Кристаллография, 2020, T. 65, № 6, стр. 907-913

ВВЕДЕНИЕ

Олигопептидазы В (OpB) – это трипсиноподобные сериновые пептидазы, относящиеся к семейству пролилолигопептидаз (POP). Характерной особенностью POP является двухдоменная 3D-архитектура, включающая в себя С-концевой α/β-гидролазный каталитический домен и N-концевой 7–8-лопастный β-пропеллерный домен, препятствующий проникновению субстратов размером более 3 кДа к каталитической триаде, локализованной во внутренней полости границы между доменами [1]. Олигопептидазы В найдены в бактериях, протозойных паразитах (трипаносомах и лейшманиях) и растениях [2]. Известно, что они являются факторами патогенеза при паразитарных и некоторых бактериальных инфекциях и являются потенциальными мишенями для разработки терапевтических средств [3]. В острых фазах заболевания эти трипсиноподобные ферменты попадают в кровь больных, где гидролизуют ряд физиологически важных пептидов, включая предсердный натрийуретический фактор, что вызывает серьезные нарушения в системе кроветворения [4]. Кроме того, было показано, что именно OpB обеспечивают резистентность бактерий к антимикробным пептидам, обогащенным основными аминокислотными остатками [5]. Поиск специфических ингибиторов OpB для последующего дизайна лекарственных средств, в том числе антипаразитарных препаратов, требовал знания пространственной структуры данного фермента. Такие данные, полученные для ферментов из лейшмании Leishmania major и трипаносомы Trypanosoma brucei, позволили предложить механизм каталитической активации ОpB простейших [6, 7]. Однако из-за аминокислотных замен в ключевых позициях реализация данного механизма в бактериальных ОpB была маловероятна [8–11]. В 2019 г. получена первая пространственная структура бактериальной ОpB из Serratia Proteamaculans (PSP, PDB ID 6TF5) [12]), которая должна была прояснить, каким образом происходит активация бактериальных ферментов данного класса. Однако анализ структуры показал, что фермент в кристалле имеет каталитически неактивную конформацию, в которой остатки активного центра разобщены между собой.

Цель данной работы – получение и рентгеноструктурный анализ кристаллов фермента, находящегося на разных стадиях каталитической активации. Для этого осуществлен подбор условий кристаллизации мутантных форм PSP, а также комплексов PSP с рядом лигандов, проведена наработка кристаллов и их рентгеноструктурный анализ (РСА). Выбор точек мутагенеза, а также лигандов для получения комплексов проводили на основе результатов предшествующих исследований нативной и рекомбинантной PSP [13–18]. Дифракционные наборы были собраны для каталитически неактивного мутанта PSP и мутанта, обладающего повышенной эффективностью катализа, для комплексов PSP с аналогами субстратов и продуктов катализа, а также с необратимым ингибитором – аналогом переходного состояния (табл. 1). Предварительный анализ рентгеноструктурных данных показал, что во всех случаях кристаллы принадлежат одной и той же пространственной группе, что указывает на то, что в отличие от протозойных аналогов каталитическая активация PSP происходит без значительных изменений взаимного расположения доменов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Сайт-направленный мутагенез S532A проводили согласно [9, 10]. Синтетические олигонуклеотидные праймеры для замены кодона (5'-CACGGCGGCAAGTAAGGGCGTTTCAAAGC-3') и отбора мутантных клонов (5'-GGCTTTGAAACGC CCTT-3') были синтезированы компанией Евроген (Москва, Россия). Восемнадцать циклов полимеразной цепной реакции (ПЦР) проведены на шаблоне PSP-экспрессирующей плазмиды [9, 10] с использованием набора для ПЦР Tersus Plus (Евроген, Москва, Россия) в соответствии с рекомендациями производителя. ПЦР-продукт обрабатывали эндонуклеазой рестрикции DpnI (Thermo Fisher Scientific, Массачусетс, США) и трансформировали в E. coli. Мутантные клоны отбирали методом ПЦР на колониях с использованием Taq ДНК-полимеразы (Евроген, Москва, Россия). Плазмидную ДНК, выделенную из мутантных клонов, секвенировали для контроля отсутствия случайных мутаций, связанных с ПЦР.

Получение рекомбинантных белков. Получение рекомбинантной PSP и ее мутантов (табл. 1) проводили в системе экспрессии E. coli, как описано в [8–10]. При выделении белка использовали металло-хелатную афинную хроматографию, проводимую на Ni-NTA. Концентрирование белка проводили на ультрафильтрационной колонке Centricon (Merck-Millipore, США), оценку чистоты препарата осуществляли с помощью электрофореза в ДСН-ПААГ на ячейке для электрофореза Mini-Protean 3 (Bio-Rad, США) с последующим окрашиванием гелей с помощью Coomassie G-250. Определение концентрации белка проводили методом Брэдфорда с помощью набора Bio-Rad Protein Assay и стандарта БСА.

Кристаллизация. Подбор условий кристаллизации осуществляли методом диффузии в парах в варианте “сидячей капли”. Использовали роботизированную систему кристаллизации фирмы “Rigaku” (Япония) Ресурсного центра молекулярной и клеточной биологии (РЦ МКБ) НИЦ “Курчатовский институт”, белковые препараты с концентрацией 15–21 мг/мл в буфере (20 мМ Трис pH 8.0, 100 мМ хлорид натрия, 5 мМ спермин), стандартные наборы для кристаллизации глобулярных белков компании Hampton Research (США): Crystal Screen HT, Index HT, PEG/Ion HT, PEGRx HT, набор TOP96 компании Anatrace (США) и кристаллизационные планшеты на 96 лунок (ArtRobbins), каждая из которых содержала три подлунки для варьирования концентрации белка в рамках одного условия кристаллизации. Соотношения белка и противораствора в подлунках были следующими: 1 : 1, 2 : 1 и 1 : 2, суммарный объем белка в лунке – 0.1 мкл для соотношений 1 : 1 и 2 : 1 и 0.2 мкл для соотношения 1 : 2. Объем противораствора составлял 50 мкл. Планшеты инкубировали при температуре +4°С с инспекцией результатов раз в семь дней. Время роста большинства кристаллов составляло от 8 до 14 дней.

Для получения кристаллов комплексов использовали метод сокристаллизации: к раствору белка перед кристаллизацией добавляли соответствующий лиганд (табл. 2) в концентрации 10 мМ. Если рост кристаллов не наблюдался, проводили настаивание кристаллов свободной формы фермента в присутствии 25 мМ лиганда в течение 3 ч.

Оптимизацию условий проводили при температуре +4°С методом диффузии в парах в варианте “висячей капли” в 24-луночных планшетах фирмы “VDX” (США). Кристаллизационная капля состояла из 3 мкл белкового раствора, смешанного с осадителем в равных пропорциях и уравновешенного против 400 мкл осадителя в герметичном резервуаре. Финальные условия кристаллизации собраны в табл. 2.

Сбор и обработка дифракционных данных на синхротронном источнике НИЦ “Курчатовский институт”. Перед сбором дифракционных данных кристаллы вылавливали петлей и переносили в криораствор, содержащий паратон, либо кристаллизационный раствор с добавлением глицерина до финальной концентрации в 25% (табл. 2). В случае работы с кристаллами комплексов в криораствор также добавляли соответствующий лиганд в требуемой концентрации.

Сбор дифракционных данных проводили на станции Белок (λ = 0.787 Å) Курчатовского источника синхротронного излучения в прямой геометрии (θ = 0°) при температуре 100 K. Было собрано 350 дифракционных картин с шагом в 1°, расстояние образец–детектор 140 мм. Картины дифракции детектировали с помощью двумерного детектора Rayonix MARCCD.

Данные проиндексированы и проинтегрированы с помощью программы Mosflm из пакета CCP4 [19]. Статистики наборов данных приведены в табл. 3.

Сбор и обработка дифракционных данных на синхротронном источнике SPring-8, Япония. Криопротектирование кристаллов проводили аналогично тому, как описано в предыдущем разделе.

Сбор дифракционных данных проводили на синхротронном источнике SPring-8, Япония (станция BL41XU). Эксперимент выполнен при температуре 100 K. Картины дифракции детектировали с помощью детектора Pilatus 6M. Для расчета стратегии сбора данных использовали программы HKL2000 и Mosflm. Дифракционные данные были обработаны, как описано выше. Статистики наборов данных и обработки приведены в табл. 4.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

В отличие от своих протозойных аналогов бактериальные OpB плохо поддаются кристаллизации, поэтому ранее для изучения механизма катализа OpB из S. Proteamaculans (PSP) использовались методы моделирования по гомологии и молекулярной динамике [9, 10], а также доступные пространственные структуры близкородственных ферментов из лейшмании L. major и трипаносомы T. brucei [6, 7]. Исходя из структурных данных, полученных для протозойных ферментов, OpB существуют в двух конформациях: открытой (неактивной), в которой каталитический и β-пропеллерный домен, а также аминокислотные остатки активного центра разобщены между собой, и закрытой (активной), в которой два домена сближены, а активный центр собран (рис. 1а, 1б). В то же время анализ пространственных структур, полученных для других представителей семейства POP (дипептидилпептидаз, DPP), показывает, что конформационные перестройки активного центра и активация ферментов могут происходить без изменения положения доменов друг относительно друга [20]. В 2019 г. получена пространственная структура PSP (PDB ID 6TF5), которая стала первой структурой бактериальной ОpB [12]. Анализ структуры показал, что активный центр фермента находится в каталитически неактивной конформации. При этом взаимное расположение доменов друг относительно друга не позволило однозначно определить, находится ли фермент в открытой или закрытой конформации (рис. 1в).

Рис. 1.

Модели открытой (а) и закрытой (б) конформаций PSP, полученные с помощью моделирования по гомологии на основе пространственных структур PDB ID 4BP8 и 4BP9, полученных для OpB Trypanosoma brucei в открытой и закрытой конформациях соответственно. Модель пространственной структуры PSP (PDB ID 6TF5), полученной методом РСА в 2019 г. (в).

Чтобы определить, как происходит активация PSP, требовалось получить пространственные структуры фермента, находящегося на других стадиях каталитической активации; для этого решили провести кристаллографические исследования мутантных форм PSP, а также комплексов фермента с лигандами различной природы (табл. 1).

Для исследований был отобран мутант PSP_E125A, обладающий повышенной эффективностью катализа [9], а также каталитически неактивный мутант PSP_S532A, содержащий аланиновую замену каталитического серина S532. Данная мутантная форма использована для получения комплексов с пептидным субстратом ZAKIR (табл. 1). Ожидается, что связывание субстрата в субстратсвязывающем центре фермента вызовет переход активного центра в каталитически активную конформацию, при этом нарушение каталитической триады не позволит начаться гидролизу и зафиксирует данное состояние.

Следующим типом комплекса, выбранным для кристаллизации, был комплекс PSP с низкомолекулярным ингибитором N-альфа-тоцил-L-лизин-хлорометил кетоном (TLCK) (рис. 2), являющимся необратимым ингибитором сериновых протеаз и пептидаз, который способен образовать ковалентную связь одновременно с серином и гистидином каталитического центра, имитируя переходное состояние субстрата в процессе катализа [21].

Рис. 2.

Химическая формула N-альфа-тоцил-L-лизин-хлорометил кетона (TLCK).

Финальные комплексы, полученные в настоящей работе, представляли собой комплексы PSP c аналогами продуктов катализа – пептидами вида z-ХХXR/K, где X – любая аминокислота, а z – бензилоксикарбонил (табл. 1). Олигопептидазы B имеют трипсиноподобную субстратную специфичность и гидролизуют пептидную связь после положительно заряженного остатка. С-концевые R/K аминокислотные остатки пептидов, находящихся в кристаллизационной смеси в 100-кратном молярном избытке по сравнению с ферментом, с высокой вероятностью будут взаимодействовать с аминокислотными остатками, ответственными за удаление продуктов реакции из активного центра, а пространственные структуры таких комплексов могут стать иллюстрациями завершающей стадии катализа.

Для всех описанных комплексов подобраны условия кристаллизации (табл. 2) и получены кристаллы (рис. 3). Сравнительный анализ условий кристаллизации показал, что все комплексы PSP c аналогами продуктов катализа кристаллизовались в сходных условиях: 0.2 М малоната натрия, pH 7.0, а в качестве осадителя – 20–30% полиэтиленгликоля (ПЭГ) 3350. Кристаллы PSP_S532A росли в том же ПЭГ при рН 5.5 в присутствии 0.2 М сульфата лития, PSP_E125A – при рН 6.5 и с ПЭГ 5000, а комплекс PSP-TLCK – при рН 8.5 и с ПЭГ 4000.

Рис. 3.

Фотографии полученных в работе кристаллов.

Рентгеноструктурный анализ полученных кристаллов проводили на синхротронных источниках НИЦ “Курчатовский институт” и SPring-8 (Япония), кристаллографические данные и параметры съемки представлены в табл. 3 и 4 соответственно. Наборы, пригодные для решения пространственных структур, собраны с разрешением 2.72–1.88 Å (синхротрон НИЦ “Курчатовский институт”) и 2.0–1.8 Å (SPring-8).

Таким образом, найдены условия кристаллизации, наработаны кристаллы и проведен сбор и последующий анализ рентгеноструктурных данных для двух мутантных белков и шести комплексов с лигандами. Собранные дифракционные наборы позволят получить недостающую информацию для описания каталитического цикла бактериальных ОpB. Уже на стадии предварительного анализа, исходя из того, что все кристаллы принадлежат пр. гр. P2₁2₁2₁, совпадающей с пространственной группой ранее полученной структуры PSP [12], можно предположить, что переход PSP между каталитически активным и неактивным состояниями, скорее всего, не сопровождается сильным расхождением доменов, которое наблюдалось в случае OpB из T. Brucei. Кристаллы, полученные для протозойного фермента в открытой и закрытой конформациях, принадлежали к разным пространственным группам – P3₂21 и P12₁1 соответственно [7].

Работы в части кристаллизации белков проведены при поддержке РЦ МКБ НИЦ “Курчатовский институт”, в части определения каталитической активности белков и эффективности ингибиторов – при поддержке Министерства науки и высшего образования РФ в рамках выполнения работ по Государственному заданию ИБХ РАН (АААА-А19-119042690072-1); в части РСА на источнике SPring-8 – при поддержке Федерального космического агентства (проект КЭ (ЦР) “Кристаллизатор”); решение и уточнение структур проводили при частичной поддержке Министерства науки и высшего образования РФ в рамках выполнения работ по Государственному заданию ФНИЦ “Кристаллография и фотоника” РАН.