоит из десяти аминокислотных остатков и содержит в своем составе Tyr255 (Tyr248 по нумерации КПА), участвующий в индуцированном соответствии Кошланда. В КПВ этот элемент представляет собой часть α-спирали, в КПТ – является частью спирали 3₁₀ благодаря делеции остатка в 253 положении. Помимо инсерции вставки insThr253 и замены Leu254Ile в петлю активного центра была введена мутация Gln249Gly, устраняющая стерические препятствия со стороны боковой группы Gln249 для правильного сворачивания белковой глобулы. В результате получен мутант КПТ11QG, который удалось сконцентрировать до 10 мг/мл и закристаллизовать в присутствии сульфата аммония в качестве осадителя. Этот мутант, воспроизводящий петлю активного центра КПВ, должен дать ответ о ее роли в субстратной селективности КПТ.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Мутантный вариант гена pro-cpT11QG был получен в ООО “Евроген”, Россия. Наличие мутаций подтверждено секвенированием.

Получение рекомбинантной КПТ. Экспрессию гена pro-cpT11QG проводили в клетках Еscherichia coli BL21(DE3) pLysS (Novagene) согласно инструкции производителя [12]. После индукции экспрессии с помощью изопропил-β-D-тиогалактопиранозида (IPТG) клетки разрушали ультразвуком.

Выделение проКПТ11QG из телец включения проводили согласно [13]. Для получения зрелого фермента к раствору проКПТ11QG добавляли субтилизин 72 в соотношении КПТ к субтилизину 200 : 1 (по весу) и инкубировали 4 ч при 37°С. Субтилизин инактивировали добавлением ди-изопропилфторфосфата. Раствор с активированной КПТ снова концентрировали ультрафильтрацией до объема 2 мл и центрифугировали для удаления осадка. После концентрирования раствор фермента подкисляли до рН 6.0, прибавляя 100 мM МЕS/NaOH, рН 5.8, наносили на колонку с аффинным сорбентом CABS-Сефарозой [14] (объем колонки 20 мл), уравновешенную 10 мM буфером MES/NaOH, pH 6.0, содержавшим 0.5 М NaCl, 10 мМ CaCl₂ и 0.1 мМ ZnSO₄, промывали колонку этим же буфером и затем элюировали КПТ11QG 10 мМ буфером Tris/HCl, рН 9.0. Фракции, содержащие активный белок, объединяли и концентрировали до 1 мл. Затем проводили замену буфера на буфер для кристаллизации (0.01 M MES/NaOH рН 6.0, содержащий 1 мМ CaCl₂, 0.1 мM ZnSO₄, 5% MPD и 0.25 M NaCl) трехкратным концентрированием/разбавлением в 10 раз ультрафильтрацией на ячейке Амикон. Белок концентрировали до 10 мг/мл по Брэдфорду [15] и стерильно фильтровали с помощью центрифужных патронов Centripack. Далее этот раствор использовали для кристаллизации белка. Отсутствие субтилизиновой активности было подтверждено с помощью специфического хромогенного субстрата ZAALpNA. DsNа-ПААГ-электрофорез проводили согласно Лэммли [16].

Кристаллизация КПТ11QG. Кристаллы КПТ11QG выращены в условиях микрогравитации с использованием метода встречной диффузии в капилляре через слой геля. Использовали оборудование и технологию, разработанные Аэрокосмическим агентством Японии [17, 18]. В капилляр диаметром 0.5 мм вносили 8 мкл раствора белка, приготовленного, как описано выше. Свободный конец капилляра герметично закрывали пластилином, на другой конец капилляра надевали силиконовую трубку, заполненную 1%-ным агарозным гелем, предварительно вымоченную в растворе осадителя в течение суток. Трубку с гелем укорачивали до 10 мм. Капилляр с трубкой помещали в цилиндр с осадителем, который представлял собой 1.6 М раствор сульфата аммония в 10 мM буфере MES/NaOH, pH 6.0, содержавшем 0.5 М NaCl, 10 мМ CaCl₂, 0.1 мМ ZnSO₄. Несколько устройств в специальной упаковке доставляли на Международную космическую станцию, где проводили кристаллизацию при 20°С. Кристаллы для сбора дифракционных данных извлекали из капилляра в раствор осадителя и после перенесения в криораствор замораживали в парах жидкого азота. Кроме компонентов осадителя криораствор содержал 20% глицерина (по весу).

Сбор и обработка дифракционных данных. От выращенных кристаллов при температуре 100 K собран дифракционный набор до разрешения 2.45 Å на синхротоне SPring-8 (Япония, станция BL41XU). В качестве детектора использовали EIGER. Дифракционные данные получены методом вращения с одного кристалла при расстоянии между кристаллом и детектором 300 мм и длине волны 0.8 Å; углы качания и вращения 0.1° и 120° соответственно. Обработку набора экспериментальных интенсивностей проводили с помощью программы iMosflm [19]. Статистические характеристики набора приведены в табл. 1. Кристаллы относятся к пр. гр. P31. В независимой части ячейки содержится одна молекула фермента.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Выращенные кристаллы дифрагировали до разрешения 2.45 Å и принадлежали пр. гр. P31 со следующими параметрами элементарной ячейки: a = b = 48.69, c = 117.53 Å, α = β = 90°, γ = 120°. Оценка содержания растворителя в элементарной ячейке по методу Мэттьюса [20], проведенная с помощью программного пакета CCP4 [21], показала, что в независимой части ячейки содержится одна субъединица белка. Полученный набор позволяет установить структуру мутантной формы КПТ11QG при разрешении 2.45 Å.

Примечательно, что кристаллы КПТ11QG принадлежат к иной пространственной группе, нежели кристаллы дикого типа, кристаллы мутанта с имплантированным центром субстратной специфичности панкреатической карбоксипептидазы B КПТ5 (G215S, A251G, T257A, D260G, T262D), а также мутант КПТ с заменой в подвижной петле активного центра (КПT L254N), что было показано в многочисленных экспериментах [18, 22–25]. Все эти формы принадлежат пр. гр. P6322. Можно предположить, что изменение пространственной группы вызвано вставкой дополнительного аминокислотного остатка (ins253Tyr) в подвижную петлю активного центра.

Работа выполнена при поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (проект № 19-04-00220) в части выделения и очистки белка, Федеральной космической программы 2016–2025 (ОКР “МКС (Наука)”) в части выращивания кристаллов в условиях невесомости, а также при поддержке Министерства науки и высшего образования в рамках выполнения работ по Государственному заданию ФНИЦ “Кристаллография и фотоника” РАН в части получения и обработки рентгенодифракционных наборов.