Кристаллография, 2021, T. 66, № 6, стр. 902-912

ВВЕДЕНИЕ

Воздействие лекарственных препаратов на основе пептидов можно считать наиболее специфичными как при взаимодействии с белками, так и при модулировании белок-белковых взаимодействий. Однако такие препараты могут как нарушать взаимодействия, лежащие в основе возникновения и развития каких-либо патологических состояний, так и приводить к возникновению способности белков к новым взаимодействиям [1], что может быть использовано в терапевтических целях. Белок-белковые взаимодействия лежат в основе большей части биологических процессов, включая комплексы структурных белков, регуляцию транскрипции, трансляции и репликации. В то же время изменение белок-белковых взаимодействий и возникновение способности белков к гомоолигомеризации являются причиной различных заболеваний, в том числе онкологических и нейродегенеративных [2].

Важным этапом при разработке лекарственных препаратов является выяснение их механизма действия [3]. При этом необходимо не только определить мишень и показать достаточную специфичность, но и доказать, что разрабатываемый препарат способен достичь, как минимум, в модельной системе той мишени, на которую он направлен.

В данной работе рассматривается противовирусный пептидный препарат (PB1_6–14), описанный в [4, 5]. Показано, что пептид PB1_6–14 способен воздействовать на N-концевой участок субъединицы PB1 полимеразного комплекса вируса гриппа А, вызывая изменение его конформации. Это приводит к нарушению структуры нативного полимеразного комплекса вируса гриппа, что, в свою очередь, делает невозможной репликацию вируса и обусловливает противовирусный эффект пептида [6, 7]. В контексте применения данного пептида в качестве активного компонента потенциального противовирусного препарата необходимо показать, что он способен проникать в клетки, а также установить механизм проникновения, поскольку репликация вируса гриппа и работа полимеразного комплекса происходит внутри инфицированной клетки.

Одним из барьеров, преодолеваемых данным пептидом на пути к белковой мишени, является плазматическая мембрана. Биологическая мембрана (БМ) – структурный элемент клетки, представляющий собой динамичную функциональную оболочку, которая отделяет клетку от внешней среды (а клеточные органеллы от цитоплазмы клетки) и осуществляет важные клеточные процессы. Основными компонентами БМ являются липиды (фосфолипиды, гликолипиды и др.), белки и холестерин, каждый из которых выполняет важную роль в биофизических и биохимических процессах. Поскольку фосфолипидный бислой – это структурная основа биологических мембран, то крайне важно понять не только механизм пептид-липидного взаимодействия, но и создать методические основы для изучения проникновения противовирусного пептида PB1_6–14 внутрь липидного бислоя.

На первом этапе изучения механизма взаимодействия пептида с липидными мембранами и его проникновения в клетку были использованы модельные однослойные липосомы, состоящие из нейтральных фосфолипидов ДМФХ, а также смеси ДПФХ и ДПФЭ (80/20), которые являются основными компонентами мембран млекопитающих [8]. Поскольку пептид PB1_6–14 имеет положительный заряд, для установления роли электростатического взаимодействия между пептидом и липидными мембранами использовали отрицательно заряженные фосфолипидные бислои ДМФХ/ДМФГ (70/30) [9].

Цель данного исследования – показать возможность проникновения пептида PB1_6–14 внутрь клеток, а также изучить механизм проникновения пептида PB1_6–14 через клеточную мембрану на модельной системе, используя методы проточной цитофлуориметриии, конфокальной микроскопии и малоуглового рассеяния нейтронов (МУРН).

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Материалы. Пептиды PB1_6–14 (Ac-TLLFLKVPA-NH₂) и FITC-PB1_6–14 (FITC-TLLFLKVPA-NH₂) были синтезированы в ООО “Пептидные технологии” (Санкт-Петербург, Россия). Чистота составила более 95%.

Клетки A549 (карциномы легкого человека) получены из коллекции ФГБУ “НИИ гриппа им. А.А. Смородинцева” Минздрава России. В экспериментах по проточной цитофлуориметрии использовали однодневный монослой клеток A549, выращенный в лунках шестилуночного планшета, каждая из которых содержала примерно 10⁶ клеток. Перед экспериментом клетки отмывали от бычьей эмбриональной сыворотки фосфатно-солевым буфером (ФСБ, Sigma). В экспериментах по конфокальной микроскопии использовали однодневный монослой клеток A549, выращенный в лунках 24-луночного планшета на круглых покровных стеклах (Menzel).

Для приготовления липосом использовали нейтральные фосфолипиды ДПФЭ (1,2-дипалмитоил-sn-глицеро-3-фосфадилэтаноламин), ДПФХ (1,2-дипалмитоил-sn-глицеро-3-фосфадилхолин), ДМФХ (1,2-димиристоил-sn-глицеро-3-фосфадилхолин) и отрицательно заряженные фосфолипиды ДМФГ (1,2-димиристоил-sn-глицеро-3-фосфоглицерин) производства Sigma-Aldrich (Merck).

Использовали ФСБ, приготовленный на дистиллированной (18.2 MΩ·cм, Merck Millipore) или дейтерированной воде (НИЦ «Курчатовский институт» – ПИЯФ) без или с добавлением дейтерированного этанола (этанол-d₆, Fluka AG, Buchs, Switzerland) и дейтерированного диметилсульфоксида (ДМСО-d₆, Sigma-Aldrich).

Проточная цитофлуориметрия. Сухой пептид PB1_6–14 был растворен в буфере 5% этанол/5% ДМСО (недейтерированные), разбавлен в 10 раз средой альфа-MEM (Биолот) без бычьей эмбриональной сыворотки до конечной концентрации 33 мкМ и добавлен к клеткам A549 (по 5 мл в каждую лунку). В контрольные лунки была внесена среда альфа-MEM без сыворотки, содержащая 0.5% этанол/0.5% ДМСО. Таким образом, количество молекул пептида, приходящееся на одну клетку, составило около 10¹². Пептид вносили в лунки шестилуночного планшета за 60, 30, 15, 5 и 1 мин до остановки эксперимента, после чего клетки инкубировали в течение соответствующего времени в СО₂-инкубаторе (в атмосфере 5%-ного CO₂) при температуре 37°С. Клетки A549 в лунках без добавления пептида (контрольные клетки) инкубировали в течение 60 мин. После двукратной отмывки ФСБ к клеткам добавили 300 мкл раствора трипсин-ЭДТА. Отмытые от трипсина клетки ресуспендировали в ФСБ и разделили на три аликвоты (технические повторы) до концентрации 0.5 × 10⁵ клеток/мл для проведения измерений на проточном цитофлуориметре.

Образцы анализировали с использованием проточного цитофлуориметра Navios (Beckman Coulter), оснащенного диодным лазером с длиной волны возбуждения 488 нм, для детектирования клеток, положительных по флуоресценции FITC. По диаграммам прямого и бокового рассеяния была определена популяция клеток А549, имеющих одинаковые размер и форму; в каждом образце проанализировано не менее 10⁵ клеток. Клетки, положительные по флуоресценции FITC, принимали за содержащие пептид. Математическое описание проводили с помощью программного обеспечения Navios Software v.1.2 и Kaluza v.1.2, Beckman Coulter. Данные визуализировали с использованием программного обеспечения Origin2015.

Конфокальная микроскопия. К клеткам A549 добавляли пептид FITC-PB1_6–14 до конечной концентрации 33 мкМ. После инкубации в течение 1 ч при 37°С, 5% CO₂, клетки отмывали ФСБ и фиксировали раствором 4%-ного параформальдегида в ФСБ. Препараты клеток заключали в раствор, препятствующий выгоранию флуоресцентного красителя (Mounting medium, Sigma, США), и исследовали с помощью лазерного сканирующего микроскопа Leica TSC SP8, оснащенного гибридным детектором с повышенной чувствительностью. Флуоресценцию FITC возбуждали при помощи аргонового лазера (488 нм) и регистрировали в области длины волн флуоресценции 510–550 нм. Использовали объектив 63×, получали изображение размером 1024 × 1024 пикселя. Съемку и обработку изображений проводили в программе Leica Application Suite X.

Малоугловое рассеяние нейтронов. Для приготовления липосом использовали фосфолипиды ДМФХ, ДПФХ, ДМФГ и ДМФЭ. Сухой липид ДМФХ (ФХ) или смеси липидов ДМФХ/ДМФГ (ФХ/ФГ) в соотношении 70/30, ДПФХ/ДПФЭ (ФХ/ФЭ) в соотношении 80/20 растворяли в ФСБ, приготовленном на D₂O (pD = 7.4). Концентрация липидов в буфере составляла 2 мас. %. Для гомогенизации раствора использовали шейкер. Однородный раствор мультислойных везикул (МСВ) был получен методом замораживания–оттаивания в диапазоне t = ±20°С от температуры главного фазового перехода (t_m) используемых липидов. Процедуру повторяли 6 раз. Однослойные везикулы (ОСВ) были приготовлены путем пропускания приготовленного раствора МСВ через поликарбонатные фильтры диаметром 50 нм с помощью экструдера (Hamilton Co., Reno, Nevada, USA) при температуре выше t_m. После 25 повторений получался стабильный раствор ОСВ.

Полученные липосомы смешивали в равных объемах с пептидом в концентрации 1 мг/мл, растворенном в смеси этанол-d₆/ДМСО-d₆/ФСБ. В качестве контроля использовали липосомы, к которым добавляли только растворитель. Конечная концентрация липида составляла 1 мас. %. В работе использовали два различных состава растворителя: конечная концентрация этанол-d₆/ДМСО-d₆ составляла 5%/5% (обозначены ФХ/ФГ_5-5, ФХ/ФЭ_5-5) либо 2.5%/2.5% (обозначены ФХ/ФГ_2-2). Для оценки влияния растворителя на полученные липосомы зарегистрировали спектры исходных липосом в ФСБ и спектры липосом, к которым был добавлен растворитель ДМСО-d₆/ФСБ или этанол-d₆/ДМСО-d₆/ФСБ.

Измерения проводили на высокопоточном реакторе ИБР-2, спектрометр ЮМО (ОИЯИ, г. Дубна, Россия), с использованием двух детекторов методом времени пролета [10, 11] в диапазоне переданного импульса 0.005–0.5 Å^–1. Первичную обработку экспериментальных данных проводили в программе SAS [12], позволяющей нормировать полученный спектр на независимый ванадиевый рассеиватель, вычитать данные фонового образца [13]. Образцы в кварцевых кюветах помещали в термостатический бокс. Измерения проводили 20 мин при 37°С для всех исследуемых систем.

В общем случае рассеяние от монодисперсных центросимметричных частиц имеет вид

где ${{I}_{0}} = n{{V}^{2}}{{(\Delta {{\rho }})}^{2}}$ – интенсивность рассеяния в нулевой угол, q – переданный импульс, n – объемная концентрация частиц c объемом V, ${{\Delta \rho }} = {{{{\rho }}}_{s}} - {{{{\bar {\rho }}}}_{m}}$ – контраст между плотностями длин рассеяния растворителя и липосом, $P(q) \equiv {{F}^{2}}(q)$ – квадрат форм-фактора, S(q) – структурный фактор, описывающий взаимодействие между частицами, bkg – остаточный некогерентный фон, имеющий место в эксперименте по рассеянию нейтронов. Для сильно разбавленных и слабо взаимодействующих между собой частиц, какими являются фосфолипидные ОСВ с массовой долей ≤2 мас. %, S(q) = 1 [14, 15]. В первом приближении ОСВ представляют собой полые сферы с оболочкой (липидный бислой), разделяющей внутреннюю и внешнюю среду. Таким образом, рассеяние на ОСВ будет описываться форм-фактором, нормированным на объем оболочки, сформированной липидным бислоем (V_b) [16]: где ϕ – объемная доля липидного бислоя, ${{V}_{{{\text{in}}}}}$ и ${{R}_{{{\text{in}}}}}$ – объем и радиус сферы, образованной растворителем внутри мембраны соответственно, ${{V}_{{v}}}$ и ${{R}_{{v}}}$ – объем и радиус ОСВ, ${{J}_{1}}$ – сферическая функция Бесселя первого порядка (${{J}_{1}} = ~({\text{sin}}(x) - x{\text{cos}}(x)){\text{/}}{{x}^{2}}$).

Структурные параметры ОСВ получены в результате аппроксимации экспериментальных спектров моделью (2) в программе SasView 4.2.2 [17].

Толщину липидного бислоя T определяли с точностью до 1 Å [18] с использованием приближения Кратки–Порода:

где радиус гирации ${{R}_{t}} = \sqrt { - \operatorname{tg} \alpha } $ при построении зависимости $\ln (I{{q}^{2}}){v}s{{q}^{2}}$, тогда

Атомно-силовая микроскопия (АСМ). Для исследования морфологии методом АСМ образцы готовили по стандартной методике [20]. Раствор исходного образца (50 мкл), приготовленного по процедуре, описанной в разделе МУРН, был разбавлен 3 мл ФСБ для уменьшения концентрации липосом в растворе. 50 мкл приготовленного образца помещали на свежерасщепленную подложку из слюды, инкубировали 3 мин для адсорбции везикул из раствора на поверхности слюды, после чего осторожно отмывали дистиллированной водой без воздействия на образец воздуха для удаления свободных липосом. Образцы высушивали при комнатной температуре в течение 1 ч. Измерения топографии поверхности образца и фазы проводили в полуконтактном режиме с использованием зонда NSG01 на атомно-силовом микроскопе NTEGRA PRIMA (NT-MDT Spectrum Instruments, Зеленоград, Россия). Обработку изображений и получение распределения частиц по размерам осуществляли в программе Image Analysis P9, версия 3.5 (NT-MDT Spectrum Instruments).

Измерение дзета-потенциала. Для определения стабильности исследуемых систем проводили измерение дзета-потенциала (ζ) на приборе Photocor (Фотокор, Россия). В кювету помещали 3 мл раствора, приготовленного, как описано для АСМ. Измерения проводили, как и в МУРН-эксперименте, при t = 37°С.

Метод определения ζ-потенциала основан на исследовании динамического рассеяния света в режиме измерения скорости потока. Скорость движения частиц в поле, рассчитанная из фазовой функции, позволяет определить электрофоретическую подвижность частиц, ${{{{\mu }}}_{E}} = {{\nu /}}E$, где ν – скорость движения заряженных частиц в электрическом поле с напряженностью E. Электрофоретическую подвижность частиц пересчитывали в ζ-потенциал, ζ, с использованием теории Смолуховского и применением поправок для различной толщины двойного электрического слоя по формуле

где ε – диэлектрическая проницаемость, η – вязкость среды.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Проникновение пептида PB1_6–14 в клетки. Перспектива применения пептидов, как и любого другого соединения-кандидата, в качестве лекарственного препарата определяется, в том числе, его способностью к проникновению в клетки, а также временными параметрами этого процесса. В качестве модельной системы для изучения транспорта пептида использовали клетки A549 (карциномы легкого человека) как наиболее адекватную модель для изучения функционирования вируса гриппа, поражающего именно эпителиальные клетки дыхательных путей [19]. Клетки инкубировали с FITC-меченым пептидом в условиях, описанных выше. Возможность использования FITC-меченого пептида как аналога не модифицированного была показана в [4] на клетках MDCK для малых концентраций пептида. Поскольку обе изучаемые формы пептида обладают сходной противовирусной активностью, то предполагается, что эффективность и механизм проникновения в клетки у них также аналогичны.

Временные и количественные параметры проникновения (относительное число клеток A549, положительно флуоресцирующих при длине волны возбуждения 488 нм, соответствующей FITC, через разные промежутки времени) оценивали методом проточной цитофлуориметрии. Динамика проникновения пептида в клетки представлена на рис. 1а.

По полученным данным можно сделать вывод, что пептид проникает в клетки между 5-й и 15-й минутами инкубации. Данный временной интервал является приемлемым для использования исследуемого пептида в дальнейшем в качестве лекарственно препарата.

Основываясь на результатах, полученных методом цитофлуориметрии, нельзя однозначно определить, проник ли пептид внутрь клеток или сорбировался на клеточных мембранах. В связи с этим проникновение пептида внутрь клеток подтверждали методом конфокальной микроскопии, регистрируя флуоресценцию FITC-меченого пептида на оптическом срезе, проходящем через ядро клетки. На рис. 1б представлены конфокальные изображения клеток A549, инкубировавшихся с пептидом в присутствии ДМСО и этанола.

Результаты эксперимента показали, что пептид, растворенный в оптимальной смеси 5% ДМСО и 5% этанола [5] и разбавленный до необходимой концентрации клеточной средой, способен не только проникать внутрь клеток в виде гранул (отмечено стрелкой 1 на рис. 1б), но и диффузно распределяться по их цитоплазме (отмечено стрелками 2, 3 на рис. 1б). Отметим, что клетки имеют форму, характерную для живых и нормально функционирующих клеток A549.

Таким образом показано, что пептид PB1_6–14 проникает в клетки A549 в присутствии ДМСО к 15-й минуте инкубации по данным проточной цитофлуориметрии и конфокальной микроскопии. При использовании растворителя 5% этанол/5% ДМСО клетки сохраняют характерную для живых нормально функционирующих клеток форму, что подтверждается данными конфокальной микроскопии.

Взаимодействие пептида PB1_6–14 с моделями клеточных мембран. Особенности механизма проникновения пептида PB1_6–14 через клеточную мембрану изучали с использованием модельной системы – однослойных мембранных везикул.

Взаимодействие пептида с мембраной включает три основных этапа [21]:

– в водном растворе амфифильные пептиды образуют спиральные структуры, чтобы “спрятать” свои гидрофобные сегменты внутрь и “столкнуться” с мембранами посредством диффузии, а также электростатического притяжения;

– после накопления вокруг мембран происходят конформационные изменения, вызванные гидрофобными взаимодействиями. Пептиды претерпевают конформационные изменения, экспонируют гидрофобные сегменты, за счет чего встраиваются в поверхность раздела двух липидных слоев;

– связанные пептиды выполняют свои биологические функции за счет кооперативного взаимодействия друг с другом и с мембранами. Следовательно, функции, индуцированные пептидами, существенным образом зависят от концентрации и физико-химических свойств пептида (структура, заряд, гидрофобность и др.), а также от липидного состава и свойств мембраны (заряда, модуля изгиба, модуля растяжения и др.).

На первом этапе работы было оценено влияние растворителя (2.5% этанол-d₆/2.5% ДМСО-d₆/ФСБ) на структуру модельных липосом ФХ/ФГ. Сначала к приготовленным липосомам добавляли только ДМСО-d₆ до конечной концентрации 2.5% и регистрировали спектр МУРН. Затем был получен спектр липосом в 2.5% этанол-d₆/2.5% ДМСО-d₆/ФСБ и в 5% этанол-d₆/5% ДМСО-d₆/ФСБ (рис. 2а). Изменение толщины липидного бислоя T (Å) оценивали из построения Кратки–Порода в координатах $\ln (I{{q}^{2}})\;{v}s\;{{q}^{2}}$ (рис. 2б). Толщина бислоя составила 36–38 Å и не зависела (в пределах погрешности) от растворителя, однако наблюдалась тенденция к уменьшению толщины везикул в растворах, содержащих одновременно этанол и ДМСО. При этом добавление только ДМСО не влияло на структурные параметры модельных мембран. Подобный результат был ожидаем, поскольку незначительное содержание ДМСО (до 20 мас. %) в растворе ДМСО/вода приводит лишь к изменению структуры свободной воды и частичной дегидратации липидного бислоя ФХ-липосом, и только при концентрации ДМСО более 40 мас. % молекулы ДМСО взаимодействуют непосредственно с поверхностью липидной мембраны [22], приводя к слипанию ОСВ с дальнейшим образованием МСВ [23, 24].

Влияние пептида PB1_6–14 на структуру липосом ФХ/ФГ изучали методом МУРН в двух растворителях: 2.5% этанол-d₆/2.5% ДМСО-d₆/ФСБ и 5% этанол-d₆/5% ДМСО-d₆/ФСБ (рис. 3а). Анализ толщины липидного бислоя проводили по построению Кратки–Порода (рис. 3б). Для ОСВ ДМФХ/ДМФГ в ФСБ Т* = 37.8 ± 0.9 Å, что с учетом коэффициента 1.15 (для липосом ДМФХ в воде в жидкокристаллической (ЖК) фазе) [25] составляет 43.47 Å. Это значение близко к 44.20 Å для ДМФХ-d54 в воде в ЖК-фазе [26] и отлично согласуется с толщиной липидного бислоя 44.60 Å, полученной для ДМФХ-d54/ДМФГ в отсутствие пептида в [27]. Отметим, что если в случае растворения пептида PB1_6–14 в 2.5% этанол-d₆/2.5% ДМСО-d₆/ФСБ, а также при добавлении буфера 5% этанол-d₆/5% ДМСО-d₆/ФСБ наблюдалась небольшая тенденция к уменьшению толщины липидного бислоя до ∼35.5 Å (табл. 1), то при добавлении пептида, растворенного в 5% этанол-d₆/5% ДМСО-d₆/ФСБ, наблюдалось значительное уменьшение толщины липидного бислоя (до 32.1 ± 0.7 Å). Данный эффект может быть связан как с увеличением растворимой реакционноспособной формы пептида (в растворителе, содержащем большую концентрацию этанола и ДМСО), так и со стабилизацией конформации пептида, способной к взаимодействию с мембраной.

Аналогичные данные относительно уменьшения толщины липидного бислоя модельных липосом ФХ/ФГ в присутствии пептида PB1_6–14, растворенного в 5% этанол-d₆/5% ДМСО-d₆/ФСБ, получены в результате аппроксимации спектров МУРН в программе SasView моделью “ядро–оболочка” (рис. 3а, сплошные линии). Заведомо заниженные значения толщин Т не анализировали, поскольку для корректного извлечения информации из нейтронного эксперимента необходимо использовать смесь ДМФХ-d54/ДМФГ совместно с частичной заменой D₂O на H₂O и применять модель, в которой гидрофобные и гидрофильные участки (головы и углеводородные хвосты) би-слоя рассматриваются как отдельные слои [27].

Тем не менее полученный результат свидетельствует об уменьшении толщины липидного бислоя в присутствии пептида, как и данные, извлеченные из построения Кратки–Порода. Кроме того, для данной системы (ФХ/ФГ_5-5_пеп) наблюдалось значительное увеличение радиуса липосомы с 250 до 285 Å (табл. 1, рис. 4). Отметим, что интенсивность рассеяния от чистого пептида PB1_6–14, растворенного в 5% этанол-d₆/5% ДМСО-d₆/ФСБ (рис. 5а), меньше на 2 порядка, чем интенсивность рассеяния от липосом, в связи с чем оно не может оказывать значительного влияния на итоговый спектр рассеяния. Таким образом, наблюдаемые увеличение радиуса и уменьшение толщины ОСВ ФХ/ФГ обусловлены влиянием пептида на структуру липосом.

Одним из возможных объяснений наблюдаемых структурных изменений ОСВ ФХ/ФГ могло бы быть предположение о встраивании пептида PB1_6–14 в липидный бислой, поскольку увеличение количества вещества в мембране приводит к увеличению внутреннего радиуса липосом. Однако высказанное предположение не может объяснить уменьшения толщины бислоя и требует более детального изучения.

Интересным является тот факт, что при добавлении пептида PB1_6–14 не наблюдалось изменений в спектрах МУРН модельных липосом ФХ/ФЭ и, следовательно, детектируемых изменений структуры липосом (рис. 5б): толщина бислоя, вычисленная по построению Кратки–Порода (врезка на рис. 5б), составила ∼42 Å для обеих систем. При аппроксимации кривых в программе SasView моделью “ядро–оболочка” параметры обеих систем также не различались в пределах погрешности: толщина бислоя составила 41.7 ± 0.3 и 41.6 ± 0.4 Å для липосом без пептида и с пептидом соответственно, а размер липосом составил 288.7 ± 4.5 и 282.3 ± 8.1 Å. Это указывает на различный характер пептид-липидного взаимодействия положительно заряженного пептида с липидными бислоями в зависимости от их состава, в частности от заряда мембранной поверхности и/или фазового состояния липидного бислоя. Следует предположить, что электростатические взаимодействия играют существенную роль в процессах адсорбции в случае взаимодействия пептида PB1_6–14 с нейтральными (ФХ/ФЭ) липосомами или встраивания пептида в липидный бислой в случае взаимодействия пептида PB1_6–14 с анионными (ФХ/ФГ) липосомами. Кроме того, при t = 37°С система ФХ/ФЭ (80/20) находится в гелевой $L_{{{\beta }}}^{'}$-фазе [28]. При этом углеводородные цепи менее подвижны, чем в случае системы ФХ/ФГ при той же температуре, что может создавать дополнительный “барьер” для проникновения пептида внутрь липосом.

Контроль возможных морфологических изменений при взаимодействии пептида с ОСВ ФХ/ФГ осуществлялся методом АСМ. Профили высот, представленные на рис. 6 для ОСВ ФХ/ФГ в ФСБ (а), в 5% этанол/5% ДМСО/ФСБ (б) и ОСВ ФХ/ФГ-PB1_6–14 в 5% этанол/5% ДМСО/ФСБ (в), явно свидетельствуют о сферической форме исследуемых объектов. Кроме того, полученные значения средних размеров наблюдаемых объектов, D_A, (табл. 2) из распределения числа частиц по размерам указывают на увеличение диаметра ОСВ при добавлении пептида, что хорошо согласуется с данными, полученными из аппроксимации кривых МУРН. Диаметры липосом, $D = 2(R + T)$, в ФСБ и 5% этанол/5% ДМСО/ФСБ равны 56.0 ± 0.6 и 57.3 ± 1.0 нм соответственно. Добавление пептида, растворенного в 5% этанол/5% ДМСО/ФСБ, к ОСВ ФХ/ФГ в ФСБ приводит к росту диаметра до 62.8 ± 0.5 нм.

Для выяснения роли электростатического взаимодействия в системе пептид–липид провели измерения ζ-потенциала для ОСВ, сформированных из нейтральных липидов ДМФХ, ДПФХ/ДПФЭ (80/20) и смеси нейтральных (ФХ) и отрицательно заряженных (ФГ) липидов ДМФХ/ДМФГ (70/30) при температуре 37°С, pH = 7.4. При добавлении положительно заряженного пептида к ОСВ, состоящего только из молекул ФХ, значение ζ изменялось незначительно: от –11.21(0.04) мВ для чистых липосом до –5.38(0.09) мВ, что может свидетельствовать о слабом пептид-липидном взаимодействии. В случае смешанной системы ФХ/ФЭ можно констатировать адсорбцию пептида на мембранной поверхности: ζ-потенциал меняет знак с отрицательного на положительный (ζ = –33.47(0.31) мВ для ФХ/ФЭ, ζ = +13.38(0.07) мВ для ФХ/ФЭ-PB1_6–14). ОСВ, состоящие из ФХ/ФГ, являются достаточно стабильной системой (ζ > ±30 мВ), как и в случае ФХ/ФЭ (табл. 3). Поскольку ζ-потенциал изменяется не существенно (табл. 2), то очевидно, что при взаимодействии пептида с мембранной поверхностью лишь небольшая часть пептида адсорбируется на поверхности мембран ФХ/ФГ, а большая часть встраивается в липидный бислой, как предполагали при анализе данных МУРН.

Наблюдаемый характер взаимодействия пептида с модельными липосомами может быть об-условлен сочетанием положительно заряженных аминокислотных остатков с гидрофобными, которые, с одной стороны, способны взаимодействовать с отрицательно заряженными головками фосфолипидов, а с другой – с гидрофобными хвостами.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Данные проточной цитофлуориметрии и конфокальной микроскопии указывают на то, что FITC-меченый аналог пептида проникает внутрь клеток. Ранее на основании только сходной противовирусной активности [4] было сделано предположение [6], что немеченый пептид PB1_6–14 проникает внутрь клеток аналогичным образом. В настоящей работе на модельной системе при помощи малоуглового рассеяния нейтронов показали, что немеченый пептид способен взаимодействовать с мембранами клеток и, вероятно, проходить через липидный бислой. Важным является тот факт, что проникновение пептида PB1_6–14 в мембрану определяется исключительно свойствами мембраны и растворителя, поскольку происходит в модельной системе без участия каких-либо клеточных факторов.

Наиболее перспективной для дальнейшего изучения является модельная система липосом ФХ/ФГ (70/30) в буфере 5% этанол-d₆/5% ДМСО-d₆, поскольку наблюдаемые изменения под действием пептида PB1_6–14 в этом случае наиболее значительные и приводят, в том числе, к существенному увеличению размера липосом. Для более комплексной характеристики транспорта пептида через мембрану следует использовать комбинацию методов МУРН, АСМ (для описания крупномасштабных перестроек, как, например, изменения размера липосом) и рефлектометрии (для получения информации о параметрах взаимодействия на более мелких масштабах, например, в каком конкретно участке липидного бислоя располагается пептид, какие надмолекулярные структуры образует и т.д.).

Использованная модельная система может быть также применена в качестве системы доставки лекарственных препаратов с возможностью контроля содержания препарата в носителе.

Работа частично поддержана государственным контрактом № 14.N08.11.0080: ФЦП “Развитие фармацевтической и медицинской промышленности Российской Федерации на период до 2020 года и дальнейшую перспективу” (эксперименты по проточной цитофлуориметрии и конфокальной микроскопии). Эксперименты по малоугловому рассеянию нейтронов выполнены на спектрометре ЮМО, реактор ИБР-2, ОИЯИ, г. Дубна (№ 2017-10-14-16-55-35, 2018-04-14-23-49-44). Измерения ζ-потенциала и АСМ проведены при финансовой поддержке гранта Полномочного представителя Румынии в ОИЯИ (приказ № 267, п. 17 от 20.05.2020).